12基因工程的基本操作程序.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序,步骤一：目的基因的获取,目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所需要转移或改造的基因。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗逆性相关的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,从已有的物种中分离 人工方法合成,从基因文库获得,1、从基因文库中获取目的基因,基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库(gene library)。 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库 （cDNA文库）,外显子,内含子,原核生物基因,真核生物基因,内含子,外显子,真核生物cDNA文库与的区别基因组文库,小,大,无,有,无,有,某种生物部分基因,某种生物全部基因,可以,部分基因可以,2、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,循环（重复）,使目的基因短时间内成百万倍地扩增,PCR技术的原理：DNA复制(体外),过程：变性 退火 延伸,（解链为单链） （冷却） （子链合成）,条件： 引物（2种）； 模板:DNA的两条链； 四种脱氧核苷酸； 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。,多次重复,PCR技术与DNA体内复制的区别：,需要,需要,常温条件、解旋酶、ATP,高温条件（9095）,DNA解旋酶、DNA聚合酶、,耐高温的Taq酶,体内（细胞内）,体外,练习有关PCR技术的说法，不正确的是( ） APCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 BPCR技术的原理是DNA双链复制 C利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA,（1）催化过程的酶是_ 。 （2）过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达9095时才能完成，说明DNA分子具有_性。 （3）由图中信息分析可知，催化过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是_ 。 （4）如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶_个。,反转录酶（或逆转录酶）,练习：1970年，特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：,稳定,DNA聚合酶,催化过程的酶耐高温,60,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,3. 通过DNA合成仪化学方法直接人工合成,（基因比较小、核苷酸序列又已知）,步骤二：基因表达载体的构建（核心内容）,（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 （2）用同一种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的基因重组的过程。,步骤二：基因表达载体的构建（核心内容）,获取目的基因,DNA连接酶,重组DNA,1. 表达载体的构建过程,质粒,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的基因重组的过程。,步骤二：基因表达载体的构建（核心内容）,2. 表达载体的组成,启动子：,+,目的基因：,+,终止子：,标记基因：,+,是 的结合位点， 驱动 过程。,RNA聚合酶,转录,终止 过程。,转录,有目的基因的受体细胞。,鉴定和筛选,编码人类所需的蛋白质, 使生物表达相应性状.,复制原点：,启动复制,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,基因表达载体的组成 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,思考:,1. 上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗？,都是DNA,2. 终止子和终止密码的化学成分是否一致？,终止子DNA, 终止转录; 终止密码RNA上，终止翻译.,3. 图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。,据图回答： （1）将含有目的基因的DNA与质粒该表达载体分别 用EcoRI酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由 两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进 行 . （2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,目的基因目的基因连接物,分离纯化,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,练习. 图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。,（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。 （4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶 是 。,EcoRI和BamHI,启动子,mRNA,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,转化： 指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,1.将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法：感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力； （2）基因枪法：常用于单子叶植物； （3）花粉管通道法：转基因抗虫棉。,（2）基因枪法：常用于单子叶植物；,花的结构示意图,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱头,花药,花丝,雄蕊,雌蕊,（花冠）,（3）花粉管通道法：转基因抗虫棉。,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术： 利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。,3.将目的基因导入微生物细胞,导入大肠杆菌的方法: 首先用Ca2+ 处理细胞，以增大细菌细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态感受态细胞。 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。,显微注射技术,提纯基因表达载体,采用氯化钙来改变其通透性是为了制感受态细胞，原理是，用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。,蔡信之微生物学181页，两种理论都是假说，1、局部原生质化，也就是细胞壁上出现孔，2、好像还涉及细胞表面的转化因子（分子量5000-1-0000）的蛋白质的形成和细胞表面受体结合的转运问题。,刘祖洞得遗传书下册，174页，用钙离子处理使细胞膜上出现漏隙，DNA容易进入。,目前常用的对原核细胞的转化方法有两类：电穿孔转化法、化学转化法。电穿孔转化法属于物理方法，不需要对细胞进行特殊处理，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。化学转化法是利用低温（0）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence），此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。重组DNA与Ca2+形成的羟基-磷酸钙复合物黏附于菌体表面，经42短暂的热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞。然后在营养丰富的的培养基上生长1小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。,体外重组的DNA分子，需按一定的方式导入宿主细胞，通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。,大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）及转化,细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为15-30nm。主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以（1-4）糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。 肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。革兰氏阳性菌细胞壁厚约2080nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。此外，外膜与细胞之间还有间隙。 肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成。 细菌细胞壁的功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤（革兰氏阳性菌的细胞壁能耐受20kg/cm2的压力）；介导细胞间相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。 脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低。,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性。,步骤四：目的基因的检测与鉴定,2、分子水平的检测 检测是否插入了目的基因 检测是否转录出了mRNA 检测是否翻译成蛋白质 3、个体生物学水平的检测 做抗虫或抗病的接种实验,抗原-抗体杂交,DNA分子杂交技术,DNA-RNA分子杂交技术,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,报告基因（含荧光素分子）,变性,DNA杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后，就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成,复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法,DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术,分子检测外的个体水平鉴定,1.以下说法正确的是 （ ） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.质粒是基因工程中唯一的运载体 C.运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D.基因控制的性状都能在后代表现出来 2.有关基因工程的叙述中，错误的是 （ ） A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B.限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C.目的基因须由运载体导入受体细胞 D.人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶,C,练习,A,3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因 C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因,C,D,4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ ） A.能复制 B.有多个限制酶切点 C.具有标记基因 D.它是环状DNA 5.有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A.限制酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 6.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A.人工合成目的基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,D,C,1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,寻根问底：,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,寻根问底 （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,