A1_核酸化学_DNA2004.ppt
复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的结构与特性,复旦大学生物化学系,黄伟达,Watson-Crick的DNA双螺旋,2.0 nm,结构特征,复旦大学生物化学系,黄伟达,双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直,稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用）,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的分子形状,原核生物的基因组DNA（即染色体）、质粒（plasmid）DNA，和一些病毒DNA，呈环状。 真核生物的染色体DNA，大部分噬菌体DNA，和一些病毒DNA，呈线状。,复旦大学生物化学系,黄伟达,环状DNA引发的 拓扑学问题,复旦大学生物化学系,黄伟达,细菌质粒DNA的不同状态,松弛型,超螺旋,部分解链,复旦大学生物化学系,黄伟达,正螺旋和负螺旋,DNA双螺旋为右旋螺旋。细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋，即右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。 正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋。,正超螺旋 左旋,负超螺旋 右旋,复旦大学生物化学系,黄伟达,不同形状的DNA分子在琼脂糖中的迁移率,松弛型，OC, Open circular DNA,超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNA,Linear DNA,从细菌抽提得到的质粒DNA 样品中不含线状DNA,复旦大学生物化学系,黄伟达,从大肠杆菌用常规方法得到的质粒DNA经常是这个样子,?,电泳方向,线性化前,线性化后,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA复制过程中形成的链状分子(catenanes) 需要拓扑酶来帮助解离,复旦大学生物化学系,黄伟达,真核生物的DNA不裸露,平均每200bp的DNA绕核小体左旋1.75转，因此真核生物的DNA分子为正超螺旋,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的一级结构分析,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的序列测定（1）化学法,Maxam /Gilbert法,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的序列测定（2）ddNTP法,Sanger法,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA测序结果,复旦大学生物化学系,黄伟达,到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。刷卡看病的时代即将到来。 注： 人与人之间平均 1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共在300 万个碱基上可能存在差异。,SNP：single nucleotide polymorphism,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA重组技术的基础,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA与限制性内切酶,双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。,复旦大学生物化学系,黄伟达,大部分限制性内切酶识别的碱基序列均为 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内扮演的却是防御外来DNA入侵的国防军的作用。如何不把自身的DNA也降解了呢？,复旦大学生物化学系,黄伟达,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA重组示意图,EcoRI与DNA的复合体,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的变性与复性,人基因组中重复序列的发现,复旦大学生物化学系,黄伟达,分子的变性,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的变性在紫外吸收上的变化,1.37倍,Hyperchromic effect 增色效应,1 OD260 DS DNA 50 g SS DSA 37 g RNA 40 g,不同来源DNA的变性曲线,复旦大学生物化学系,黄伟达,盐浓度对DNA变性的影响,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA分子的Tm与GC含量有关,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA浓度与复性时间的关系,T1/2 × C const,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA复性与Cot分析,复旦大学生物化学系,黄伟达,Cot曲线的另一种表达形式,复旦大学生物化学系,黄伟达,人DNA的Cot曲线,哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。,复旦大学生物化学系,黄伟达,分子杂交、PCR等技术,复旦大学生物化学系,黄伟达,DNA的分子杂交技术,复旦大学生物化学系,黄伟达,聚合酶链反应（PCR）原理,PCR是应用最广的分子生物学技术，在DNA测序中只用了单链扩增技术，所产生的模板DNA并不指数上升，而只以热循环数为倍数。,复旦大学生物化学系,黄伟达,足迹法原理(Footprinting),复旦大学生物化学系,黄伟达,利用足迹法确定 RNA 聚合酶结合位点的实验,
