第十三章紫外可见分光光度法.ppt
第十三章 紫外可见分光光度法,电磁辐射按其波长可分为不同区域。 射线 5140pm X射线 10-310nm 光学区 101000m 紫 外 10380nm 可见光 380780nm 红 外 0.781000m 微 波 0.1mm1m 无线光波 1m,光学分析法 的类型 光谱法 分子光谱、原子光谱 发射光谱、吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等 非光谱法,§1 基本原理,一、分子能级(量)与电磁辐射 二、光的性质 三、物质的颜色与光的关系 四、物质吸收光的定律,一、分子能级(量)与电磁辐射,分子的能量包括： 价电子能量（Ee） 120eV 分子内原子在平衡位置的振动能量（Ev） 0.0251eV 分子绕重心转动的能量（Er） 小于0.025eV E = Ee + Ev + Er 分子吸收光谱的特点：带状光谱,二 光的性质,单色光 ：只有一种波长的光 复合光 ：由两种及两种以上波长的光组成的 光 白光：红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光按一定比例混合而成 互补色光 ：两种颜色的光按这一比例混合也可得到白光,三、物质的颜色与光的关系,物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定 1. 全吸收 物质显示黑色，如金属粉末； 2. 全透射 物质显无色，如水、无色溶液、无色玻璃等； 3. 全反射 物质显示银白色，如银等金属； 4. 漫反射 物质显白色，如碳酸钠、氯化钠粉末； 5. 部分吸收部分透过 物质呈现吸收光的互补色。硫酸铜溶液吸收黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液则吸收绿光而呈紫红色。,四、物质吸收光的定律朗伯比耳定律,1、吸收曲线,2、朗伯比耳定律 设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液浓度为c，液层厚度为b，它们之间的定量关系表示为,当c的单位为g·L-1，b的单位为cm时，k称为吸收系数（absorption coefficient）以a表示。,若c的单位为mol·L-1，b的单位为cm，k称为摩尔吸光系数（molar absorption）以表示。,与a的关系为 =Ma,例13-1 浓度为5.0×10-4g·L-1的Cu2+溶液，用双环乙铜二胺显色后，于波长600nm处，以2.00cm比色皿测定透光度为50.1%，求吸光系数和摩尔吸光系数。 解：已知 T=50.1%，则 b=2.00cm c=5.00×10-4g·L-1 M(Cu2+)=64.0g·mol-1 则,3、偏离朗伯比耳定律的原因,物理原因：单色光不纯所致 化学原因 ：溶液浓度高于0.01mol·L-1 介质不均匀如呈胶体、乳浊、悬浮状 吸光微粒发生解离、缔合、互变异构等,§2 分光光度计及测定方法,光度分析按照使用的光源及仪器又可分为 目视比色法 光电比色法 分光光度法,一、分光光度计 1、分光光度计的基本构造,光源 单色光器 吸收池 检测器 显示器,光源（light source）： 钨灯（612V），产生3203200nm的连续光谱，其适宜的波长是3601000nm。 氢灯发射150400nm波长的光，适用于200400nm波长范围。 辅助设备 聚光透镜、稳压电源,单色器（monochromator）： 作用 复合光分解成按波长顺序排列的单色光 组成 入射狭缝、色散元件、准直镜。 色散元件类型 棱镜和光栅 棱镜材料 玻璃棱镜、石英棱镜 玻璃棱镜的色散波段在360700nm 石英棱镜的色散波段在2001000nm 光栅做色散元件的特点：工作波段范围宽、适用性强、对各种波长色散率几乎一致。,吸收池（absorption cell，比色皿）： 材料 无色光学玻璃、熔融石英 形状 长方形 规格 0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm 要求 相同规格的两个吸收池的透光度相差应小于0.5% 注意事项 保持透光面干燥、洁净，不可用手直接接触、不能磨擦透光面,检测器（detector）： 作用 透射光信号转换成电讯号。 要求 灵敏度高、响应时间短、响应的线性关系好等，不同波长的光具有相同响应 类型 光电管、光电倍增管 显示器（display）： 作用 显示和记录检测器的电信号 类型 微安表、数码显示管 标尺 透射比（T）、吸光度（A）,2、常用的分光光度计,分光光度计的类型 单波长、双波长。 单波长分光光度计又分为：单光束和双光束两种。 单波长单光束分光光度计 结构简单、使用方便，如 721型、751型,721型分光光度计 工作波长范围 360800nm 结构 光电管、晶体管放大线路和微电流表直读 特点 在可见光区灵敏度和稳定性比较好,751G型紫外可见分光光度计 适用波长范围 2001000nm,二、分光光度测定方法 标准曲线法,§3 显色反应及其影响因素,有色物质 在其最大吸收波长处，测量吸光度灵敏度高 无色或浅色物质 先显色后测定 显色反应的类型 螯合、氧化还原、生化,§3 显色反应及其影响因素,一、显色反应的要求 1、反应定量完成 2、选择性要好 3、灵敏度要高 4、有色物质稳定性好 二、显色反应条件的选择,二、显色反应条件的选择,1、显色剂的用量,2、溶液的酸度,3、显色时间 4、显色温度,§4 测量误差与条件的选择 一、读数误差,微分后得 变形,或T=36.8%,相对误差小于4%时 透光率 6515% 吸光度0.20.8,二、偏离吸收定律引起的误差,1. 单色光不纯的影响 2. 溶液的性质 3. 仪器误差 4、测量条件的选择 （1）入射光的波长 （2）吸光度范围 （3）参比溶液,§5 紫外可见分光光度法应用实例,一、单组分含量测定 二、多组分含量测定 三、配合物组成的测定 四、定性分析,一、单组分含量测定,定量方法：根据朗伯比耳定律关系式计算 标准曲线法 1、1,10-邻二氮菲法测定微量铁 显色剂 1,10-邻二氮菲是有机配位剂之一。 配位比 3:1 最大吸收波长=512nm 1.1×104L·mol-1·cm-1。 酸度范围 pH为39，醋酸缓冲溶液pH=4.55.0 还原剂 过量盐酸羟胺 测定铁含量 0.58g·mL-1,2、磷钼蓝法测定全磷 样品处理 浓硫酸或高氯酸 H3PO412(NH4)2MoO421HNO3(NH4)3PO4·12MoO312NH4NO312H2O 以还原剂如抗坏血还原酸磷钼黄杂多酸为磷钼蓝 最大吸收波长 660nm,3、土壤中氮含量的测定 （1）铵态氮 奈氏试剂处理 ，在490nm处测定线性范围为0.516g/mL （2）硝态氮 用酚二磺酸比色法在420nm下测定 ，线性范围0.059g·mL-1 4、谷物蛋白质的测定 5、植物样品中可溶性糖的测定 6、酶活性测定,二 多组分的测定,1、吸收峰互不重叠 2、吸收峰相互重叠,三、配合物组成的测定,1、摩尔比法 2、连续变化法,
