大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析PPT课件.ppt

大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析,主要内容,研究背景与意义 技术路线 结果与分析 结论 致谢语,研究背景与意义,大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属,又名黄花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，也是福建省的主要养殖种类。,随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋严重，给养殖业造成了巨大的经济损失，阻碍了大黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的侵袭是一个很好的途径。,1、Rac蛋白是小分子GTP结合蛋白Ras超家族中最大的亚家族。 2、Rac在囊泡运输中发挥着调节作用。 3、近来发现, Rac与细胞的吞噬作用有关，是一种免疫相关因子，本实验期望克隆大黄鱼Rac基因序列，为以后进一步研究与分析奠定基础。,技术路线,结果及分析,1、肌肉总RNA的提取结果,图1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总RNA,RNA条带清晰，表明RNA无明显降解， 可用于逆转录cDNA。,在200-300bp之间有一条明显条带而阴性对照未扩增出条带，证明反转录反应成功，cDNA模板可用。,2、cDNA模板检测结果,图2 通过扩增-actin基因检测cDNA M：DNA Marker； 1：特异性扩增； 2：以水做模板的阴性对照,M 1 2,图3 凝胶电泳检测保守区扩增产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：特异性扩增,可看到一条约530bp的条带，条带较清晰，而阴性对照无条带。表明扩增得到的条带可能就是所需条带，将琼脂糖块回收做后续实验。,3、保守区扩增结果,M 1 2,产物回收,产物与载体的连接,转化,初筛重组子,图4 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2:以PCR产物为模板的阳性对照； 3-6：菌落PCR,4、PCR筛选克隆子结果,M 1 2 3 4 5 6,随机挑4个克隆子均含有约530bp的目的条带，都为阳性克隆,5、 3RACE第一轮PCR结果,图6 凝胶电泳检测3RACE第一轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第一轮反应产物；,第一轮扩增得到一条较亮的1100bp左右的条带，阴性对照无条带.,6、3RACE第二轮PCR,图7 凝胶电泳检测3RACE第二轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第二轮产物,第二轮扩增得到一条大小介于250-500bp之间的条带，与目的条带预期大小基本相符，阴性对照无条带，表明该片段可能就是所需片段，将琼脂糖块回收做后续实验。,7、3RACE克隆产物的鉴定结果,图8 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：第二轮PCR产物为阳性对照； 3-4：菌落PCR扩增产物,两个菌落均含有目的条带,8、 5RACE第一轮PCR结果,图10 凝胶电泳检测5RACE第一轮反应产物 M：DNA Marker； 1：第一轮反应产物； 2：阴性对照,第一轮扩增产生100-400bp的拖带，但还没有明显条带,9、5RACE第二轮PCR 结果,图11 凝胶电泳检测5RACE第二轮反应产物 M：DNA Marker； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：第二轮PCR产物,经第二轮扩增,在300bp左右处有特异性条带出现并且阴性对照无条带,产物回收,产物与载体的连接,转化,初筛重组子,10、 5RACE克隆产物的鉴定,图12 凝胶电泳检测菌落PCR产物 M：DNA ladder； 1：以水作为模板的阴性对照； 2：以第二轮PCR产物为阳性对照； 3-5：菌落PCR扩增产物,3个菌落均含有目的条带,图14 Rac基因部分序列及由此推测的氨基酸序列 图中阴影部分是编码区； 下划线标注为终止密码TAA； 方框中是加尾信号AATAAA,获得的片段大小为1272bp，其中包含的编码区579bp，编码193个氨基酸。5端非编码区长80bp 3端非编码区长613bp，具有脊椎动物典型的加尾信号AATAA和poly A尾巴,结论,本实验根据其它动物Rac基因序列设计简并引物，通过RTPCR和RACE方法扩增出大黄鱼Rac基因cDNA全长1272bp,其中编码区（ORF）为579bp,编码193个氨基酸。,致谢语,感谢韩芳老师在整个毕业论文设计过程中给予的悉心指导，感谢她对我孜孜不倦的教诲！ 同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！,