第三章 发酵工程原理及其在食品工业中的应用.ppt

第三章 发酵工程原理及其在食品工业中的应用,第一节 概述,发酵：借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身，或其初级代谢产物、次级代谢产物的过程。 发酵工程：也称微生物工程。利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代化工程技术手段，最大限度地发挥微生物的某种特定功能，以生产出人类所需的产品。,一、发酵工程的定义,（一）发酵工程主要研究对象 1.大规模微生物细胞培养过程； 2.大规模培养基灭菌和空气灭菌过程； 3.微生物细胞生长和产物形成动力学； 4.发酵过程的优化； 5.生物反应器的放大和设计； 6.发酵过程的参数监控和计算机应用； 7.发酵产品的分离和纯化等工程技术问题。,（二）发酵工程产品类型 1.以菌体为产品。(酵母菌、单细胞蛋白) 2.以微生物的酶为产品。（碱性蛋白酶、淀粉酶） 3.以微生物的代谢产物为产品。（氨基酸、脂类） 4.利用发酵作用，对某种化合物的化学结构进行改造，即产品的转化过程。（醋的酿造）,二、发酵工程的发展简史,（一）天然发酵阶段 主要产品有黄酒、白酒、啤酒、酒精和醋等。多数产品为厌氧发酵、非纯种培养、凭经验传授技术和产品质量不稳定是这个阶段的特点。 （二）纯培养技术的建立 纯培养技术的建立是发酵技术发展的第一个转折时期。 （三）通气搅拌发酵技术的建立 通气搅拌发酵技术的建立是发酵工业上的第二个转折点。,（四）代谢控制发酵技术 由氨基酸发酵而开始的代谢控制发酵，使发酵工业进入一个新的阶段。随后，核苷酸、酶制剂以及有机酸等方面也利用代谢调控技术进入发酵生产。 （五）开拓发酵原料时期 石油化工副产物石蜡、醋酸、甲醇以及甲烷等碳氢化合物被用来作为发酵原料。 （六）基因工程阶段 使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物，如胰岛素、干扰素、白介素和多细胞生长因子等，大大地拓宽了发酵工业的范围，使发酵工业发生了革命性变化。,三、发酵工艺及方法,（一）固体发酵法 利用固体基质，如麸皮、米糠、秸秆等为主要原料，再根据需要添加其他谷糠、豆饼、无机盐等，加水拌成含水量适度的半固态物料作为培养基，供微生物的生长繁殖和产生代谢产物。目前利用固体发酵法生产的产品有酒曲、白酒、酱油、食醋、腐乳、酶制剂、食用菌等。 （二）液体发酵法 利用液态培养基，进行微生物的生长繁殖和形成人们所需要的代谢产物。根据通气（供氧）或不通气及通气方法的不同，又分为液体表面发酵法、液体深层通气发酵法、液体厌氧发酵法三种。,固体发酵与液体（深层）发酵相比，具有以下优点 1.固体发酵单位体积的酶产量往往高于液体发酵几倍，甚至几十倍，特别适合真菌酶类和一些次级代谢产物及大型真菌的生产。 2.操作简单，适应性强，原料来源广，价格低廉，可以利用多种其他发酵工艺无法利用的粮食加工下脚料或废料进行生产。 3.固体发酵仅需空气自然对流或小量通风即可，能耗低。 4.固体发酵的产物提取一般步骤少，降低生产成本。有些产物，如饲料或饲料添加剂，不需要分离步骤，全部发酵物质可以作为产品。 5.发酵工艺全过程无废水或很少，可以减少环境污染。,1.液体表面发酵法 又称液体浅盘发酵法或静置培养法，是将已灭菌的液体培养基，接入微生物菌种后，装入可密闭的发酵箱内盘架上的浅盘中，薄薄一层，液层厚约12cm，然后向盘架间通入无菌空气，通过浅盘内培养基的表面供给氧气，并维持一定的温度进行发酵。 优点：无须搅拌，动力消耗省。 缺点：控制杂菌污染较难，所需场地较大，劳动强度大，生产效率低。,2.液体深层通气发酵法 将微生物接入装有无菌液体培养基的封闭发酵罐中进行培养或发酵的技术。 优点：容易按照生产菌种对代谢营养物以及不同生理时期的通风、搅拌、温度和培养基pH值等的要求，选择最佳培养条件。 产品纯度高，质量也较稳定，还具有机械化程度高、劳动强度小、设备利用率高等优点。 缺点：易染菌、无菌操作要求高、设备投资大。,3.液体厌氧发酵法 能作大规模液体培养的厌氧菌仅丙酮丁醇梭菌，用于丙酮的发酵生产。酒精、啤酒、葡萄酒、酸乳的发酵属于兼性厌氧发酵，菌种培养时需要适量通气，发酵时则不通气。 优点：可省略通气和搅拌设备，简化工艺过程，还能大大节约能源的消耗，提高生产效率。,四、我国发酵工业与先进国家相比，存在的 主要差距,1.传统发酵产品及产量发展过大过快 酒类、谷氨酸、柠檬酸、普通酶制剂和抗生素等。 2.发酵产品工业产值在国民生产总值中的比例较低（1%）以下 3.发酵产品档次低，品种少，不配套。 4.技术创新力度不够，低水平重复现象严重。,1.菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖，并且生成所需的代谢产物产量要高。 2.菌种可以在要求不高，易于控制的培养条件下（糖浓度、温度、pH值、溶解氧和渗透压等）迅速生长和发酵。 3.菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。,第二节 食品发酵菌种筛选,一、食品发酵工业对微生物菌种的一般要求,4.根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。 5.选择一些不易被噬菌体感染的菌株。 6.生产菌种纯度高，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。 7.菌体不能是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质（包括激素和毒素等），以保证安全。,二、食品发酵工业常用微生物,（一）细菌 发酵工业中常用的细菌：枯草芽孢杆菌（蛋白酶、淀粉酶）、乳酸杆菌（乳酸）、醋酸杆菌（醋酸）、梭状芽孢杆菌（丙酮、丁醇）、巨大芽孢杆菌（葡萄糖异构酶）、大肠杆菌（谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶等）、产氨短杆菌（氨基酸、核苷酸）等。,（二）酵母菌 发酵工业中常用的酵母：酿酒酵母、汉逊酵母和各种假丝酵母等。除了用来酿造饮料酒、酒精和烤制面包外，还可用于生产甘油、酶制剂、有机酸等。此外，由于酵母菌体本事富含蛋白质、核糖核酸、细胞色素C、酶类及多种维生素，又是医药、食品、饲料行业中的重要原料。,（三）霉菌 发酵工业中常用的霉菌：根霉属，主要产淀粉酶、脂肪酶、乳酸、甾体激素等；毛霉属，主要产蛋白酶、凝乳酶、草酸、甾体激素等；木霉属，主要产纤维素酶等；青霉属，主要产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、维生素等；曲霉属，主要产维生素C、柠檬酸、各种水解酶类等。,（四）担子菌 担子菌的多糖物质具有很强的生理活性，尤其是提高机体免疫力、抗肿瘤作用等方面越来越引起人们重视。此外，担子菌通过液体发酵得到的菌丝体富含蛋白质、多糖、维生素等，可用于食品、医药和保健行业。 （五）藻类 自然界分布极广的一大群自养微生物资源，许多国家已把它用作人类保健食品和饲料。,三、生产菌种选育,（一）自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。 （二）诱变育种 利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞遗传物质的分子结构发生改变，从而引起菌体发生遗传性变异，再用合理的筛选方法从细胞群体中筛选出少数具有优良性状的菌株。,（三）杂交育种（原生质体融合） 指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 （四）分子育种 应用基因工程方法进行的育种。,四、生产中常用菌种的保藏,（一）生产中菌种来源 自然界分离筛选；菌种保藏机构获得；已有菌株中筛选突变株。 （二）菌种保藏原理 根据微生物生理、生化特点人工创造条件，使微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥和缺氧三者，在此种条件下，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的。,（三）菌种保藏方法 1.冷冻保藏 普通冷冻保藏技术（520）、超低温冷冻保藏技术（6080）和液氮（196）冷冻保藏技术 2.冻干保藏 3.传代保藏 将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定温度下生长和保存的传代保藏方法。 4.矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏。 5.干燥载体保藏 干孢子形成真菌和链霉菌时可通过吸附于干燥惰性固相载体如白土、硅胶或陶瓷表面获得较长时间的保藏。,（四）菌种保藏注意事项 1.菌种在保藏前所处的状态 一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。 2.菌种保藏所用的基质 斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些。 3.操作过程对细胞结构的损害,（五）国内重要保藏菌种机构 1.普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌、细菌 中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV）：病毒 2.农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 中国科学院土壤肥料研究所，北京（ISF） 3.工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 中国食品发酵工业研究所，北京（IFFI） 4.兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC） 农业部兽医药品监察所，北京（CIVBP）,5.医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）：真菌 卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP）：细菌 中国医学科学院病毒研究所，北京（IV）：病毒 6.抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 中国医学科学院抗菌素研究所，北京（IA） 四川抗菌素工业研究所，成都（SIA）：新抗菌素菌种 华北制药厂抗菌素研究所，石家庄（IANP）：生产用抗菌素菌种,第三节 培养基的组成及制备,培养基：人工配制的供微生物或动、植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需要的产物的营养物质和原料。 （一）按培养基的成分分类 合成培养基：原料的化学成分明确、稳定，适用于研究菌种基本代谢的物质变化。但是生产某些疫苗等生物制品的过程中，为了防止杂蛋白等其他杂质混入，也常用合成培养基。合成培养基的营养成分单一且价格昂贵，故不适用于大规模生产。,一、培养基的类型,天然培养基：原料是一些天然的动植物产品，相对于合成培养基来说，其成分比较复杂，如玉米粉、花生粉、豆饼粉等。 优点：营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。一般天然培养基中不需要另加微量元素、维生素等物质，且培养基组成的原料来源丰富、价格低廉，适合于工业生产。 缺点：由于天然培养基的组分复杂，不同产地、不同季节、不同品种的相同原料，各种成分含量有所不同，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。,（二）按培养基外观的物理状态分类 固体培养基：主要成分为麸皮、大米、小米、稻糠和琼脂等，有的还含有一些其他营养成分。比较适用于菌种的分离和保存，也广泛应用于曲霉菌和有子实体的真菌类，如香菇、木耳、灵芝等的生产。 半固体培养基：在配好的液体培养基中加入琼脂，一般用量为0.5%0.8%，培养基呈半固体状态。主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等。 液体培养基：80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分。流动好，输送方便，有利于氧气、其他物质和热量的传递，便于发酵参数的控制，是摇瓶发酵和大规模工业发酵最常用的培养基。,（三）按用途分类 斜面培养基：供菌种繁殖的一种常用的固体培养基。这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，并不易引起菌种发生变异。 种子培养基：供微生物大量生长，为发酵提供活力强的种子。配制原则：使种子生长旺盛，各种有关的初级代谢酶的活力高，有利于接入发酵培养基后大量、快速合成产物。种子培养基一般要求有机氮源和维生素的比例较高。 发酵培养基：供菌种生长、繁殖，得到所需要的目标产物。既要使种子接种后能迅速生长达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需的产物。发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的碳源、氮源、磷源等外，还要有产物合成所需的某些特定元素、前体和促进剂等。,孢子培养基：主要用于制备微生物孢子。要求此种培养基能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。 繁殖和保藏培养基：主要用于菌种保藏，一般根据微生物的种类和营养要求加以选择。 选择培养基：根据某（种）类微生物的特殊营养要求或对某种化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样品中劣势菌变成优势菌，从而提高该（种）类的筛选效率。,二、培养基的配制原则,（一）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 不同的微生物所需营养物质不同，其培养基配方也不同。必须了解不同生产菌种的培养条件、代谢途径、代谢产物的化学性质，从而确定最优的培养基。 （二）合适的碳氮比 氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多，则容易形成较低的pH值，不利于菌体的生长；若碳源不足则易引起菌体衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。,微生物在不同的生长阶段，对碳氮比的最适要求也不一样。一般工业发酵培养基的碳氮比约为1000.22.0。 快速利用氮源（如硫酸铵）：容易被菌体利用来生长，对某些产物的合成，特别是抗生素的合成有调节作用。 慢速利用氮源（如黄豆粉、花生粉）：对延长次级代谢产物的分泌期和提高产物产量有一定好处。,（三）合适的pH值 在配制培养基时，要注意生理酸碱性物质，以及pH值缓冲剂的加入和搭配。要根据菌种的性能、其生长和合成产物时pH值的变化情况以及最适pH值控制范围等，综合考虑选用何种生理酸碱物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH值都能维持在最佳状态；也可考虑用中间补料来控制pH值。 （四）合适的渗透压 营养物质浓度过低，不利于菌体的生长，也不利于提高产物的产量和设备利用率。但是，营养物质浓度过高，则由于培养基溶液的渗透压太大，会抑制微生物的生长，也不利于溶氧。同时培养基中的离子浓度也会影响微生物的生长及代谢。,三、发酵工业中常用的原料,（一）工业上常用碳源 目前使用最广的碳源是淀粉，主要来自玉米、谷物、木薯等，还可以用经水解得到的各种淀粉糖，如葡萄糖、麦芽糖等。使用最多的是葡萄糖，另外还有蔗糖、乳糖等。用于疫苗、一些基因工程产品生产的培养基，通常采用牛血清蛋白、牛肉汁、酵母粉等作为碳源。 （二）工业上常用氮源 氨水、硫酸铵、硝酸铵等为无机氮源；黄豆粉、花生粉、酵母粉、鱼粉等都是有机氮源。一般来说，有机氮源更有利于微生物的生长。,表2-1 工业上常用的碳源及其来源,表2-2 几种常用有机氮源的含氮量,（三）无机盐 根据需求量通常将无机盐分为主要元素和微量元素。微量元素需求量极少，混杂在水或其他营养物中的极微数量就足以满足微生物的需要。但无特殊原因，一般配制培养基时没有另外加入微量元素的必要。 （四）水 天然水含有不同类型和不同量的矿物质，具有一定的硬度和碱度，水的质量对微生物的生长和发酵产物的形成有一定影响。如一些著名的酿酒厂附近都有优质的水源。,（五）生长因子 一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、脂肪酸等。 （六）消泡剂 常用的消泡剂有植物油脂、动物油脂和一些化学合成的高分子化合物。 植物油脂：玉米油、豆油、棉籽油、菜籽油 动物油脂：鲸鱼油、猪油 高分子化合物：聚醚类和硅酮类,四、培养基的灭菌,（一）消毒和灭菌 消毒:指杀灭引起感染的微生物。在治疗学与卫生学中消毒指的是杀灭病原微生物；在工业微生物中消毒指的是除去会引起污染的微生物。 灭菌:指杀死一切微生物（包括繁殖体和芽孢等），不分病原和非病原微生物。 消毒一般多指化学因素处理，灭菌一般多指物理因素处理。消毒的结果并不一定是无菌状态，灭菌的结果则是无菌状态。,（二）灭菌方法 1.干热灭菌法 大多数的干热灭菌是利用电热或红外线在某设备内加热到一定温度将微生物杀死。干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电介质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是干热灭菌的主要根据。干热灭菌用于要求灭菌后保持干燥的物料、器具等。 2.湿热灭菌法 借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，从而使微生物死亡。在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热凝固变性。,（1）巴斯德消毒法 将待消毒的液体食品在6365下保持30min，然后迅速冷却，以杀死其中可能存在的病原菌，保持食品的营养和风味。啤酒、黄酒、酱油、醋、牛奶等均用此法消毒。 （2）高压蒸汽灭菌法 工业发酵菌种培养及生产过程培养基、管道和设备的灭菌主要利用此方法。一般在0.1MPa蒸汽压（对应温度为121.0）下处理1530min，即可达到灭菌目的。,（3）间歇灭菌法 将待灭菌物品置于蒸锅（蒸笼）内常压蒸1530min，以杀死其中微生物营养细胞。冷后置于一定温度（2837）下培养过夜，促使第一次蒸煮中未被杀死的芽孢或孢子萌发成营养细胞，再用同样的方法处理。如此反复三次，可杀灭所有营养细胞、芽孢和孢子，达到灭菌的目的。一般只用于有些不宜用高压蒸汽灭菌的物品和培养基，例如，某些糖、明胶或牛奶培养基等。,3.过滤除菌法 对于蛋白质、酶、血清、维生素等热敏性物质，常采用微孔过滤除菌法。常用的微孔过滤有陶瓷膜、金属膜、聚砜膜、尼龙膜，还有熔结玻璃细菌滤器、火棉胶、硝化纤维素滤膜等。一般孔径为0.20.4m，最大孔径不超过1m的过滤介质可以得到无菌滤液。缺点是无法去除噬菌体或病毒。,4.放射性灭菌法 通常用紫外线、x射线和射线等进行灭菌，以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，缺点：细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强，而且紫外线的穿透力低，只能用于表面灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料灭菌。一般用于无菌室、培养室等空间灭菌。,5.化学药品灭菌法 高锰酸钾溶液：灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡,常用浓度为0.1%-0.25%。 漂白粉：杀菌作用是次氯酸钠分解为次氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细菌和噬菌体均有效。杀菌用的漂白粉：低标准漂白粉（含30%有效氯）、高标准漂白粉（含70%有效氯）和商品次氯酸钠溶液（含15%有效氯）。 75%酒精溶液：杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性,对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀灭作用，但对细菌芽孢的杀灭能力较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。,（一）液体培养基 分批灭菌（实罐灭菌）、连续灭菌。 （二）固体培养基 蒸料，在固态发酵生产酱油和食醋中用得最广。,五、生产上培养基的灭菌方法,第四节 菌种活化与扩大培养,菌种活化与扩大培养: 指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面培养活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。这些纯种培养物又称为种子。 种子扩大培养的一般工艺流程：包括实验室制备阶段和生产车间种子制备阶段。,一、实验室种子制备,（一）菌体制备 1.细菌和放线菌类 细菌培养多采用肉汤琼脂培养基，而放线菌类的孢子培养多数采用人工合成琼脂培养基。细菌培养温度大多为37，13d；放线菌类孢子的培养温度大多数为28，部分菌种为30或37，培养时间一般为47d，也有的为14d。孢子成熟后，于5冰箱（库）内保存备用，存放时间一般在一周内，少数菌种可存放13个月。,2.霉菌类 霉菌类孢子的培养多数采用大米、小米、麦麸等天然固体培养基。制好的孢子可放在5冰箱中保存备用，也可通过真空干燥进行保存备用。经过真空干燥的孢子菌种可在生产上连续使用半年左右。,（二）摇瓶种子制备 某些菌种的孢子发芽和菌体繁殖速度较缓慢，为了缩短种子罐培养周期和稳定种子质量，将孢子经摇瓶培养成菌体后再进罐，制成的种子称为摇瓶种子。 制备摇瓶种子的目的：使孢子发芽长成健壮的菌体，同时对斜面孢子的质量和无菌情况进行考察，然后择优选用。 优点：大大缩小了的种子罐。 缺点：工艺过程长，操作过程中染菌几率较高。,二、生产车间种子制备,（一）种子罐级数的确定 种子罐的作用：使实验室中有限数量的菌体发芽、生长并繁殖成大量菌体，接入发酵罐培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。 种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据菌种生长特性、孢子发芽和菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。 一级发酵：在小型发酵罐（530L）中进行试验时，采用直接孢子或菌体接入罐中发酵。,（二）种龄与接种量 1.接种 种龄：种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌体量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。过老种子会引起生产能力下降而菌体过早自溶。 种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。,2.接种量 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。如果接种量过多，往往使菌体生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，从而影响产物的合成。 近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。,三、菌种质量的要求,优质种子必须具备下列条件： 1.菌种细胞的生长活力强，移种到发酵罐后能迅速生长以缩短延滞期。 2.生理性状稳定，以便得到稳定的菌体生长过程。 3.具有适宜的菌体总量及浓度，以满足大容量发酵的要求。 4.无杂菌污染，以确保整个发酵过程正常进行。 5.保持稳定的生产能力，使最终产物的生物合成量持续稳定高产。,第五节 空气除菌,（一）空气中微生物的分布 一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面越高含菌量越少，高度增加10米，微生物数量减少一个数量级；工业城市比农村空气中含菌量高。设计时以含量为103104个进行计算。 （二）发酵对空气无菌程度的要求 根据所用菌种的生长能力强弱、生长速度快慢、菌种分泌物的性质、发酵周期的长短、培养物的营养成分和pH值的差异而确定。,一、通气发酵对无菌空气的要求,二、空气除菌的方法,（一）加热灭菌 加热灭菌是将空气加热至一定温度，并维持一定时间，杀灭空气中的微生物的方法。 （二）静电除菌 能耗低（处理1000m3耗电0.40.8kW.h）；空气压力损失少（0.1MPa左右）；对1µm尘粒的捕集效率达99%以上；设备庞大，属高压电技术。 （三）辐射杀菌 参考相关书籍 （四）过滤除菌 参考相关书籍,第六节 微生物发酵动力学,初级代谢产物：微生物代谢产生的，并是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。例如，氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核酸等。 次级代谢产物：微生物代谢产生的，这些代谢产物不是生长所必需，但可能对产生菌的生存有一定的价值，或者说与菌体的生长繁殖无明确关系。例如，抗生素、生物碱和色素等。,一、微生物代谢产物类型,二、发酵操作方式,（一）分批发酵 将营养物和菌种一次加入发酵罐进行培养，直到发酵结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。 优点：操作简单，被广泛用于多种发酵过程。 缺点：总的生产能力不是很高；发酵周期中非生产时间较长，使得发酵产品成本提高。,1.与生长相关联型 指微生物的比生长速度与目的产物的比生产速度正比，产物量与生成量同时达到最大。一般为初级代谢产物。例如，单细胞蛋白和葡萄糖酸、酒精发酵等，但也有微生物合成的某些酶类。,2.与生长部分相关联型 这类代谢产物也是来自能量代谢所用的基质，但产物在菌体生长达到一定水平后开始形成，其分批发酵出现两个高峰，先是出现基质消耗和菌体生长的高峰，没有或很少形成产物，然后是菌体生长进入静止期，出现产物形成的高峰，即产物形成和菌体生长基本分开，例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。,3.与生长不相关联型 有些发酵过程，产物的形成速度与细胞的积累量有关，产物合成速度与菌体量成正比。这类产物来自两步代谢途径，而不是来自分解代谢途径，在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成产物，初级代谢和产物形成完全分开，如许多抗生素的发酵。,（二）连续发酵 指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。 优点：可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定。能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会。减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时。由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长。容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。,缺点：由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染。在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异。对设备、仪器及控制元件的技术要求较高。黏性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。 主要应用于研究工作中，如发酵动态参数的测定、过程条件的优化试验等，而在工业生产中的应用还不多。目前连续培养方法在食品工业中的应用还局限于面包酵母、啤酒等的生产等。,（三）补料分批发酵 又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不会造成不利影响，从而达到提高产率的目的。,优点：它可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制效应。对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长、耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率。在真菌培养中，菌丝的减少可以降低发酵液的黏度，便于物料输送及后处理。与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广。,1.单一补料分批发酵 在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。 2.反复补料分批发酵 在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。,补料技术已由少次多量、少量多次逐步改为流加，近年又实现了流加补料的微机控制。但是，发酵过程中的补料量或补料率目前在生产中还只是凭经验确定，或者根据一、两个一次检测的静态参数（例如，基质残留量、pH值、溶解氧浓度等）设定控制点，带有一定的盲目性，很难同步地满足微生物生长和产物合成的需要，也不可能完全避免基质的调控反应，因而现在的研究重点在于如何实现补料的优化控制。 目前，食品工业中运用补料分发批发酵技术进行生产和研究的范围十分广泛，包括氨基酸、维生素、酶制剂、有机酸和核苷酸等。随着研究工作的深入及微机在发酵过程自动控制中的应用，补料分批发酵技术将日益发挥出其巨大的优势。,（一）真菌多糖 真菌多糖不但能治疗机体因免疫系统受到严重损伤而出现的癌症和多种免疫缺损疾病，还能诱导干扰素的产生，而且真菌多糖作为药物，对体细胞的毒性极小。真菌多糖除了临床上可用于癌症的免疫治疗，其独特的保健作用也为真菌多糖特别是食用菌多糖在食品工业上的开发利用开辟了广阔的市场前景。例如，灵芝多糖、香菇多糖、金针菇多糖、冬虫夏草多糖。,第八节 发酵工程在食品工业中的应用,一、发酵工程与功能性食品,（二）生物活性肽 生物活性肽是指那些具有特殊生理功能的肽类。人们研究发现，小肽（27个氨基酸）在人体内的消化吸收优于游离氨基酸，且两者有不同的输送体系。这些小肽不仅能提供人体生长发育所需要的营养物质与能量，还能调节人体生理功能，起到防病治病的作用。由于食品蛋白质母体或其组成氨基酸不具备这些作用，因此引起了食品学术界的广泛重视。 研究人员已从以下三种途径获得了多种生物活性肽 1.从组织器官中提取的生物活性肽。但是这些生物活性肽大部分含量甚微或提取繁琐，不足以大量生产供给所需，只局限于生产某些有特殊疗效的肽类药物。,2.通过化学法（液相或固相）或重组DNA技术合成的生物活性肽。由于化学合成法生产成本高、副产物多以及各种化合物残留的问题，因此限制了它的应用；重组DNA技术合成法被广泛应用，但是这种方法多用来生产长肽和蛋白质，而许多生物活性肽都是短肽，所以也限制了这种方法的使用。 3.体外酶解蛋白质和发酵法产生的生物活性肽。由于体外酶解法具有安全卫生、原料来源广和价格低廉、控制反应时间可以得到特定的生物活性肽等优点，已引起食品科学家的浓厚兴趣 。,实例一 谷胱甘肽（简称GSH） 一种具有多种重要生理功能的活性肽，它是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，存在于动物、大多数植物细胞及微生物中。 谷胱甘肽（GSH）的分子结构中含有一个活泼的巯基SH，易被氧化脱氢，因而GSH具有抗氧化性，能清除自由基，使生物大分子、生物膜免受损害。 谷胱甘肽能够作为多种酶反应的辅酶，对生物分子蛋白质的巯基有保护作用，可维持某些酶的活性。临床上谷胱甘肽被用作治疗肝病、重金属中毒、放射线损伤等的药物。 谷胱甘肽作为一种多功能的生物活性物质，在食品、医药等领域的应用前景广阔，市场需求量日渐增大。,实例二 乳酸链球菌肽（nisin） 又称乳酸链球菌素，是由乳酸乳球菌的某些菌株产生的一种肽，它是由34个氨基酸组成，相对分子质量约为3354。纯的乳酸链球菌肽的等电点为pH9。 能有效抑制许多引起食品腐败的革兰氏阳性菌及病原菌的繁殖。毒理和生物学研究表明乳酸链球菌肽对人体安全无毒。1969年，FAOWHO联合食品添加剂专家委员会确认乳酸链球菌肽可作为食品防腐剂。 乳酸链球菌肽广泛用于乳制品、罐头食品、植物蛋白食品、肉制品及乙醇饮料生产中，它能抑制孢子萌发，特别适用于热加工食品防腐保鲜。,（三）功能性不饱和脂肪酸 1.-亚麻酸（GLA） （1）-亚麻酸及其生理功能 -亚麻酸是一种有18个碳原子、含3个不饱和双键的直链脂肪酸，为全顺6,9,12-十八碳三烯酸，CH3(CH2)4CHCHCH2CHCHCH2CHCH(CH2)4COOH，是人体必需的三种不饱和脂肪酸（亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸）之一。 作为合成人体前列腺素的前体物质，在人体内扩张血管、抑制血液凝固、调节体内胆固醇代谢及增强免疫功能等方面起着十分重要的作用，被认为是具特殊医疗保健作用的营养素。临床已将-亚麻酸用于预防和治疗动脉粥样硬化、血栓、高血脂及高血压、糖尿病等疾病。,（2）-亚麻酸的发酵生产 GLA的来源过去以从月见草子中提取为主，但是月见草种子的产量和含油量不很稳定，受气候、产地等条件的影响较大，且精炼成本高，不能满足市场的需求。20世纪80年代初，世界各国学者开始寻求利用微生物资源来生产-亚麻酸。 许多微生物包括被孢霉属、根霉属、鲁氏毛霉之类真菌，曲霉属和螺旋藻属的某些菌株能产生含-亚麻酸的油脂。 螺旋藻属含有10%类脂物，其中-亚麻酸占类脂物总量的20%25%。被孢霉属的真菌产油脂能力较高，其中有的形成-亚麻酸占总油脂的含量可达8.3%。海洋绿藻中的小球藻菌株产-亚麻酸的含量占总脂肪酸的37.9%。,（3）-亚麻酸在食品工业中的应用 -亚麻酸除在医药上治疗人体心血管系统疾病外，还具有一定的减肥疗效，可作为保健食品的有效成分或作为食品添加剂加到饮料、果汁、果子冻、饼干、巧克力、口香糖等食品中，特别可应用于制造婴儿食品强化剂，制造-亚麻酸的婴儿营养奶粉及适宜于孕妇与哺乳期妇女的营养奶粉。,2.EPA和DHA 构成中性脂肪的脂肪酸部分，含有饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸两类：二十碳五烯酸（简称EPA）和二十二碳六烯酸（简称DHA），均属于多烯不饱和脂肪酸。 自从1972年报道了多烯不饱和脂肪酸（PUFAs）的海洋食物对冠状动脉粥样硬化有治疗作用以来，人们对-3 PUFAs，主要是EPA和DHA的研究越来越多，发现它们广泛存在于海洋鱼油之中（三文鱼、金枪鱼等），有益于人类健康，对人类的许多疾病和生理失调有预防和治疗作用，特别是能预防和治疗动脉粥样硬化、血栓形成和高血压等心血管疾病、炎症和某些癌症。,（1）二十碳五烯酸（EPA） 二十碳五烯酸（EPA）对防止和治疗血栓、关节硬化及其他血液循环系统疾病等具有明显效果，其主要来源是一些海洋鱼类的鱼油，但鱼油中二十碳五烯酸的含量偏低，因此人们发现了其他来源，例如，藻类、苔藓以及一些微生物等。,（2）二十二碳六烯酸（DHA） DHA是神经组织的基本组分，是一种人体必需脂肪酸。人体中进行的DHA生物合成能力极其有限，因此从食物中摄取足够的DHA十分重要。特别是婴幼儿，缺乏DHA会影响智力、视力和生理发育。尽管海洋鱼油是目前DHA的最普遍来源，但鱼油的产量和脂肪组成是随季节、产地、鱼种及鱼食物链（即海洋微生物类型）而变化的，且鱼油的脂肪酸组成十分复杂。因此鱼油无论是数量还是质量都难以满足人们对DHA的需求，需要探索DHA的新来源。 目前研究得最多的是用海洋真菌和藻类生产DHA，其中用海洋藻类生产富含DHA的单细胞油脂已达工业化规模，而且产品的稳定性、纯度、安全性和生物利用率都优于鱼油，目前已应用于婴儿奶粉和作为辅助食品。,在最近的10年中，商业浓缩型发酵剂已获得广泛应用，特别是液体冷冻浓缩型发酵剂在乳品和奶酪行业中已占优势。70500 mL直投式发酵剂能直接发酵11365678 L的牛奶成酸乳制品。许多发酵乳制品，如契达奶酪、乡村奶酪、奶油、黄油等都采用直投式发酵剂。其他食品行业也采用浓缩型乳酸菌发酵剂进行发酵生产，如半干发酵香肠、法式面包、酸泡菜等。 乳酸菌发酵剂由几个重要的乳酸菌属：乳酸球菌中的乳酸乳球菌、乳脂乳球菌，链球菌中的嗜热链球菌、丁二酮乳酸乳球菌，乳杆菌属中的保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌以及片球菌属中的啤酒片球菌。,二、发酵工程与乳酸菌发酵剂,（一）培养基 1.培养基成分 生产浓缩型乳酸菌发酵剂的基础培养基成分或是可溶性的，或是悬浮的，原因是发酵结束后常采用物理法分离菌体（特别是用滤膜分离或离心分离）。在分批发酵中为获得最大生长速率无论是采用单一的或混合的菌种，都需对培养基进行改良。 2.培养基灭菌 最有效的灭菌方式是超高温杀菌（140148，48 s）。这样灭菌的培养基能够支持大多数乳酸菌，如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的生长繁殖。在培养基灭菌之后，应采用合适的方式将之泵到预先灭菌的发酵罐中。需要注意的是，所有阀门、管路、泵都要经CIP清洗和蒸汽消毒。,（二）发酵过程 1.发酵设备 常规的发酵设备，如医药行业和乳品行业中的设备都无法满足乳酸菌发酵剂的工业化生产的需要，而现行的设备综合了上述两种行业发酵设备的特点：即包括蒸汽灭菌、无菌罐装和就地清洗(CIP)等内容。大规模生产浓缩型乳酸菌发酵剂需要机械搅拌式生物反应器。,2.发酵过程 将经超高温灭菌后的培养基打入预先灭过菌的发酵罐中，缓慢搅拌。借助控温系统调整发酵罐温度，直到达到微生物所要求的培养温度为止。接下来用离心泵向新鲜培养基接种母发酵剂，接种量通常为12，然后开始发酵，并依据发酵菌种的特性对发酵参数进行控制，以便获得最大的菌体生物量。,3.发酵控制参数 发酵控制参数包括搅拌速度、温度、pH值等，在某些情况下还包括氧化还原电位和营养物质的浓度。通常在对数末期或稳定期初期终止发酵，发酵结束后应迅速将发酵培养液冷却到515，制冷设备可以采用管式热交换器，也可以采用发酵罐夹层的循环水（12）进行冷却。发酵过程pH值应严格控制在±0.1个单位，可以采用氨水作为中和剂，并从发酵罐顶部靠着pH电极缓缓加入。 发酵生产乳酸菌发酵剂过程中，有三个重要的限制菌种生长的因素：即营养物质供给存在限制、有毒代谢产物的积累和菌体“过度拥挤”。其中，有毒代谢产物的过度积累可能会严重影响乳酸菌发酵剂，特别是对乳酸球菌发酵剂的生产。,（三）菌体收集和浓缩 可以采用离心分离和超滤来收集发酵培养液中的乳酸菌菌体。通常，温度会影响到离心分离的效果虽然高温有利于菌体分离，但温度太高容易损伤细胞，导致细胞活力和活菌数下降