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细菌遗传学与基因工程,第一节 DNA的重组和重组DNA技术 第二节重组DNA技术的基本操作程序 第三节 转座因子 第四节 文库构建与酵母双杂,第一节 DNA的重组和重组DNA技术,一、重组DNA技术发展史上的重大事件 二、重组DNA技术的主要内容或步骤 三、重组DNA技术的主要技术原理 1PCR 2核酸的凝胶电泳(Agarose Polyacrylamide) 3核酸的分子杂交技术 4基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 5. 限制性核酸内切酶“分子手术刀” 6DNA连接酶“分子缝合针” 7基因的载体“分子运输车” 8细菌的转化,Section 1 DNA recombination,DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。 包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。 体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。,Section 1 Recombination DNA technical,一、 重组DNA技术发展史上的重大事件,40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则“和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,年份 事 件,1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。,年份 事 件,1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒“DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。,年份 事 件,1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。,年份 事 件,1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J. D. Watson出任“人类基因组计划“首席科学家。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb) 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。,二、重组DNA技术的主要内容或步骤,1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,三、重组DNA技术的主要技术原理,1 PCR 穆里斯等人于1988年发明的，1993年获得了诺贝尔化学奖。在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 目的：获取大量的目的基因。 原理：DNA复制。 条件：已知目的基因的核苷酸序列即模板DNA、RNA引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、离子。 方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 特点：指数扩增=2n（n为扩增循环的次数） 过程：变性、退火、延伸、重复四个过程。,重组DNA技术的 主要技术原理,1 PCR,重组DNA技术的主要技术原理,2 核酸的凝胶电泳(Agarose Polyacrylamide) 电泳的速率，与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 电泳的方向：DNA和RNA呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。 染色：ethidium bromide染色，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。,重组DNA技术的主要技术原理,3核酸的分子杂交技术 核酸印迹(nucleic acid blotting)转移：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 核酸杂交/印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。,重组DNA技术的主要技术原理,4基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程 a. 盒式诱变(cassette mutagenesis) b寡核苷酸引物诱变 c PCRG与PCR诱变,5限制性酶切-“分子手术刀” restrictionendonuclease:在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。型：既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；型：只催化非甲基化的DNA的水解。,重组DNA技术的主要技术原理,4.36kp,5. 限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源：原核生物（300种原核生物中分离出了约4000种限制酶 ） 特点：具有专一性 作用：断裂特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 产物：用限制性核酸内切酶切割形成的末端有两种：即黏性末端和平末端。 黏性末端：是限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开形成的。 平末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处切开形成的。,题. 下列关于基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是 A. 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B. 限制性核酸内切酶的活性受温度影响 C. 限制性核酸内切酶能识别和切割RNA D. 限制性核酸内切酶可以从原核生物中提取,6DNA连接酶“分子缝合针” 作用：恢复被限制酶切开了的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 种类 E.coli DNA连接酶：只能缝合双链DNA片段互补的黏性末端，而不能将双链DNA平末端进行连接。 T4 DNA连接酶：既可缝合DNA片段互补的黏性末端，又可缝合双链DNA片段的平末端。但连接平末端之间的效率比较低。,重组DNA技术的主要技术原理,6DNA连接酶“分子缝合针” DNA连接酶和DNA聚合酶的比较:,重组DNA技术的主要技术原理,7基因的载体“分子运输车” 作用：是基因运输的工具:一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 条件 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 具有某些标记基因，以便进行筛选。,重组DNA技术的主要技术原理,7基因的载体“分子运输车” 种类： 目前，基因工程经常使用的载体主要有以下几类： 细菌的质粒：最常用的载体。 噬菌体 动植物病毒 它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别,重组DNA技术的主要技术原理,8细菌的转化 一细菌菌株捕获另一细菌菌株的DNA，导致性状特征发生遗传改变 供体菌株 受体菌株 大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株 CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells） 每g DNA可得107-108个转化子,重组DNA技术的主要技术原理,小结,1、限制性内切酶 ：来源、功能、作用特点,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（一）第一步目的基因的获取 1. 目的基因 2. 获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 目的基因的获取 根据基因的有关信息：基因的脱氧核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目的基因。 优点：有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（一）第一步目的基因的获取 1. 目的基因 2. 获取目的基因的方法 （2）人工合成法：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法人工合成。 反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。 人工合成：蛋白质的氨基酸序列 mRNA序列 结构基因的核苷酸序列 通过化学方法合成目的基因。如人的血红蛋白基因、胰岛素基因。 （3）利用PCR技术扩增目的基因。,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（二）第二步-基因表达载体的构建 1. 目的：使目的基因能够表达和发挥作用。 2. 表达载体的组成： 启动子： 终止子： 标记基因：,基因表达载体模式图,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（二）第二步-基因表达载体的构建 3、构建步骤 酶切质粒 用同种限制酶切割目的基因 适量的DNA连接酶，结合成重组质粒。,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（三）将目的基因导入受体细胞 1、转化： 2、方法：受体种类不同，导入的方法不同。 （1）导入植物细胞 、农杆菌转化法 、基因枪法（又称微弹轰击法） 、花粉管通道法： （2）导入动物细胞 方法：显微注射 技术。 （3）导入微生物细胞,第二节重组DNA技术的基本操作程序,（三）将目的基因导入受体细胞 4、转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。 3、受体生物不同，所用的受体细胞种类也不同。 （1）植物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养成为完整个体）。 （2）动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到限制）。,第二节重组DNA技术的基本操作程序,(四)第四步-目的基因的检测与鉴定 1、导入检测： 2、表达检测 （1）转录检测:DNA分子杂交技术 （2）翻译检测:抗原抗体杂交（免疫）法 3. 鉴定：个体生物学水平鉴定,原位菌落（或噬菌斑）杂交,题：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。下列是对基因工程有关检测结果的分析，正确的是 A. 只要检测到受体细胞中含有标记基因，则表明目的基因导入了受体细胞 B. 只要检测到受体细胞含有目的基因，则表明基因工程的任务完成了 C. 只要检测到受体细胞中含有目的基因转录产生mRNA，则表明基因工程的目标实现了 D. 只要检测到受体细胞中含有所需要的蛋白质产品，则表明目的基因完成了表达过程,第三节 转座因子（transposable element）,定义： 可移动位置的遗传因子的总称。 又叫可移动因子，它是指一段特定的DNA序列，可从原来的位置上单独复制或自动脱落下来，经环化后再插入到染色体其他位置，并对插入位点附近的基因产生各种遗传学效应。,第三节 转座因子（transposable element）,发现历史 Barbara McClintock，1902-1992）是20世纪具有传奇般经历的女科学家，她在玉米中发现了“会跳舞”的基因。 直到1967年Shapiro才在E.coli中发现了转座因子（transposable element）。,原核生物中的三类转位因子： Three principle classes of TE 1. Insertion sequence（IS,插入序列） 2. transposon Tn （ 转座子 ） 3. 转座噬菌体,存在于细菌染色体或质粒DNA分子上的一段可移动的遗传元素（特异性核苷酸序列片段）,细菌转座因子的类型和结构,插入序列（insertion sequence IS）： 最小最简单的转位因子，2kb 两端具有短的末端反向重复序列(inverted terminal repeats) 只编码参与转座作用的转座酶（transposase） 不携带任何已知与插入功能无关的基因区域 插入后与插入位点附近的序列共同起作用。,转座子（transposon Tn）： 一般2kb，除携带与转位有关的序列外，还带有某些结构基因 因此当Tn插入某一基因时，可引起细菌性状的变化。 转座噬菌体：是一些具有转座功能的溶原性噬菌体。,Transposon,A transposon is a DNA sequence able to insert itself (or a copy of itself) at a new location in the genome, without having any sequence relationship with the target locus. 转座(transposition)：转座子的转移过程。,转座子的种类与特征,转座子 携带耐药或毒素基因 Tn1 Tn2 Tn3 AP（氨苄青霉素） Tn4 AP、SM（链霉素）、Su（磺胺） Tn5 Km（卡那霉素） Tn6 Km（卡那霉素） Tn7 TMP（甲氧苄氨嘧啶）、SM Tn9 Cm（氯霉素） Tn10 Tc（四环素） Tn551 Em（红霉素） Tn971 Em（红霉素） Tn1681 大肠埃希菌（肠毒素基因）,第四节 文库构建与酵母双杂,分析基因/蛋白互作的主要方法： （1）构建cDNA、DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因； （2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术； （3）DD-RT-PCR法及差别显示技术； （4）差别分析法 (Representational difference analysis, RDA）； （5）酵母双杂交Two-hybrid system； （6）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移 （genomic DNA Walking）。,基因组文库的构建,genomic library ：整个基因组DNA切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的克隆总体。 应用噬菌体载体构建基因组文库的程序： 消化，约20kb； 切割载体； 除去噬菌体裂解生长非必需的内部片段； 连接； 体外包装系统进行噬菌体的组装； 重组噬菌体侵染E. coli，每一克隆中含有外源DNA的一种片段，全部克隆构成一个基因文库。,用Hac-Alul双酶消化法,采用核酸内切限制酶Sau3A进行局部消化,基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996),cDNA文库的构建,cDNA文库 ：以某生物的总mRNA为模板，逆转录酶成双链cDNA，连接到载体上，转化宿主细胞后构建的基因文库。一般比基因组文库小10-100倍 基本程序： mRNA的提取和纯化。 合成cDNA第一链。 将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。 将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。,cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980),酵母双杂交体系,Two-hybrid system/interaction trap，90年代初发展起来 基本原理： 真核生物的转录因子大多是由2个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。 如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。 若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基因。,总RNA提取、纯化-mRNA分离-高丰度mRNA差异消减-cDNA制备-cDNA连接AD载体-连接产物转化大肠杆菌-cDNA文库效价测定-cDNA文库扩增等,酵母双杂交体系,主要实验过程： a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体; c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。 d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。 e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。,酵母双杂交文库的利用,1） 比对病变组织,找到突变基因或者导致变异的蛋白。 2） 大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向。 3） 可反复使用，培养时间短，适合大规模筛选使用。 4） 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去纯化蛋白质的繁琐步骤。 5） 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。,举例,谢谢！,