3章12节核酸的结构与功能.ppt
第三章 核酸的结构与功能,第一节、核酸的结构,第二节、核酸理化性质,第三节、真核生物的染色体 及其组装,一、 核酸的组份,基本结构单位：核苷酸（碱基、戊糖和磷酸） 碱基：尿嘧啶（Uracil, U） 胸腺嘧啶(Thymine, T) 胞嘧啶(Cytosine, C) 腺嘌呤(Ademine, A） 鸟嘌呤（Guanine, G） 次黄嘌呤、稀有碱基 DNA：A、T、G、C RNA：A、U、G、C 戊糖：核糖（RNA）、脱氧核糖（DNA）,第一节、核酸的结构,Comparisons of names of bases, nucleosides and nucleotides,Purine: A (deoxy)-ribose,Nitrogenous bases,Bicyclic purines:,Monocyclic pyrimidine:,Thymine (T) is 5-methyluracil (U),核苷：戊糖的半缩醛羟基与碱基中的氢失水缩合成N-糖苷键而形成核苷， 核苷酸：核苷的5-位羟基与磷酸通过酯键形成5-核苷酸，不同的核苷酸用碱基第一个字母来命名。 嘌呤和嘧啶：都是含氮杂环化合物，弱碱性，难溶于中性水溶液。杂环上的氮等参与氢键的形成。,Adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine,R,Ribose or,2-deoxyribose,Nucleosides,In nucleic acids, the bases are covalently attached to the 1 position of a pentose sugar （戊糖）ring, to form a nucleoside,Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond (糖苷键),Nucleotides,A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3-, 5, or ( in ribonucleotides only) the 2-position. In the case of 5-position, up to three phosphates may be attached.,Deoxynucleotides (deoxyribose containing),Ribonucleotides (ribose containing),Phosphate diester bonds,二、多核苷酸链,结构：由核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连成的线型分子。 骨架：由磷酸和2-脱氧核糖构成，碱基为侧链 规定：多核苷酸链以连接于5-羟基的磷酸开始，以脱氧核糖的3-羟基终止。 表示：pGpCpApT或pGCTA。,Phosphodiester bonds,DNA/RNA sequence: From 5 end to 3 end Example: 5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA,3 end: free hydroxyl (-OH) group,5end: not always has attached phosphate groups,三、DNA的双螺旋结构,1953年Watson-Crick发表DNA双螺旋模型之前，人们已经取得的结果：,1、Chargaff(1949)证实不同物种DNA中A=T，G=C，A+G=T+C，物种之间DNA的不同在于（A+T）：（G+C）的比例不同。,2、 MH Wilkins制作了高质量的DNA x-衍射图像，根据该图可推测DNA的分子结构和原子间距，但Wilkins并未对该图做出DNA为双螺旋结构的推论。,伦琴拍的第一张X射线图，1901年诺贝尔奖第一次颁发就给他,用了1年半的时间拼出了双螺旋模型,伦敦威尔金斯（Maurice Wilkins）、富兰克林（Rosalind Elsie Franklin）X射线衍射法做出的DNA晶体结构；三人获1962年诺贝尔物理奖,DNA双螺旋模型特征：,1、 DNA分子是由两条多核苷酸链围绕一个中心轴盘绕而成，两条链方向相反，一条为5-3，另一条为3-5。,2、两条链为右手螺旋。,3 、脱氧核糖和磷酸构成双螺旋的主链、亲水，4种碱基的排列顺序因物种不同而不同，位于双螺旋的内部，疏水，导致DNA形成右手螺旋，二条多核苷酸链依靠碱基的氢键联系。每个螺旋含10个碱基，螺距34 Å，相邻碱基对的间距为3.4 Å。,4、双螺旋中，A与T配对二个氢键，G与C配对三个氢键,5 、相邻的二个碱基对不在同一位置（由于脱氧核糖中连接碱基的C并不正好处在螺旋的相对位置上），使二条链与中心轴的间距不同，在DNA双螺旋的表面形成大沟和小沟，酶等大分子自大沟进入，进行复制，调控等,DNA double helix,Two separate strands Antiparellel (53 direction) Complementary (sequence) Base pairing: hydrogen bonding that holds two strands together,Essential for replicating DNA and transcribing RNA,Sugar-phosphate backbones (negatively charged): outside Planar bases (stack one above the other): inside,中关村环岛的雕塑-DNA双螺旋,Base pairing via hydrogen bonds,Double helix B form: Right-handed 10 base pairs/turn 34 Å /turn Diameter: ca. 20 Å Other forms: A: 11 bases/turn, base plate 20° slant Z: 12 bases/turn, left-handed helical, one groove,C1 Nucleic Acid Structure,四、DNA双螺旋结构的多态性,1、 A-DNA和B-DNA,溶液中天然DNA多为B型，离体时使B型DNA脱水，可变为A型。 体内DNA-RNA、RNA-RNA双螺旋是 A型，这种现象称为DNA结构的多态性（polymorphism） ，B-DNA是基本构象，最稳定。,DNA结构多态性的原因：多核苷酸链的骨架含许多可以转动的单键：磷酸二酯键的两个O-P键上，N-苷链也可转动，使糖环和苷键出现不同的构象。,2、 Z-DNA,美籍华人科学家王惠君和Rich研究寡核苷酸d（CG）x3的x射线分析后发现的（1979）。,当溶液中Na+为高浓度，使DNA磷酸基上的负电荷全部被中和时，B-型DNA变为Z型DNA，左手双螺旋，由于Z-DNA中戊糖-磷酸链在螺旋外的走向呈“Z”型，故名。 在实验室中，由不少于6bp的交替嘌呤-嘧啶序列形成；Z-DNA可能存在于基因表达的调控有关区。,五、RNA 二级结构,单链，没双链DNA样的双螺旋结构,通过分子内部的氢键作用和碱基堆积形成局部区域的双螺旋结构.,tRNA (clover-like),Ribozyme RNA,rRNA,图、 成熟rRNA二级结构及核糖甲基化位点( Bachellerie J P, et al, 1997, TIBS). Fig Location of ribose-methylation sites in the secondary structure of mature rRNAs.,28S rRNA,六、重复序列,真核中有许多，据重复程度，分为三类：,一、高度重复序列（highly repetitive sequence），2-10bp，在基因组可重复105-107次，高度集中，多在异染色质中，特别是着丝粒和端粒处，占基因组的1%-50%，平均15%，高度重复序列中G-C含量与细胞总DNA的G-C含量不同，在CsCl2密度梯度离心时可显示出额外的小峰，称卫星峰，这些DNA称卫星DNA。 其功能不完全清楚。 5-ACAAATT-3 5-ACAAACT-3 5-ATAAACT-3,5 ATAAACTATAAACTATAAACT 3 3 TATTTGATATTTGATATTTGA 5,Drosophila virilis satellite DNA repeat (several million copies),n,ACAAACT, 1.1x107 bp, 25% genome ATAAACT, 3.6x106 bp, 8% genome ACAAATT, 3.6x106 bp, 8% genome AATATAG, cryptic Satellites comprise more than 40% of the genome,二、中度重复序列,在基因组的重复次数不如高度重复序列高，不很集中，每一基因组约含103。有rRNA和tRNA基因、组蛋白基因，中度重复序列常以迴文顺序出现在基因组，杂以单拷贝序列 -AATTGTGAGCGGATAACAATT- -TTAACACTCGCCTATTGTTAA- 乳糖操纵子中的迴文结构,三、单一序列,多数蛋白质（酶）由单一序列的DNA编码的，数目在一到几个。真核生物基因组中单拷贝序列约占40-70%，其中仅有少数是编码的,四、反向重复序列,真核细胞DNA上有大量的反向重复序列，即正读和反读都是一样的序列。 即在一个假想轴的两侧，碱基序列之间有倒转重复关系，DNA变性后，倒转重复序列之间可以形成十字形结构或发夹结构。,-GCAAATTGTGAGCGGATAACAATTCTA- -CGTTTAACACTCGCCTATTGTTAAGAT-,七、超螺旋DNA,超螺旋DNA（supercoiled DNA）最初在SV40和多瘤病毒中发现 1、松弛态：双螺旋B型DNA分子呈直线时为DNA松驰态，最稳定 2、超螺旋 超螺旋是DNA的三级结构的一种普遍形式，由于受力的不同，可形成两种形式，负超螺旋和正超螺旋，又称为右超螺旋和左超螺旋。,1、正超螺旋：即左旋超螺旋。 B型DNA为右旋双螺旋，如果抓住其两端并向右捻转，使两条链变紧，为解除这种张力，DNA将朝相反方向改变，形成向左的旋转，就形成了左旋超螺旋，即正超螺旋。,Lk = Lko,Relaxed closed circular,Re-join the DNA,Lk = Lko 4 Lk = -4,Break the circular DNA,Untwist 4 x 360o,twist 4 x 360o,Lk = Lko + 4 Lk = + 4,DNA isolated from cell negatively supercoiled by 6 turns per 100 turns of the helix. Lk / Lk = -0.06,Negatively supercoiled,positively supercoiled,溴乙锭、放线菌素D等分子扁平状，可嵌入DNA碱基间，使相邻碱基对间隔增加（0.7mm），超螺旋解旋，盘绕数减少，超螺旋向相反方向（右）旋转，为负超螺旋。,当B-DNA向松驰方向捻转时，DNA形成向右旋转的超螺旋，即负超螺旋。可见超螺旋总是向抵消初级螺旋改变的方向发展。 超螺旋不仅使DNA形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间中，且通过结构的转化以满足功能上的需要。 超螺旋的分离和检测：1）超速离心；2）琼脂糖凝胶电泳,2、负超螺旋的形成：,将螺旋的方向定为向上 则向左转形成正超螺旋 向右转即 负超螺旋,M: DNA/HindIII+EcoR I P：重组质粒pBSK-387bP R：重组质粒pBSK-387bP用酶切割后,第二节 DNA的理化性质,差异很大，分子量106-109，真核常在1010以上 SV40 3-106 T2或T4噬菌体 1.3x109 噬菌体 3.3x107 大肠杆菌DNA 2.2x109 流感嗜血杆菌 8-108 小鼠线粒体DNA 9.5x106 人第三对染色体 6.4x1010 DNA的长度纳米到厘米 x174为0.6 m， 果蝇巨染色体为4.0 m,一、DNA的分子大小,二、核酸的粘度,DNA分子具有很高的粘度。分子量越大其溶液的粘度越高，线形分子的粘度最大。DNA为线型，其长度与直径之比107，很稀的溶液也有极大的粘度，RNA粘度小得多。,三、核酸的沉降特性,核酸在引力场中可以下沉，超速离心测定核酸的沉降常数和分子量。RNA只有局部双螺旋，浮密度比双链DNA高，沉低；双链DNA高于蛋白质的浮密度，居中，据此可用超速离心分离。 双链DNA变性为单链，浮密度增高；单链DNA受热后，密度不变，可用超速离心鉴定单、双链DNA,Buoyant density （浮力密度）,1.7 g cm-3, a similar density to 8M CsCl， =1.66+0.10 (GC)%,Purifications of DNA: equilibrium density gradient centrifugation,RNA1.89 g/cm3,Protein1.33 g/cm3,DNA1.71 g/cm3,四、核酸的紫外吸收,核酸紫外吸收峰值在260nm处，蛋白质的最大吸收值在280nm RNA浓度（g/ml）= OD260 x 40 x 稀释倍数 DNA浓度（g/ml）= OD260 x 50 x 稀释倍数 测磷的含量可定核酸溶液的光密度，以每升核酸溶液中1g磷原子为标准计算核酸的消光系数，称克原子磷消光系数， e(p) e(p)=A/(CL) e(p)=30.98A/(WL) A为吸光度（光密度），L为比色杯内径，通常为1.0cm；C为每升核酸溶液中磷的摩尔数。W每升溶液中磷的重量（g),30.98为磷的原子量。 DNA的e(p)值为6000-8000，RNA为7000-10000。 核酸变性时e(p)值显著升高，称增色效应， 变性的核酸复性后， e(p)值又回复到原来水平，称减色效应。,核酸的纯度,Purity of DNA A260/A280: dsDNA-1.8 pure RNA-2.0 protein-0.5,五、核酸的酸碱性质,两个单核苷酸残基间的磷酸解离常数（即pK值，为pk=1.5）较低。当溶液pH4时，核苷酸链中的磷酸全部解离，多阴离子，核酸为多元酸，具有一定的酸性，等电点较低。 pH7.0-11.0时，DNA分子碱基对较稳定，否则DNA变性； RNA的最适PH为4-5。,六、核酸的变性、复性和杂交,（一）变性：对DNA加热时，DNA双键之间的氢键断裂的过程，称DNA的变性或叫DNA的融解。 DNA的变性的温度范围窄，伴随物理性质变化，如粘度降低、功能丧失，光吸收增加。 增色效应：DNA在260NM处紫外吸光值增加的现象。为变性指标。DNA分子有紫外吸收是因为嘧啶、嘌呤碱基；变性时DNA双螺旋内的碱基充分暴露，提高了吸光值。 常把e(p)吸收值到最高值的一半的温度或吸收值增加的中点温度称“熔点温度”（melting temperature,Tm）， Tm值一般在70-85之间,Effect of Alkali & Application,DNA denaturation at high pH,keto form,enolate form,keto form,enolate form,Base pairing is not stable anymore because of the change of tautomeric (异构) states of the bases, resulting in DNA denaturation,（酮式）,（烯醇式）,RNA hydrolyzes at higher pH because of 2-OH groups in RNA,Effect of Alkali & Application,RNA is unstable at higher pH,OH,free 5-OH,2, 3-cyclic phosphodiester,alkali,Chemical Denaturation,Urea (H2NCONH2) (尿素）: denaturing PAGE Formamide (HCONH2)（甲酰胺）and formaldehide (甲醛): Northern blot,Disrupting the hydrogen bonding of the bulk water solution,Hydrophobic effect (aromatic bases) is reduced,Denaturation of strands in double helical structure,影响Tm值的因素,1 、DNA的均一性，均质DNA熔解温度范围较小，异质的较宽,2、 G-C含量：Tm与G-C含量成正比，测定Tm值，可以推算出DNA的碱基的百分组成： G-C%=（Tm-69.3）x 2.44 在Ph7.0、 0.165 M NaCl溶液中DNA的Tm值与G-C含量成正比，G-C含量越多，Tm值越高。,3、 介质中的离子强度：离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，离子强度较高的介质中，DNA的Tm值较高，且发生熔解的温度范围较小。因此，DNA制品不应保存在极稀的电解溶液中。一般1M NaCl中保存较为稳定。,（二）DNA的复性：在适当的条件下，变性DNA分子又可彼此重新缔合成双螺旋结构，这一过程称复性或退火。复性后物化性质恢复,1、DNA变性后骤然冷至低温时，不能复性。 2、缓慢冷却时，可以复性 3、变性DNA的片段越大复性越慢。 4、变性DNA的浓度越高越容易复性 5、均质的较异质的变性DNA容易复性 6、真核细胞中的重复序列，复性最快,（三）分子杂交,变性/复性理论的应用：分子杂交（即由DNA复性研究发展而成的实验技术）。 杂交可在DNA之间，或RNA之间。用于估计DNA间的同源性，进化相关性，DNA限制性片段等。,DNA：RNA杂交可经RNA转录本检测DNA中特定基因的存在。,
