高产生物丁醇新菌株的筛选、鉴定及发酵研究.doc

高产生物丁醇新菌株的筛选、鉴定及发酵研究裴建新1，左文朴1，庞 浩1，张穗生1，黄志民1，黎贞崇1，黄日波1，2 （1.广西科学院 国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西 南宁 530007； 2.广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室，广西 南宁 530003）摘要：丁醇是具有巨大应用潜力的可再生能源。为了获得高效生产丁醇的菌株，通过玉米培养基富集、丁醇耐受筛选的方法，从自然环境（牛粪、沼气池和土壤）来源的60份样品中分离获得1株丁醇发酵比率高的新菌株，菌株命名为gxzp-13-2。经梯度浓度葡萄糖发酵试验表明，5%葡萄糖发酵丁醇产量较高，最高可达10.05 g/L，总溶剂达到13.95 g/L，丁醇比约为72.1%，转化率为31.8 %。对此菌株进行了分子鉴定，经16S rDNA基因序列同源性分析表明，gxzp-13-2与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）的同源性最高，相似性高达98%。gxzp-13-2在厌氧固体培养基上生长，菌落显紫色。该菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础，也为丁醇发酵提供了宝贵的菌种资源。关键词：拜氏梭菌；生物丁醇；鉴定；发酵Screening and Identification of a Novel Strains for Producing butanol PEI Jian-xin1，ZUO Wen-pu1，PANG Hao1，ZHANG Sui-sheng1，HUANG Zhi-min1，LI Zhen-chong1，HUANG Ri-bo1, 2（1. National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery，Guangxi Academy of Science， Nanning 530007，China；2. Key Laboratory of Microbial and Plant Genetic Engineering of Ministry of Education，Guangxi University，Nanning 530003， China）Abstract: Butanol has great potential to be renewable sources of energy. In order to obtain efficient strains of producing butanol, one purple bacterial colony was screened by enriching on corn medium and selecting tolerant of butanol from 60 samples，which were got from cow dung, methanetank and soil. The new strain could effectively produce butanol，which was named as gxzp-13-2. The results of fermentation by different concentration of glucose showed: the yield of butanol fermented by 5% of glucose were the highest, reached 10.05g/L, the total solvent, rate of butanol and conversion of which were 13.95 g/L, 72.1 % and 31.8 % respectively. It had the highest homology with Clostridium beijerinckii through 16S rDNA sequence analysis，and their similarity reached 94%. When gxzp-13-2 grew on anaerobic medium，it appeared purple. This new strain could not only provide basis for alternating genes of strains for further study, but also provide valuable stains resource for fermentation butanol. Key words: Clostridium beijerinckii；biobutanol；identification；fermentation0 引言由于丁醇的能量密度高，亲水性低，蒸汽压低，辛烷值高等特点，被认为是最有发展潜力的新型液体燃料之一1。传统的丁醇生产方法主要是以石油为原料经过羰基合成或醇醛缩合而成2。近年来随着石油资源的日益枯竭，价格不断攀升，以生物质为原料发酵生产丁醇的工艺重新受到了全球的广泛关注3。 制约生物法发酵丁醇的主要因素是发酵醪中发酵产物含量过低，导致丁醇生产需要大体积的发酵过程以及繁杂和耗能的后提取工艺4。这个因素造成丁醇发酵法生产的成本居高不下，针对这个问题，主要采取以下两种方法来改进：一是通过菌株的改良来提高菌株的丁醇单位发酵能力，从而提高发酵液中的丁醇含量；二是通过改造发酵产物提取设备，将发酵产物不断从发酵醪分离出来以提高平衡浓度57。 目前发现的丁醇产量较高的微生物都是来自于梭菌属的，主要有Clostridium acetobutylicum，Clostridium beijerinckii，Clostridium saccharoperbutylacetonicum和Clostridium sacchabutylicum等，但未见有菌落呈紫色并高产丁醇菌株的相关报道8。本研究从自然界分离筛选获得一株菌落呈紫色、丁醇产量较高的新菌株。经16S rDNA基因序列分析，初步鉴定为Clostridium beijerinckii。1 材料与方法1.1材料 1.1.1样品采集 采集南宁市郊区沼气池发酵液、牛粪和土壤为试验样本。1.1.2培养基玉米醪培养基（用于厌氧菌培养）： 玉米粉60 g，刃天青0.3 g，蒸馏水1 000 mL。配制时将以上成份充分混合，自然pH值，加热10 min成糊状，分装于30 mL的试管中，胶塞密封，121 高压灭菌20 min。筛选培养基（RCM梭菌专用培养基）：葡萄糖5 g，淀粉1 g，酵母粉3 g，蛋白胨10 g，乙酸钠3 g，氯化钠3 g，半胱氨酸0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 高压灭菌20 min。灭菌后加0.8 %丁醇。分离培养基（用于Hungate滚管分离单菌落）：葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5，121 高压灭菌20 min。发酵培养基（TYA培养基9）： 40 g葡萄糖，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5，121高压灭菌20 min。1.1.3酶和化学试剂试验所用Taq聚合酶、PMD18-T vector、dNTP Mixture等均为TaKaRa公司产品，质粒提取试剂盒、小量PCR产物试剂盒购自天根生化公司。其它试剂均为分析纯。1.2 筛选方法1.2.1富集培养取1 g样品放入30 mL玉米培养基的试管中，在沸水锅中热激90 s，用水冷却后置于37 厌氧箱富集培养72 h，挑选有大量气泡和醪盖生成的培养液进行气相色谱分析检测。 1.2.2丁醇耐性筛选将有丁醇生成的发酵液转接到含0.8 %丁醇的RCM培养基中，置于37 厌氧箱培养48 h，观察生产情况。1.2.3分离纯化 取能耐0.8 %丁醇的培养液在厌氧培养箱里梯度稀释到10-8，利用Hungate滚管技术方法分离单菌落。挑取单菌落于TYA培养基的试管中，放置于37 厌氧箱发酵72 h，用气相色谱分析法检测产物，并用15 %甘油保存菌种于-80 冰箱。1.3 利用不同浓度葡萄糖发酵丁醇的研究将筛选获得生产丁醇的菌株用不同浓度的葡萄糖测试发酵性能试验10。取甘油保存的菌株接入TYA培养基中80 热激10 min，冷却后置37 厌氧箱培养活化20 h，然后转接到TYA培养基中培养到OD600为1左右作为种子液。按10 %接种量将种子液转到不同浓度葡萄糖发酵培养基中，在37 静止发酵72 h后进行产物分析11。1.4 发酵产物分析及残糖测定用Agilent6890气相色谱仪测定产物。色谱条件：色谱柱：phenomen ZB-WAXplus；检测器：FID（220 ）进样量为0.2 L；进样口压力：116.66kPa；柱箱温度：100 ；氢气流量：30 mL/min。以正丙醇为内标进行定量分析。残糖测定采用DNS法12。 1.5 菌株的分子鉴定提取菌株的总DNA作为PCR模板，利用细菌16S rDNA基因通用引物扩增得到菌株的16S rDNA基因序列13，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段长度与产量，PCR产物纯化并连接pMD18-T 载体后测序，测序委托上海鼎安生物科技有限公司完成。测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对分析。应用MEGA4.1生物软件构建系统进化树。16S rDNA引物序列：16s-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'；16s-R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增程序：94 预变性3 min，94 变性1 min，56 复性1 min，72 延伸2 min，进行30个循环，72 延伸10 min。2 结果与分析2.1菌株的筛选本研究从60个样品中用玉米培养基富集和丁醇耐性筛选分离纯化获得8株生产丁醇较高的菌株，其中1菌株菌落呈紫色。TYA培养基发酵产物如表1所示。表1分离菌株TYA培养基发酵生产丁醇、丙酮和乙醇 Table 1 Production of acetone, butanol and ethanol by the isolates with glucose菌株丙酮(g/L)乙醇(g/L)丁醇(g/L)总容剂 ABE(g/L)丁醇比例(%)残糖(%)12-62.930.858.1811.9168.74.7112-71.164.317.9613.4359.33.0913-11.473.388.4113.2663.44.1113-22.171.028.1311.3271.8 5.8214-21.842.928.5713.3364.35.5614-62.370.957.9011.2270.413.9515-73.521.367.1312.0159.49.0815-91.583.048.2512.8764.111.262.2 16S rDNA序列比对及构建进化树用Blast在线软件对gxzp-13-2菌株的16S rDNA序列测序结果进行相似性分析，与拜氏梭菌的16S rDNA具有98 %的同源性，此菌株初步鉴定为Clostridium beijerinckii。16S rDNA序列构建的系统进化树如图1所示。 图 1 gxzp-13-2菌株的系统发育树Fig. 1The phylogenetic tree of gxzp-13-2 starins2.3 gxzp-13-2菌株的菌落形态经TYA培养基厌氧培养，gxzp-13-2菌株表面菌落不规则，扁平、边缘不齐、半透明、紫色、有光泽。Clostridium beijerinckii 8052表面菌落不规则，圆形、突起、边缘完整、半透明、灰白色、有光泽。 图 2 gxzp-13-2（左）和拜氏梭菌（右）的菌落形态Fig. 2 Bacterial colony of gxzp-13-2（left）and Clostridium beijerinckii 8052（right）2.4 gxzp-13-2发酵试验的研究结果 不同浓度葡萄糖发酵产物气相色谱检测分析结果如表2所示。表2菌株gxzp-13-2发酵葡萄糖生产丁醇、丙酮和乙醇 Table 2 Production of acetone，butanol and ethanol by the isolate with glucose 不同葡萄糖浓度(%)丙酮(g/L)乙醇(g/L)丁醇(g/L)总容剂 ABE(g/L)丁醇比例(%) 转化率 (%)20.770.464.675.9079.133.631.471.216.649.3271.233.142.110.907.5810.5971.6 32.752.781.1210.0513.9572.1 31.861.260.236.868.3582.125.8不同浓度葡萄糖发酵试验结果表明，菌株gxzp-13-2在5%葡萄糖培养基中发酵效率较高，丁醇产量最高可达10.05 g/L，总溶剂13.95 g/L，丁醇占总溶剂的比例达72.1 %，转化率为31.8 %。3讨论传统的生物丁醇发酵菌株的产物中，丁醇的比例只为60%（丁醇/乙醇/丙酮：6/3/1），寻找具有高丁醇发酵比例的菌株有助于降低发酵后提取蒸馏过程的能耗，从而降低丁醇发酵的成本。本研究经过菌株富集和丁醇耐性筛选获得一株高丁醇比例的新型菌株gxzp-13-2。不同浓度葡萄糖发酵试验表明，在5%葡萄糖培养基中发酵生产丁醇效率较高，丁醇产量最高可达10.05 g/L，丁醇的比例达到72.1%。进一步提高葡萄糖的浓度，则丁醇的比例可以达到82.1%，但在这个葡萄糖的浓度下，转化率不高。经16S rDNA基因序列分析鉴定表明，gxzp-13-2菌株为Clostridium beijerinckii。由于Clostridium beijerinckii原料谱和适宜p范围较广，所以受到很多科学家的关注。目前，研究发酵生产丁醇菌株较多的是Blaschek H P在1991年利用N-甲基-N亚硝基胍诱变Clostridium beijerinckii 8052获得的突变菌株Clostridium beijerinckii BA101。此菌株经诱变丁醇产量由9 g/L提高到18.6 g/L，并可以在简单、廉价的培养基中较好地生长，适于工业应用14。2008年，Qureshi研究Clostridium beijerinckii 260可直接发酵小麦秸秆，水解液总溶剂可达16.59 g/L 15。而gxzp-13-2与已知的拜氏梭菌的16S rDNA具有98 %的同源性，而菌落形态明显区别于典型的拜氏梭菌菌株。gxzp-13-2菌株产生紫色色素，这个特性在梭菌属中是非常少见的。说明gxzp-13-2是一个来源于拜氏梭菌的新种。本研究筛选获得的gxzp-13-2菌株产生的色素性质还有待进一步研究。这个菌株的丁醇产量高，比例高，具有开发和应用的潜力。 参考文献：1 LEE S Y，PARK J H，JANG S H，et a1. 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