《基因工程》PPT课件.ppt

第四章 基因工程,一、基因工程诞生的背景 1、理论上的三大发现 40年代发现了遗传物质DNA 1944、T·Avery 肺炎双球菌的转化实验。 50年代搞清了遗传物质的分子机制1953年 Watson and Crick的DNA结构：双螺旋、半保留复制，1958年诺贝尔奖。 60年代确立了遗传信息的传递方式1961 美国尼伦堡(Ninenberg)确立遗传信息以密码形式传递：3=1=1 (3个核苷酸=1个密码子=1个Aa) 1966年破译了64个密码,诞生了“密码字典”。,2、技术上的三大发明 限制性内切酶的分离纯化 1970H· Smith 首次分离了型限制酶HindIII，1978年诺贝尔奖 基因克隆载体的应用 1973 Cohen 用作载体 逆转录酶的发现 1970 Baltimore and Temin同时发现 高速、超速离心技术 电泳技术 微量蛋白提纯技术 Aa顺序分析技术 基因合成技术 转化技术的建立 基因工程受体系统的发现,1973年, 美国斯坦福大学医学院遗传学家cohen完成了世界上第一个基因工程实验。,Tc、Ne平板筛选 表型：TcR NeR,转化,Cohen（科恩）模型,二、基因工程的诞生,三、基因工程的基本内容,将外源基因（又称目的基因，是一段 DNA 片断）组合到载体 DNA 分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增殖和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。,供体细胞,载体分子,外源DNA,外源基因,分离,酶切,酶切,连接,转化 扩增,DNA重组分子,受体细胞,鉴定与表达,重组转化子,工程菌 或细胞蛋白产物,工程菌或细胞培养,重组产物分离纯化,基因工程基本流程示意图,1、获得目的基因,化学合成法 将新的dNTP加到DNA链的5羟基末端。,限制性内切酶法(鸟枪法,散弹法) 用限制性内切酶降解染色体DNA,将降解的DNA片段克隆到载体上,从而获得目的基因。,基因文库：,把原核或真核生物细胞的染色体DNA切割一 定大小的片段（一般20kb)，将它们与合适的 载体（质粒，噬菌体）重新组合，转化或 感染受体细胞，得到一大群重组体（克隆） 在这一大群克隆中的每一个克隆中只含有基 因组内的一个片段。这样的克隆群体就象储 存有基因组内各种基因的仓库，故称基因文库。,印 迹 法,内切酶切开DNA,电泳,印迹转移,放射性探针 杂交,胶片显影,印迹法的主要步骤： （1）基因文库 DNA 用限制性内切酶处理。 （2）DNA 片断混合物通过电泳分离。 （3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。 （4）用已知小片断DNA 作为探针，互补结合需要找的基因片断。 （5）探针DNA 片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。,印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。 探针 DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N端 1520 个氨基酸序列，按三联密码转为 40-60 核苷酸序列，人工合成，即为探针 DNA 片断。,逆转录法获得真核生物目的基因 先分离纯化目的基因的mRNA，将其逆转录成单链的DNA,再经过DNA聚合酶的作用产生双链的DNA，从而获得目的基因。,2、目的基因的扩增,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction) 简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术，1984年美国Cetus公司的Kary Millis所发明。,反应体系的要求 引物、具有热稳定的酶、dNTP、目的DNA序列,PCR 反应分三步完成： 第一步 90 0 C 高温下，使混合物的DNA 片断因变性而成单链。 第二步 50 0 C 温度下，引物 DNA结合在适于配对的DNA片断上。 第三步 70 0 C 温度下，由合成酶（ DNA 高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因 DNA。,PCR 的三个步骤为一次循环，约需510 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。,P C R 操作流程,90 0 C,50 0 C,70 0 C,3、构造重组 DNA 分子,首先要用克隆载体。 质粒环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。 噬菌体DNA线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。 其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要限制性内切酶。,限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建,用质粒 构建 重组DNA分子,用噬菌体DNA构建 重组DNA分子,4、重组DNA分子导入受体细胞,把构造好的重组 DNA 分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是 动/植物细胞，通常称转染。,CaCl2处理的细菌转化法 物理学法电穿孔法 基因枪法 中间介导法农杆菌介导 微注射法,5、重组体的筛选,根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板上表型的变化来筛选重组子。 例如由于外源DNA的插入引起抗药性失活。,四、基因工程的应用,基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。,1.基因工程药物 将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞，使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。,基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,胰岛素 1000 磅牛胰 10 克胰岛素 200 升发酵液 10 克胰岛素,干扰素 1200 升人血 1 升发酵液 23 万美元 / 病人 200300 美元 / 病人,1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。 1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。 2002年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34。 2004年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。 2005年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。 全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。,国外生物医药的发展,国内生物医药的发展 起步晚，起点低，但发展迅速,1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物-重组人干扰素。 近年来我国生物制药业销售收入以平均超过20%的速度增长。,2.转基因植物,通过将目的基因导入农作物、园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子种淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性及改变植物的抗逆性等。 转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。 转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。,根癌杆菌介导法,世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。,1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。,甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。,油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。,玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。,我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。,从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。,转基因抗虫棉,1990年，美国利用生物技术，合成苏云金芽孢杆菌 （Bt）杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花。,借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物(transgenic animal)。,3.转基因动物,转基因动物首先在小鼠获得成功。,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,DNA微注射法,通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注 射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超 数排卵为35个； 与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵； 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位 点 ； 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。,DNA显微注射法的基本程序,中国科学院水生生物研究所朱作言首次用人的生长激素基因(hGH)构建了转基因鱼，制作的主要目的是提高生长速度、增加抗逆性以及为发育生物学和插入突变提供研究的材料。,转基因鱼,动物生物反应器 乳腺生物反应器:使外源基因在哺乳动物的乳腺组织（上皮细胞）中进行特异表达我们需要的蛋白产物； 血液生物反应器 细胞生物反应器,在山羊奶中生产ATT,4.基因治疗,基因治疗是将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。 一种为直接体内疗法（in vivo）： 即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞； 另一种为间接体内疗法（ex vivo）： 即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。,腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多，改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致免疫缺陷。,重症综合性免疫缺乏症（SCID）,第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH),治疗基本步骤:,遗传缺陷病人,取出病人細胞,腺病毒 adenovirus,插入修正基因,感染病人細胞,注射修正基因,修正基因,修正基因转入到患者体内,基因治疗的问题与危险性,有效的目的基因过少； 安全性:导入的基因缺乏调控手段； 有效性和稳定性：缺少高效和导向的载体系统； 目前人们多重视分子水平的研究而忽略了整体研究，对整体宏观水平缺乏了解。,1999年9月17日，美国Arizona州18岁的青年格尔辛格在宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所接受基因治疗4天后不幸死亡，成为基因治疗实施以来第1个直接死于这种试验的病人。,人类基因组计划 1990年正式启动。 美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。 计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组作图、精确测序，基因鉴定和功能分析，破译人类全部遗传信息 曼哈顿计划 阿波罗计划,20世纪科学史上3个里程碑,5. 人类基因组计划（HGP）,HGP的意义,了解生命的起源与进化 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 五种“模式生物” 基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠 解码生命，认识自身 了解生命体生长发育的规律 认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律 疾病的诊断和治疗,含 32亿碱基对(bp)的DNA序列 编码序列约占3%，非编码序列约占97%。 包括约34万个基因，分布于22条常染色体和 X、Y性染色体。,人类单倍体基因组,遗传图谱（连锁图谱，linkage map) 通过家谱分析和测量不同性状一起遗传（即连锁）的频率，将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图 单位：厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）；Mb水平的标记 作用 确定基因或DNA片断在染色体的定位 各基因或DNA片断的相对距离,1、遗传图谱,人类基因组研究方案及技术,2、物理图谱 - 路标与路轨,是通过对DNA的化学测度而绘制的，反映的是DNA序列上两点之间的实际距离。 目的：把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。 以碱基对的数目为衡量单位，精度在100kb水平,3 、序列图谱 - 重中之重,DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程 通过测序得到基因组的序列图谱。,4 、基因图谱 基因图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。,人类基因组测序完成,2003年4月14日，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿宣布基因组测序图已由美、英、日、德、法、中六国经13年努力完成,我国对人类基因组计划的贡献,1994年，我国HGP在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动； 最初由国家自然科学基金会和863高科技计划的支持下，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”； 1998年在上海成立了南方基因中心； 1999年在北京成立了北方人类基因组中心； 1999年7月在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1。 1999年11月12日：科技部、中科院、“863”计划生物领域专家委员会讨论决定“863”计划出资3000万元，中科院出资1000万元。,后基因组时代,结构基因组学向功能基因组学转变 研究基因表达、调控，以及在生长发育、疾病发生、药物反应等方面的作用 研究上： 系统研究：不是针对单个基因或蛋白，而是对一个细胞或个体内整个基因或蛋白质的研究； 组学研究：功能基因组、结构基因组、蛋白质组学 技术上：高通量基因、蛋白筛选与鉴定，基因敲除动物等 在基因的功能与利用上有望突破,