黄曲霉素M1试剂盒说明书1.doc

黄曲霉素M1 ELISA检测试剂盒 1、 概述黄曲霉素是霉菌的产物，高毒性并致癌。黄曲霉素M1不是微生物而是在动物体中由黄曲霉素B1转化形成的。当奶牛食用有黄曲霉素B1污染的饲料后，通过消化和分泌，黄曲霉素就会转化为羟基化的黄曲霉素M1，绝大部分分泌到乳汁中。因此，黄曲霉素M1浓度反映了饲料中黄曲霉素B1的含量。欧盟对奶中的黄曲霉素M1限量是0.05ppb（50ppt）。用竞争酶联免疫分析法检测生物样本中的黄曲霉素M1。所有酶联免疫分析的试剂包括标准品都由试剂盒提供。检测数量：96孔（含标准品孔）检测时间：20分钟2、 原理分析在包被有黄曲霉素M1抗体的聚苯乙烯微孔中进行。黄曲霉素M1标准溶液和样品加入微孔，在温浴过程中，游离的黄曲霉素M1分子与抗体结合，没有结合的物质在清洗步骤中被清洗，第二次温浴时已经加入HRP-黄曲霉素M1酶标物，它将没有结合的抗体位点全部覆盖。通过加入基底物质可以确定酶活性，第三次温浴时酶将无色的显色剂转变成一种蓝色，加入终止液使蓝色变成黄色，用酶标仪在450nm测定吸光度，通过颜色深浅不同换算成黄曲霉素M1的浓度值。3、 应用范围黄曲霉素M1ELISA试剂盒用于定量检测牛奶和奶酪中的黄曲霉素M1。4、 提供的试剂 1、微孔板：96孔（12×8，可拆卸） 2、酶标物：冻干粉一瓶3、酶标物稀释液：13ml一瓶4、样品稀释液：一瓶（使用时加入40mL双蒸水充分溶解后使用）5、清洗液（10×）：50ml一瓶6、显色剂：13ml一瓶7、终止液：13ml一瓶8、黄曲霉素M1标准品溶液：6×1ml/瓶（0ng/mL，0.005ng/mL，0.03ng/mL，0.15ng/mL，0.5ng/mL， 2ng/mL）5、 试剂盒未提供的材料1、10-1000 ul不同规格的微量移液器2、50-300ul多道移液器3、酶标仪（有450nm滤光片）4、离心机（如果离心速度低最好使用低温离心机）5、带盖试管6、涡旋振荡器7、正己烷8、二氯甲烷9、离心管10、去离子蒸馏水6、 试剂贮存1、试剂盒贮存在28，切勿冰冻2、未用完的微孔板反应该密封干燥28保存7、 注意事项 1、终止液具有刺激性，显色剂具有毒性，切勿接触皮肤2、试剂盒过期后不得使用3、请勿混用不同批号的试剂8、 工作溶液准备1、酶标物工作液：使用时精确加入12mL酶标物溶解液充分溶解，使用前恢复至室温，并且摇匀，切勿涡旋振荡。2、样品稀释液工作液：使用时加入40ml双蒸水充分溶解后使用。3、清洗液：用蒸馏水1:10稀释（19）。注意：如有结晶请在室温下摇动彻底溶解4、显色剂：已备用，请避免光线直照5、终止液：已备用6、黄曲霉毒素M1标准品：已备用9、 样品处理一、牛奶1、样品冷藏，28下3000g离心10分钟2、分离奶脂和奶清3、奶清直接检测（稀释倍数：1倍）二、奶粉1、称取奶粉1g加10ml蒸馏水2、振荡使奶粉彻底溶化后取50ul用于检测3、稀释倍数：10 三、奶酪 1、不要另加液体捣碎样本 2、称取2g碎奶酪放入带盖试管 3、加入15ml二氯甲烷振摇抽提30分钟 4、过滤上清液 5、转移3.75ml抽提液到另一试管，60下氮气吹干 6、用750ul样品稀释液重新溶解并涡旋混匀1分钟 7、加入750ul正己烷，涡旋抽提1分钟 8、2000g离心15分钟 9、移去上层正己烷 10、取50ul甲醇/ acqueous相，用200ul样品稀释液在小试管中稀释后混匀取50ul用于检测 稀释倍数：210、 检测步骤一、实验须知1、使用前用2小时左右时间让试剂恢复到室温2、用后立即将试剂放回283、不要改变分析步骤，尤其：- 微孔板在2025下恢复到室温- 务必使用精确的微量进样器和枪头- 一旦开始就不要中断所有步骤- ELISA结果的可重复性极大程度的取决于洗板操作，请严格按照要求操作4、为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的枪头加样5、加样时请勿让枪头接触微孔中的溶液或内表面二、分析步骤1、做好记录，标记B0，标准和样本的位置，请确保重复双孔检测2、从反应板上取出所需要的数量微孔，将多余的重新放回28保存3、将酶标物（冻干粉）、清洗液（10X）配制成工作液- 在B0孔中加入50L已稀释的样品稀释液- 在各标准孔中加入50L的标准品溶液- 在各样品孔中加入50L样品溶液4、所有微孔加100ul酶标物工作液（强烈要求使用多道移液器）5、轻轻晃动反应板几秒钟6、室温（2025）温浴10分钟，温浴期间振荡混匀34次三、清洗步骤- 倾倒微孔中的液体- 在所有微孔中加满洗涤液（250300L）- 重复上述两步骤3遍以上- 在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡（拍打后未被清除的气泡可用吸耳球吹去）拍干后立即进行下一步骤，切勿让微孔干燥 四、显色步骤1、用多通道微量移液器在所有微孔中加入100ul显色剂（强烈推荐使用多道移液器），振摇混匀几秒钟，使之彻底混匀。2、室温显色10分钟3、加入100ul终止液（强烈推荐使用多道移液器），混匀。4、450nm测定吸光度。10分钟内读取结果最佳，30分钟内有效11、结果计算根据下列公式进行结合率的计算(%)×100 = 标准（或样品）的吸光度 B 零标准的吸光度 B0 然后根据结合率在标准曲线上获得相应的浓度值。12、 特异性物质交叉反应黄曲霉素M1100 %黄曲霉素 M23 %黄曲霉素 B12.8 %黄曲霉素 B2<0.1 %黄曲霉素 G1<0.1 %黄曲霉素 G2<0.1 %13、 试剂盒参数本试剂盒灵敏度IC50值：0.030.06ng/ml。B0吸光度最佳值应大于0.8。试剂盒吸光度板内误差小于7，板间误差小于10。不同奶样最低检测限：0.08ug/kg奶羊回收率大于80%14、 标准曲线模式试剂盒提供的标准线范围为0.005-2ppb15、 结果评价结果出来以后应该对实验进行校正，校正方法是通过对比试验数据和试剂盒参数来进行的，如果各项参数超出范围，建议对试剂盒有效期，波长范围和操作步骤进行核查，如果都没有差错，请联系我们的技术人员。注意：本方法属于初筛方法，样本阳性（根据欧盟法律浓度高于50ppt）确定方法必须是LC/MS/MS或者GC/MS。Bioxl Diagnostic Systems,Inc2814,Brigadoon Dr.#21Raleigh，NC27606 USATel：（001）919-771-8720