2动物学——龙文敏-0601-2.doc

山西大学2009届硕士研究生学位论文蝗虫肠道菌群结构的分子生态学研究作者姓名龙文敏指导教师马恩波 教授学科专业动物学研究方向分子进化与分子毒理学培养单位生命科学与技术学院学习年限2006年9月2009年7月本研究得到国家自然科学基金（No. 30570247）、国家自然科学基金（No. 30770239）、山西省自然基金（No. 2009011048）的资助 二OO九年六月 5Molecular ecological studies of the gut microbiota communities structure of the grasshopperA DissertationSubmitted to the Faculty ofShanxi UniversityIn Partial Fulfillment of the Requirementsfor Degree of Master inZoologySchool of life Science and TechnologyStudent NameLong WenminSuperviserProf. Ma EnboMajorZoologyField of ResearchMolecular evolution and MoleculartoxicologyDepartmentCollege of Life Science and TechnologyResearch Duration2006.9-2009.7This dissertation was supported by grants from the National natural Science Foundation of China (No.30570247, No. 30770239), Natural Foundation of Shanxi (No.2009011048). 51目录目 录中 文 摘 要IABSTRACTIII第一章 前 言11.1 昆虫肠道微生物研究概况11.1.1 昆虫肠道共生菌分布的研究11.1.2 昆虫肠道共生菌功能的研究11.1.3 昆虫肠道微生物多样性的研究21.2 蝗虫肠道微生物研究概况41.2.1 蝗虫肠道微生物群落结构多样性研究41.2.2 蝗虫肠道微生物功能的研究51.3 肠道微生物研究方法51.3.1 依赖培养的分析方法51.3.2 不依赖培养的分子分析方法61. 4 本研究的目的和意义9第二章 基于RCR-DGGE指纹图谱的分子生态学研究技术建立分析蝗虫肠道微生物群落结构的DNA提取方法112.1 材料与方法112.1.1 供试东亚飞蝗的采集及饲养112.1.2 两种肠道微生物总DNA的提取方法112.1.3 DNA检测及稀释122.1.4 肠道细菌16S rRNA基因的扩增122.1.5 肠道细菌组成的DGGE指纹图谱132.1.6 变性梯度凝胶电泳的数字化分析132.1.7 肠道微生物总DNA得率和群落结构的统计学分析132.2 结果142.2.1 Q法与B法提取DNA质量的比较142.2.2 PCR扩增结果152.2.3 DGGE电泳图谱162.3 讨论17第三章 天津东亚飞蝗不同肠段微生物群落结构分析213.1 材料和方法213.1.1 供试样本213.1.2 蝗虫肠道微生物总DNA的提取213.1.3 肠道微生物优势细菌的扩增213.1.4 不同肠段中细菌组成的DGGE指纹图谱213.1.5 变性梯度凝胶电泳的数字化分析及群落结构的统计学分析213.1.6 多变量统计分析技术223.1.7 PCR-DGGE凝胶回收与测序243.2 结果243.2.1 东亚飞蝗不同肠段微生物总DNA的提取质量比较243.2.2 东亚飞蝗不同肠段微生物16S rRNA基因V3片段的扩增253.2.3 东亚飞蝗不同肠段微生物群落结构变化规律研究253.3 讨论25第四章 天津东亚飞蝗不同性别个体肠道微生物群落结构的比较研究314.1 材料和方法314.1.1 供试样本314.1.2 蝗虫肠道微生物总DNA的提取314.1.3 肠道微生物优势细菌的扩增314.1.4 不同肠段中细菌组成的DGGE指纹图谱314.1.5 变性梯度凝胶电泳的数字化分析及群落结构的统计学分析314.1.6 多变量统计分析314.1.7 PCR-DGGE凝胶回收与测序314.1.8 雌雄个体后肠样本的T-RFLP324.2 结果334.2.1 不同性别东亚飞蝗在各肠段上微生物群落结构DGGE分析334.2.2 DGGE图谱中优势条带割胶回收及测序354.2.3 不同性别东亚飞蝗后肠微生物群落结构T-RFLP分析354.3 讨论38参考文献41硕士期间发表的论文49致谢51ContentContentAbstract in chineseIAbstract in EnglishIIIChapter 1 Introduction11.1 Survey of intestinal microorganisms in insect11.1.1 Distribution of gut microbial symbiosis11.1.2 The function of intestinal microbial symbiosis11.1.3 The study of gut bacterial diversity21.2 Survey of intestinal microorganisms in locust and grasshopper41.2.1 The study of gut bacterial diversity41.2.2 The funtion of intestinal microorganisms51.3 The introduction of research method for intestinal microorganisms51.3.1 Analytical methods relying on cultivation51.3.2 Analytical methods relying on cultivation61.4 Purpose and significance of this research9Chapter 2 Comparison of bacterial genomic DNA extracted methods from grasshopper guts basic on RCR-DGGE fingerprint112.1 Materials and methods112.1.1 The collection and breeding of Locusta migratoria manilensis and Calliptamus abbreviatus112.1.2 The two genomic DNA extracted methods112.1.3 The detection of genomic DNA and dillution122.1.4 The amplification of 16S rRNA gene of intestinal microorganisms122.1.5 The DGGE fingerprint of intestinal microorganisms132.1.6 The image digitization of DGGE132.1.7 The statistical analysis of yeilds and communities of intestinal microorganisms132.2 Results142.2.1 The comparison of genomic DNA qualities extracted by QIAamp stool mini kit and Beadbeating142.2.2 The results of PCR amplification 152.2.3 The image of DGGE162.3 Discussion17Chapter 3 The analysis of intestinal microorganisms in each region of the gut of Locusta migratoria manilensis collected from Tianjing21 3.1 Materials and methods213.1.1 Locusta migratoria manilensis213.1.2 The extraction of total gut microbial genomic DNA213.1.3 PCR amplification of gut microorganisms213.1.4 DGGE results of microbial communities in different regions of the gut213.1.5 The image digitization of DGGE and statistic analysis of the microbial communites213.1.6 multivariate statistical analysis223.1.7 Sequencing and analysis of excised PCR-DGGE bands233.2 Results243.2.1 The comparison of qutities of excised DNA243.2.2 The PCR amplification of 16S rRNA gene253.2.3 The image of PCR-DGGE and multivariate statistical analysis253.3 Discussion257Chapter 4 The comparison of intestinal microorganisms in male and female adults in each region of the gut314.1 Materials and methods314.1.1 Locusta migratoria manilensis314.1.2 The extraction of microbial genomic DNA314.1.3 The PCR amplification of intestinal microorganisms314.1.4 The images of DGGE in different regions of the gut314.1.5 The image digitization of DGGE and statistic analysis of the microb communites314.1.6 multivariate statistical analysis314.1.7 Sequencing and analysis of excised PCR-DGGE bands314.1.8 The T-RFLP analysis of the microbial communities in hindgut324.2 Results334.2.1 The comparison of microbial communities between male and female adults in each region of the gut basic on DGGE analysis334.2.2 Sequencing and analysis of excised DGGE bands354.2.3 The comparison of microbial communities between male and female adults in each region of the gut basic on T-RFLP analysis354.3 Discussion38Reference41Published articles49Acknowledgement51中文摘要中 文 摘 要蝗虫是世界性的农业害虫，在我国分布范围广、种群数量大。20世纪90年代以来，受异常气候及生态环境恶化等因素的影响，我国蝗虫的发生逐年加重，以东亚飞蝗为主的蝗灾发生面积扩大，暴发频率提高，对我国农业生产构成严重威胁。东亚飞蝗（Locust migratoria manilensis（Meyen）属直翅目（Orthoptera）、斑翅蝗科（Oedipodidae）、飞蝗属（Locusta Linnaeus），是蝗虫类群中为害较大的一种。昆虫肠道内定植着大量的微生物，这些微生物对宿主有着各种各样的作用，可为宿主提供营养物质、参与解毒、协助消化；还有一些昆虫的肠道微生物与生物信息素的分泌有关。本文通过研究分析东亚飞蝗的肠道菌群结构，为探讨蝗虫肠道微生物对蝗虫的生理功能和生态学意义奠定基础，为进一步了解蝗虫与其共生菌的协同进化、物种进化途径提供新的认识，为蝗虫的防治提供新的思路和途径。本研究首先采用Bead beating法（B法）和QIAamp DNA stool mini kit法（Q法）提取蝗虫肠道微生物总DNA，并对两种方法所提取DNA的得率、完整性以及16S rRNA基因扩增产物的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）图谱进行综合比较。结果表明，B法提取DNA的得率显著高于Q法，而Q法提取DNA片段更完整。PCR-DGGE检测肠道微生物多样性结果显示，Q法提取DNA所代表的微生物群落多样性略高于B法，但统计学检验表明用这两种方法检测到的蝗虫肠道微生物多样性无显著差异，因此，两种方法均适用于蝗虫肠道微生物总DNA的提取。在后续研究过程中，均采用B法对蝗虫肠道微生物总DNA进行提取。本研究运用16S rRNA基因片段序列分析结合PCR-DGGE分析的技术比较研究了东亚飞蝗成虫肠道不同肠段，前肠、中肠和后肠微生物群落结构的多态性。PCR-DGGE图谱的条带数目的统计学分析结果及PCR-DGGE图谱的主成分分析（Principal Components Analysis, PCA）结果显示，前肠具有较高的微生物群落多样性；前肠微生物群落结构显著区别于中肠和后肠，中肠与后肠的微生物群落结构相似。PCR-DGGE图谱显示，中肠与后肠内定植有稳定的优势微生物类群，而与前肠有所不同。将东亚飞蝗前肠、中肠和后肠的微生物群落结构的PCR-DGGE图谱中优势条带进行割胶测序。在GenBank中进行序列比对后发现，东亚飞蝗肠道中优势微生物的类型主要为肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属。本研究还运用同样的分析技术比较了东亚飞蝗前肠、中肠和后肠每个肠段水平上雌雄虫体肠道内微生物群落结构的差异。结果表明：雌雄虫体前肠的微生物群落结构没有显著的差别；到中肠，开始出现差异的趋势；到后肠，雌雄个体的微生物群落结构呈现出明显差异。对于PCR-DGGE方法检测出的雌雄虫体后肠微生物组成上的差异，本研究还运用了末端标记-限制性片段长度多态性（T-RFLP）方法进行了验证。以雌雄虫体后肠微生物总DNA为模板，扩增带有荧光标记的16S rRNA基因片段，酶切后进行T-RFLP检测以及PCA分析，结果同样表明，在后肠，微生物群落结构存在性别上的差异。由此推断，后肠微生物与宿主的关系更近。关键词：东亚飞蝗；肠道微生物；分子多态性；DGGE；T-RFLPABSTRACTABSTRACTThe locust, a worldwide pest, is very harmful to the agricultural production. It distributes widely and vastly. Since 1990s, the locust, mainly the Locusta migratoria manilensis (Meyen), has occurred more and more frequently and largely in our country. The harmful effect of it has seriously threatened our countrys agricultural production. Locusta migratoria manilensis (Meyen), which is in Locusta Linnaeus, Oedipodidae, Orthoptera, is a main kind of agricultural pest. The insect host and the microbiota harbored in the host build up a whole superorganism. The indigenous gut bacteria play many kinds of roles to host, such as, in the nutritional contributions and withstanding the colonization of the gut by non-indigenous species. In this study, the bacterial communities in the gut of locust adults were analyzed using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of amplified 16S rRNA genes. In the first part of the study, the effectiveness of two DNA extraction methods, bead beading and QIAamp DNA stool mini kit, were compared for isolation of the total microbial DNA from grasshopper hindguts. The two methods were evaluated comprehensively for their yields, purity and readiness for subsequent analysis by polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) of the bacterial communities. The results showed that the hindgut DNA yield of bead beating method was significantly higher than that of QIAamp DNA stool mini kit method, while the QIAamp DNA stool mini kit method produced DNA with bigger size and higher purity. In PCR-DGGE analysis, Mann-Whitley test showed that DNA extracted with the two methods had similar diversity. In the second part of this research, we studied the bacterial communitites in different regions of the gut, foregut, midgut and hindgut. Principal Components Analysis and t-test were used to analyze the microbial structure of the gut. The results showed that much more bands were detected in the foregut, and the microbial communities also quite different between foregut and mid-/hind- gut. In the midgut and hindgut, the host harbored reduced and stable microbial communities. 16S rRNA gene sequences from the selected DGGE bands from the guts of Locusta had a high sequence identity (96100% identity) to known, culturable bacterial species. The significant proportion of locust guts bacterial sequences identity to bacterial 16S rRNA sequences of Enterococcus sp., Klebsiella sp., Weissella sp., and Lactococcus sp.Likewise, the microbial structure of males and females in each region of the gut was also discussed. In the foregut, there were no significant differences between the microbial communities of males and females. In the midgut, a separate trend was detected. Finally, significant differences appeared.To confirm the differences of microbial communities detected in the locusta hindgut, the Terminal Restriction Fragment Length polymorphism was also be used to analyze the microbial communities of locusta hindgut. At the same with the results of DGGE analysis, there also were differences between males and females. As a result, we conclude that the there may be a more close corelationships between host and microbiota harbored in the locust hindgut. Key words: Locust migratoria manilensis (Meyen) ；Gut microbiota； microbial diversity；Denatured gradient gel electrophoresis (DGGE); Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)第一章 前言第一章 前 言1.1昆虫肠道微生物研究概况 昆虫肠道内定植着大量的微生物，它们与宿主的关系多种多样，有病原菌也有互利共生菌，对宿主有着重要影响1。自上世纪中期开始，有许多研究学者对昆虫肠道微生物进行了研究2，但随着研究的深入，发现昆虫肠道内大多数微生物是不可培养的，因此在传统培养条件的限制下，肠道微生物研究无法深入。然而随着近年来分子生物学的快速发展，产生了不依赖于体外培养的分子生态学研究方法，使得昆虫肠道微生物的研究再度成为热点3。1.1.1 昆虫肠道共生菌分布的研究早期昆虫相关微生物的研究主要集中在内共生菌上。共生菌在昆虫体内的位置和形式因昆虫的种类和微生物的类型不同而异，可分为肠道共生菌、脂肪体共生菌和其他部位共生菌。对于肠道共生菌，可共生于某些真核生物如原虫的肠腔中, 也可共生于昆虫寄主的肠上皮细胞内。还有一些微生物可共生于昆虫的脂肪体中，如飞虱的类酵母菌即存在于脂肪体内，并会在寄主脂肪体细胞中形成菌胞4-6。昆虫体内共生微生物按照存在部位的不同可以归为细胞外共生物和细胞内共生物。细胞外共生物多存在于昆虫的消化道内，白蚁后肠中定植着大量微生物，其中鞭毛虫对低等白蚁消化含有木质纤维素的植物有很大帮助，若经处理使鞭毛虫消失后继续喂食白蚁，两周后白蚁就会死亡7。细胞内共生物多分布于昆虫的胃盲囊、中肠、后肠、马氏管细胞和脂肪体细胞中。几乎所有昆虫体内都含有内共生微生物，在昆虫体内普遍存在的细菌称为初级共生菌，它们生活在含菌胞中，与宿主共同进化。蚜虫体内的Buchunera即存在于所有蚜虫腹部的含菌胞（mycetocytes或bacteriocytes）的胞质中，由一层来自宿主细胞的膜包裹8。1.1.2 昆虫肠道共生菌功能的研究昆虫与共生菌有着密切的共生关系，昆虫为共生菌提供稳定的微环境和营养，而共生菌为昆虫宿主合成食物中所缺乏的某些营养成分。酵母类内共生菌可以为宿主提供脂肪酸、固醇、维生素B等营养物质；Buchnera是蚜虫体内中重要的初级内共生菌，可以为宿主提供其摄食和代谢中缺乏的必需氨基酸，对宿主维生素的合成有着重要意义9；有些蚜虫体内的共生菌能够为其提供分解植物细胞壁的酶和必需的营养物质等，如桃蚜(Myzus Persicae)体内的共生菌能固定空气中的氮，将其合成为甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等必需氨基酸10；褐飞虱内共生菌含有高活性的尿酸酶，能够将宿主体内的尿酸转化为必需氨基酸11；聚集在褐飞虱腹部脂肪体细胞内的共生菌还能为其合成胚胎和胚后发育所需的蛋白质，促进胚胎腹节分化；飞虱体内的共生酵母菌还可为其提供脂类营养12。昆虫体内共生菌能协助昆虫消化特殊的食物。鞭毛虫是低等木食性白蚁肠道里普遍存在的原生动物，它们能够分泌纤维素酶，帮助宿主消化木材食物中的纤维素成分，使之水解并发酵为乙酸、二氧化碳和氢13，为白蚁提供所需养料。昆虫体内共生菌参与解毒作用。微生物可以通过矿化作用或共代谢，使高等有机体对有毒物质进行解毒。有些昆虫肠道共生菌能介入昆虫肠道帮助分解有机物与矿物化；还有些昆虫的肠道共生细菌能产生抗真菌活性物质抵抗病原真菌14。共生蚜虫中的细菌可以循环利用体内代谢废弃的氨，从而使得氨浓度下降，起到氨解毒作用15。昆虫体内共生菌还会参与昆虫生殖活动的调控。研究表明，Wolbachia对宿主的生殖有重要的调控作用，主要表现为诱导胞质不亲合(cytoplasmic incompatibility，Cl)、诱导孤雌生殖(parthenogenesis inducing，pl)、诱导雌性化(feminizing)和杀雄(male-killing)等16。1.1.3 昆虫肠道微生物多样性的研究昆虫种类丰富，其肠道结构多种多样，因此肠道微生物也非常丰富，但是关于昆虫肠道微生物整体结构研究的报道尚不多见，所涵盖的昆虫种类也比较有限，且报道多数是基于传统的培养方法，但由于该法受限于培养条件，因此培养所得到的微生物并不能完全客观的反映肠道内微生物组成和结构的真实情况。分子生态学技术的应用，大大推进了该研究的发展。白蚁肠道微生物区系是研究较多的昆虫肠道系统。1976年，Thayer等人用培养方法从白蚁后肠分离到了能降解木质素的兼性厌氧菌Bacillus cereus，Arthrobacter，Alcaligenes，Serratia 17。1980年，Bignell等人用扫描隧道显微镜观察了土壤中以土壤为食的白蚁肠道内微生物的分布情况，发现前肠、中肠的微生物主要是为一些丝状菌，推测为放线菌，其数量远远高于土壤内放线菌的数量18。1996年，Ohkuma等人运用克隆16S rRNA基因文库的方法分析了白蚁肠道内微生物的组成，发现白蚁肠道内既有已知可培养的细菌，也有在数据库中找不到任何同源序列的新菌， 其主要的菌属类型有4个大类：Proteobacteria，Spirochete group，Bacteroides group和低G+C含量的革兰氏阳性菌19。1998年，Kudo等人在白蚁肠道内发现有固氮能力和硝酸还原能力的细菌20；同年，Leadbetter等人在白蚁肠道内发现甲烷合成菌的存在21。2005年，Hideo等人以微生物培养观察结合DGGE检测的方法，对不同食物喂食一个月后白蚁Coptotermes formosanus. C.后肠微生物组成和结构进行了监测，发现后肠微生物组成发生了变化，并由此影响了白蚁肠道内纤维素酶的活性22。研究结果表明白蚁肠道内优势菌的类型因白蚁种类的不同而异，主要有拟杆菌门Bacteriodes、厚壁菌门Firmicutes、螺旋体门Spirochaetes及变形菌门Proteobacteria的细菌23,24。还有一些研究人员研究分析了另外一些昆虫种类的肠道微生物的组成和结构。鳞翅目昆虫舞毒蛾Lymantria dispar、棉铃虫Helicoverpa armigera 、家蚕Bombyx mori 中肠的优势菌主要有厚壁菌门，肠球菌属Enterococcus 及变形菌门的细菌25-27。直翅目中沙漠蝗Serratia marcescens中肠的优势菌主要为变形菌门、肠杆菌属Enterobacter 细菌28。直翅目蟋蟀后肠中拟杆菌门所占比例最大29。膜翅目中一种蜂的肠道优势菌主要来自变形菌门和厚壁菌门30 。半翅目中点蜂缘椿象Riptortus clavatus后肠腔内的绝对优势菌为变形菌门、伯克氏菌属Burkholderia细菌31；半翅目中另一种椿象的肠道共生优势菌也属于变形菌门32。鞘翅目中大栗鳃角金龟Melolontha melolontha 肠道优势菌属于梭菌目33 ；而鞘翅目中光肩星天牛Anoplophora glabripennis肠道优势菌则主要为变形菌门和厚壁菌门细菌，此外还有放线菌门和拟杆菌门细菌；另外一种天牛Saperda vestita肠道菌几乎全部属于变形菌门34。从以上研究可见，肠道微生物组成和结构因昆虫种类不同而异，具有宿主特异性。在所研究的昆虫中，变形菌门基本属于一类常驻菌，这表明变形菌门细菌普遍于昆虫肠道中。另外还有一些昆虫的肠道微生物区系得到一定程度的深入研究。1997年，Gilliam等人研究发现蜜蜂肠道内的微生物类型较为丰富，有细菌、酵母和霉菌35。1998年，Domingo等人研究了弹尾目昆虫Folsomia Candid肠道微生物菌群结构发现，其肠道内存在一个特殊的微生物群体，能将非本土的微生物清除36。同年，Hoffmann等人从这种昆虫的肠道内分离到了26种可培养的细菌37，揭示了弹尾目昆虫肠道内存在较为丰富的微生物区系。2003年，Reeson等人对黄蜂幼虫肠道微生物进行了PCR-DGGE分析，结果显示DGGE图谱随季节、不同蜂窝和不同居住地均有变化，表明黄蜂并不依赖于某一特定的微生物区系，其中一些DGGE条带的测序结果表明，与Lactococcus，Lactobacillus，Leuconostoc及Rickettsiella grylli亲缘关系较近，这项研究首次将PCR-DGGE技术应用于昆虫肠道微生物的分析中，证实了DGGE在研究昆虫肠道微生物方面的广阔应用前景30。1.2 蝗虫肠道微生物研究概况1.2.1蝗虫肠道微生物群落结构多样性研究早期，对于蝗虫肠道微生物的研究主要以培养的方法进行。1959年Bucher和Stephens花了5年的时间分析了采集自加拿大西部多个种类的蝗虫，共发现67种微生物，包括A型和B型阴沟肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、短杆菌属和肠球菌属等。其中，迁徙蝗虫肠道微生物多样性高于其他种类蝗虫2。1966年Hunt和Charnley研究了实验室养殖沙漠蝗Schistocerca gregaria肠道微生物，分离到大肠杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和成团泛菌等类型38。1988年Mead等人比较研究了实验室养殖条件下血黑蝗（Melanoplus sanguinipes）不同肠段的微生物群落结构，发现中肠和后肠中定植着大量的微生物，主要以肠球菌、肠杆菌（尤其是成团泛菌）、假单胞菌、沙雷氏菌属等为优势菌属；与野生种群血黑蝗的肠道微生物多样性相比，实验室养殖的血黑蝗所检测到的微生物多样性低于野生血黑蝗，这可能是由所检测样本量较小、食性和环境等因素不同所致39。2007年刘玉升等人对野生种群东亚飞蝗的雌、雄成虫肠道微生物进行了分离、纯化和培养，共获得16个属的菌株，对菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应等检测结果显示它们分别属于沙雷氏菌属Serratia、短状杆菌属Brachybacterium、预研菌属Yokenella、肠杆菌属Penterobacter、微杆菌属Microbacterium、柠檬酸杆菌属Citrobacter、类芽胞杆菌属Pae