《微生物学实验》（南京工业大学） .pdf

微生物学实验室（二） 生物工程与技术基础实验与工程实训中心 微生物学实验教学讲义微生物学实验教学讲义 制药与生命科学学院生物工程专业 编者：徐虹、李霜、陆利霞 等 2005 年 3 月 制药与生命科学学院生物工程专业 编者：徐虹、李霜、陆利霞 等 2005 年 3 月 生物秀- 专心做生物 w w w . b b i o o . c o m 实验须知实验须知 普通微生物学实验课的目的是： 训练学生掌握微生物学最基本的操作技能； 了解微生物 学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验；培养学生观察、思 考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢 于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1. 每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理和方法，做到心 中有数，思路清晰。 2. 认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记 下每次观察的现象和结果，以便分析。 3. 实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4. 实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛菌试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告知道教师，及时处理， 切勿隐瞒。 5. 实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关 掉火源，在用湿布或沙土掩盖灭火。必要时使用灭火机。 6. 使用显微镜或其他贵重仪器时，要细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力 求节约，用毕后仍放回原处。 7. 每次实验完毕后，必须把所有的仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如 有菌液污染桌面或其他地方时，可用 3%来苏尔液或 5%石炭酸液覆盖 1.5h 后擦去， 如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗 涤前须浸泡在 3%来苏尔液中进行消毒。 8. 每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师制定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9. 每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真 回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10. 离开实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等。 目录 实验一实验一 细菌的简单染色细菌的简单染色9 实验二实验二 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色12 实验三实验三 细菌的特殊染色细菌的特殊染色14 实验四实验四 酵母菌的形态观察酵母菌的形态观察17 实验五实验五 霉菌的形态观察霉菌的形态观察19 实验六实验六 微生物大小的测定微生物大小的测定22 实验七实验七 培养基的制备培养基的制备 25 实验八实验八 干热灭菌干热灭菌 31 实验九实验九 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 33 实验十实验十 紫外线灭菌紫外线灭菌 36 实验十一实验十一 微孔滤膜过滤除菌微孔滤膜过滤除菌38 实验十二实验十二 微生物接种技术微生物接种技术40 实验十三实验十三 微生物的分离与纯化微生物的分离与纯化47 实验十四实验十四 微生物的培养特征微生物的培养特征51 实验十五实验十五 厌氧微生物的培养厌氧微生物的培养53 实验十六实验十六 微生物血球计数板直接计数法微生物血球计数板直接计数法58 实验十七实验十七 微生物的平板菌落计数法微生物的平板菌落计数法62 实验十八实验十八 细菌生长曲线的测定细菌生长曲线的测定65 实验十九实验十九 土壤中放线菌的筛选及形态观察土壤中放线菌的筛选及形态观察68 附录附录 1 实验室意外事故的处理实验室意外事故的处理72 附录附录 2 实验器皿的清洗与包扎实验器皿的清洗与包扎73 附录附录 3 实验用培养基的配制实验用培养基的配制75 附录附录 4 酸碱指示剂的配制酸碱指示剂的配制(按笔画顺序排列按笔画顺序排列) .79 附录附录 5 实验用染色液及试剂的配制实验用染色液及试剂的配制80 I 微生物的染色与形态结构的观察微生物的染色与形态结构的观察 微生物由于个体微小，需借助普通光学显微镜、相差显微镜等设备来进行观察，其中用相差 显微镜可以直接观察微生物的形态特征， 但其应用有局限性； 用电子显微镜可以观察到微生 物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限 制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而微生物 细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的 明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通显微镜观察细菌时， 往往要先将细菌进行染色， 借助于颜色的反衬作用， 可以清楚地观察到细菌的形状及某些细 胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态 结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。 www.bbioo.com 实验一实验一 细菌的简单染色细菌的简单染色 一、目的要求一、目的要求 1. 掌握细菌简单染色法。 2. 通过简单染色法比较细菌菌体细胞形态和排列方式。 二、基本原理：二、基本原理： 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。 根据实验目的不同， 可分为简单染色法、 鉴别染色法和特殊染色法等。 常用碱性染料如美蓝、结晶紫等对细胞进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱 酸性溶液中， 细菌细胞通常带负电荷， 而碱性染料在电离时， 其分子的染色部分带正电荷 （酸 性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷） ，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌接合 使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。 三、实验材料三、实验材料 1. 菌种：乳酸链球菌（streptococcus lactis） 、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 红螺旋菌 （rhodospirillum sp.） 。 2. 染料：吕氏美蓝染液、草酸铵结晶紫染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检。 （1）涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一 小滴无菌水于载玻片中央，用接种环 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水 滴混合均匀，涂成一薄层。 图 1-1 简单染色的固定 （2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 （3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动 34 次，共约 34 秒。要求玻片温度不超过 60，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图 1-1） 。 固定的目的是： 杀死微生物，固定其细胞结构； 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； 改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 （4）染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液） ，覆盖玻片涂菌部份，染色 1 分钟。 （5）水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 （6）干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 （7）镜检。 油镜观察： 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后， 用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 （8）显微镜用毕后的处理： 上升镜筒，取下载玻片。 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头， 以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，影响观察。 切忌用手或其他纸擦拭镜头， 以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，影响观察。 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告五、实验报告 根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题六、思考题 1. 制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3. 如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4. 简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？ 实验二实验二 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 一、目的要求一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理：二、基本原理： 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1. 碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2. 媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3. 脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是 95%的乙醇。 4. 复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解， 对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。 一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚， 经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别， 也有物理结构不同的结果， 例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料三、实验材料 1. 菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 染料：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇、 擦镜纸等。 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥固定 草酸铵结晶紫染色 水洗 路哥氏碘液媒染 95%酒精脱色 水洗 蕃红复染 水洗 干燥镜检 应注意，碘液媒染 30 秒钟后，直接用 95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作， 反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各菌的形状、颜色） 六、思考题六、思考题 1. 什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过 24 小时？ 2. 热固定的目的是什么？ 3. 什么大多数细菌染色用碱性染料而不用酸性染料进行染色？ 4. 指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之。 约约 60 秒秒 30-60 秒秒 约约 30 秒秒 实验三实验三 细菌的特殊染色细菌的特殊染色 一、目的要求：一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理：二、基本原理： 芽孢染色：芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子（endospore） ，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色， 而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色， 有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时， 此染料可以进入菌体及芽孢使其着色， 而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液） ，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色：荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料：三、实验材料： 1. 菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：营养琼脂斜面培养 20h 肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides） ：肉汁等斜面培养 20h 2. 染料： （1）芽孢染色用 7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液） 。 （2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤：四、实验方法与步骤： 芽孢染色：芽孢染色： 1. 孔雀绿染色法： 取一干净载片按无菌法取枯草芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处 滴加 7.6%的孔雀绿饱和水溶液，在微火上加热，染色 10 分钟后，用水冲洗，再用 0.5% 蕃红花红液染色 1 分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。 2. 石炭酸复红染色法： 在一支小试管（10*100mm）中，滴入 3-4 滴蒸溜水，用接种环取枯草芽孢杆菌于水 中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3-4 滴) 石炭酸复红 液摇匀。将此试管放入沸水浴中煮 10-15 分钟，使芽孢及菌体着色。取此菌液 2-3 环在洁 净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色， 再用吕氏美蓝液复染 1-2 分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检， 结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。 荚膜染色法荚膜染色法 1. 方法 刚果红染色 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或 悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加 1%HCl 冲洗，使涂片呈蓝色；用 蒸馏水漂洗，除去 HCl； ，用美蓝复染 1 分钟，水洗，自然干燥后镜检。 镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背 景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。 荚膜不着色的部分宽。 2. 方法 湿墨汁法 （1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 （2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸 收多余菌液。 （3） 镜检。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3. 方法 Anthony 氏法 （1） 涂片、固定：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 （2） 染色：用 1结晶紫水溶液染色 2 分钟。 （3） 脱色：用 20%CuSO4水溶液洗，再用毛边纸吸干。 （4） 镜检并观察结果：荚膜淡紫色，细胞深紫色。 五、实验报告五、实验报告 绘出所观察细菌的特殊结构。 六、思考题六、思考题 1为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 2组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么? 3试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。 实验四实验四 酵母菌的形态观察酵母菌的形态观察 一、目的要求一、目的要求 1. 学会对酵母菌制片的方法。 2. 观察酵母菌的形态、死活细胞的鉴别及出芽生殖方式。 3. 掌握真菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理：二、基本原理： 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍。大多数酵母以出芽方 式进行无性繁殖； 有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。 本实验通过美蓝染液水浸片 和水 碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌的活细 胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的 氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母菌活细胞是无色的、而死细胞或代谢 作用微弱的衰老的细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 三、实验材料：三、实验材料： 1. 菌种：酵母菌（Saccharomyces.sp） 、产朊假丝酵母（Candida utilis） 。 2. 溶液或试剂：0.05%和 0.1%吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用碘液。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片等。 四、实验方法与步骤：四、实验方法与步骤： 1酵母菌形态与死活细胞的鉴别酵母菌形态与死活细胞的鉴别 （1）美蓝浸片的观察 1 在载玻片中央滴加一滴 0.1 吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取 少量酵母菌落（苔）放在染色液中，轻轻混合均匀。 注意：染色液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气 泡而影响观察。 2 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在 菌液上。注意避免气泡的产生。 将制片放置约 3min 后镜检， 先用低倍镜， 然后用高倍镜观察酵母菌的形态、 出芽、 假丝等情况，并根据颜色来区别死活细胞。 染色约 30min 后再次观察，注意死细胞数量是否增加。 用 0.05%吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。 (2) 水碘液浸片的观察 在载玻片的中央加一小滴革兰氏染色用的碘液， 然后在其上加 3 小滴水， 取少许酵母菌 落（苔）放在水碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检观察，并记录酵母菌的形态。 五、实验报告：五、实验报告： 酵母菌形态与死活菌体鉴别结果： 1. 绘图表示所观察到的酵母菌的单个、出芽生殖、假菌丝等形态； 2. 描述不同染色时间时酵母菌的死活细胞颜色及其数量变化； 3. 描述不同染色液浓度时死活细胞数量的变化。 六、思考题：六、思考题： 1. 吕氏碱性美蓝染色液浓度和染色时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析原 因。 2. 在显微镜下酵母菌有哪些突出的特征区别于一般的细菌？ 实验五实验五 霉菌的形态观察霉菌的形态观察 一、目的要求一、目的要求 1. 学会对霉菌的制片方法。 2.了解和熟悉毛霉、根霉、曲霉、青霉的形态构造。 二、基本原理：二、基本原理： 霉菌除少数为单细胞外，基本构造都是分枝或不分枝的菌丝。菌丝体无色透明或呈暗褐色至 黑色；或呈现鲜艳的颜色。 在固体培养基上长成绒毛状或棉絮状。菌丝内部构造在显微镜下观察时皆呈管状。低级的霉 菌其丝状管道中无横隔， 因此其菌丝体内含有许多细胞核。 而在一些比较高等的霉菌丝状管 道中皆有横隔，由横隔将菌丝隔成许多细胞。 霉菌的繁殖方式很多，有各种各样无性及有性的繁殖方式，是分类时的重要依据，另外菌丝 体与菌落形态的特征也是鉴别的依据。 霉菌菌丝和孢子通常比细菌和放线菌粗得多。 常是细 菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此用低倍镜即可观察。观察霉菌形态有多种方法，常用的有 以下三种： 直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石炭酸溶液中，制成霉菌制片镜检。用此溶液制成的 霉菌制片的特点是：细胞不变形、具有防腐作用、不易干燥、能保持较长时间、能防止孢子 分散等。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。 载玻片培养观察法（如图 5-1） ：用无菌操作将少量培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖 玻片培养， 霉菌即在载玻片与盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。 培养一定时间后， 将载玻片上的培养物置显微镜下观察。 这种方法可以保持霉菌的自然生长状态， 还便于观察 不同发育期的培养物。 玻璃纸培养观察法：霉菌与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似。该方法用于观察不同生长阶 段的霉菌的形态，也可获得良好的效果。 三、实验材料：三、实验材料： 1. 菌种： 毛霉(Mucor sp.)、 根霉 （Rhizopus sp.） 、 曲霉(Aspergillus sp.)、 青霉(Penicillium sp.)。 2. 溶液或试剂：乳酸石炭酸液 A ：载玻片培养正面图 B：载玻片培养侧面图 1.培养皿 2.搁棒 3.载玻片 4.培养基及微生物培养物 5.盖玻片 6.滤纸 图 5-1 载玻片培养示意图 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸、接种环、接种钩、载玻片、盖玻片等。 四、实验方法与步骤：四、实验方法与步骤： 霉菌形态的观察直接制片观察法霉菌形态的观察直接制片观察法 观察霉菌时，除直接观察斜面或平皿的菌落外，制取霉菌标本时，由于菌丝粗大而且孢子很 容易分散， 放在水中观察细胞容易变形， 因此， 在制作标本时不用水， 而用乳酸石炭酸溶液。 取霉菌菌丝时，用接种环（钩）挑取时，要选择长有无性孢子的菌丝来观察。 1. 根霉的形态观察 根霉由营养菌丝体产生匍匐菌丝向四周蔓延， 并由匍匐菌丝生出假根接触培养基， 与假 根相对方向上生长出孢囊梗，在其顶端形成孢子囊，内生孢囊孢子。 根霉的菌丝内部无横隔， 只有在匍匐菌丝上形成厚垣孢子时才发生横隔。 孢子囊成熟后 破裂，在孢子囊的囊轴明显呈球性或近似球形。囊轴基部与柄相连出成囊托。 （1） 用肉眼观察根霉在斜面或平皿上的生长情况。 （2） 置培养皿于显微镜下，用低倍镜观察孢子囊柄，孢子囊，假根等形态。 （3） 在洁净的载玻片上，滴加乳酸石炭酸液一滴，用接种针钩挑取少量菌丝体，加 盖盖玻片，置于显微镜下观察孢子囊柄、囊轴、孢子形状和厚垣孢子等形态。 2. 毛霉形态观察 毛霉的菌丝体大多数为单细胞，在基物上或基物内能广泛的蔓延，无假根和匍匐菌丝。 孢囊梗直接由菌丝体生出，一般单生，分枝或较少不分枝的。分枝顶端都产生孢子囊， 孢子囊呈球形、椭圆形。大多数种类孢子囊成熟后，其壁易消失或破裂，但留有残迹， 囊内部有囊轴。 （1） 用肉眼观察毛霉在斜面或平皿上的生长情况。 （2） 置培养皿于显微镜下，用低倍镜观察孢子囊柄的粗细，孢子囊形状、大小、色 泽。 （3） 制片（方法同上）观察孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及厚垣孢子的形态。 3. 曲霉形态观察 曲霉的营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成， 无色或有明亮的颜色。 分生孢子梗是 从特化了的厚壁、而膨大的菌丝细胞（足细胞）生出，并略垂直于足细胞的长轴。分生 孢子梗大都无横隔，常在顶部膨大成可孕性顶囊，顶囊表面产生小梗，放射生出。分生 孢子自小梗顶端相继形成，最后成为不分枝的链。由顶囊、小梗以及分生孢子链构成分 生孢子头，具有各种不同的颜色和形状，如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。 （1） 用肉眼观察曲霉在斜面或平皿上的生长情况。 （2） 用低倍镜观察长于培养基上的曲霉的分生孢子形状。 （3） 制片（方法同上） ，用接种钩挑取菌落边缘的嫩菌丝，小心放在载玻片上，观 察菌丝有无横隔及分生孢子着生情况。 必要时用水或酒精洗去部分分生孢子。 4. 青霉形态观察 青霉的营养菌丝体无色，淡色或鲜明的颜色，具横隔，气生菌丝密毡状，松絮状或 部分结成菌丝索。分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出，稍垂直于该菌丝，其先端生 有扫帚状的分枝轮称为帚状枝。 帚状枝是由单轮或二次到多次分枝系统构成， 对称或不 对称，最后一级分枝产生孢子的细胞称为小梗。着生小梗的细胞称为梗基，支持梗基的 细胞称为副枝。小梗用断离法产生分生孢子，形成不分枝的链。 （1） 用肉眼观察青霉菌菌落的颜色，组成同心环，汗珠，及菌落背面的颜色。 （2） 用低倍镜观察长于培养皿中青霉菌帚状的形态。 制片（同前述）观察菌丝的分隔情况，分生孢子柄，粗枝，细枝，大梗，小梗，分生孢 子的形状、颜色。 五、实验报告五、实验报告 霉菌形态的观察： 把所有观察到的根霉、毛霉、曲霉、青霉绘图并注明各部分的名称 六、思考题六、思考题 1. 列表比较各类霉菌在形态结构上有何异同？ 2. 你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？ 实验六实验六 微生物大小的测定微生物大小的测定 一、目的要求一、目的要求 1 掌握使用显微测微计测定微生物细胞大小的方法。 2 增强微生物细胞大小的感性认识。 二、基本原理二、基本原理 微生物细胞大小， 是微生物的形态特征之一， 也是分类鉴定的依据之一。 由于菌体很小， 只能在显微镜下测量。用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺，如图 6 -1。 图 6-1 目镜测微尺（A） 、镜台测微尺（B）及其校正（C）与测量（D） 镜台测微尺（图 6-1，A）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般 1mm 等分为 100 格，每格长 0.01mm（即 10m） 。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正 目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺（图 6-1，B）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分 刻度，分为 50 小格和 100 小格两种。测量时，需将其放在接目镜的隔板上，用以测量经显 微镜放大后的细胞物象。 由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同， 目镜测微 尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜 台测微尺进行校正， 以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下， 目镜测微尺每小格所 代表的相对长度。 然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数， 即可计算出细胞的实际大 小。 球菌用直径来表示其大小；杆菌、酵母菌则用宽和长的范围来表示 三、实验材料：三、实验材料： 1 菌种：酵母菌（Saccharomyces.sp）培养液。 2 仪器或其他用具：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片等。 四、实验方法与四、实验方法与步骤：步骤： 1. 目镜测微尺的校正： （1）放镜台测微尺 将镜台测微尺有刻度的一面朝上放在显微镜载物台上，不可放反。 （2）校正 先用低倍镜观察，调整焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜 测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。 利用移动器移动镜台测微尺， 使两尺在某一区域内 两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图 6-1， C） 。 用同样的方法换成高倍镜进行校正。 （3）计算 由于已知镜台测微尺每格长 10m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下， 目镜测微尺每格所代表的长度。 目镜测微计每格长度（m） 2. 微生物大小的测定： 目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺。在载玻片上滴加一滴酵母菌悬浮液，再盖上盖玻 片（注意：避免产生气泡） ，然后置于载物台上。调整焦距，先用低倍镜测定，再用高倍镜 测定。测定时通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的长、宽所占目镜测微尺的格 数， 最后将所测得的格数乘以目镜测微尺相应倍数下每格所代表的长度， 即为该酵母菌的实 际长度。 通常测定对数生长期的菌体来代表该菌的大小。选择具有代表性的 5 个细胞进行测定。 3. 测定完毕 将镜台测微尺用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存，同时正确清理、维护显微镜。 五、实验报告：五、实验报告： 1. 将目镜测微尺的校正结果填入下表： 表 1. 目镜测微尺的校正 两重合线之间镜台测微尺的格数×10 两重合线之间目镜测微尺格数 接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺 格数 镜台测微尺 格数 目镜测微尺每格所代表 的长度（m） 低倍镜 高倍镜 2. 酵母菌测定结果填入下表： 表 2. 酵母菌的大小测定结果 宽 长 接物镜 倍数 目镜测微 尺每格所 代表的长 度（m） 酵母菌 编号 目镜测微 尺格数 长度 （m） 目镜测微 尺格数 长度 （m） 菌体大小范围 （m） 1 2 3 4 低倍镜 5 1 2 3 4 高倍镜 5 六、思考题六、思考题： 1. 为什么使用不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校 正？ 在不改变目镜和目镜测微尺， 而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体的大小时， 其测定 结果是否相同？为什么？ II 培养基的制备培养基的制备 实验七实验七 培养基的制备培养基的制备 一、目的要求一、目的要求 了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法和步骤。 二、基本原理二、基本原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质， 用以培养、 分离、 鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源、氮源、能源、无 机盐、生长因素等，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的 不同，所以培养基的种类很多。另外，不同的微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养 基的 pH 一般是偏酸的， 而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 （嗜碱细菌和 嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适 的范围。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对 一般细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏 1 号培养基，培养酵母菌、霉菌则用 麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯培养基（PDA），有时也常用马丁培养基分离霉菌。 马丁培养基除含有霉菌所需的各种营养物质外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌， 链霉菌可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。 此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培 养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗 养分和改变培养基的酸碱度所带来不利的影响。 三、实验材料三、实验材料 牛肉膏、 蛋白胨、 琼脂、 可溶性淀粉、 葡萄糖、 孟加拉红、 链霉素、 1mol/L NaOH、 lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号 笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g，琼脂 1520g，水 1000mL，pH7.47.6 1称药品 按实际用量计算后， 按配方称取各种药品放入大烧杯中。 牛肉膏可放在小烧杯或表面皿 中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加 热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。 蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药 品完全溶解后再补充水分至所需量。 若配制固体培养基， 可将一定量的液体培养基分装于三 角瓶中，然后按 1.52.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌 和加热溶化同步进行，节省时间。 在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以 免离子进入培养基中，影响细菌生长。 在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以 免离子进入培养基中，影响细菌生长。 3 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检 测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精密 的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。 应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是 供一般使用的培养基，这步可省略。 5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图 7-1）。分装时可用漏斗以免 使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装时可用漏斗以免 使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过 其容积的一半为宜。半固体培养基(指液体培养基中添加 0.6-0.8%的琼脂)以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。 棉塞的形状、 大小和松紧度 要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总 长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱 布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若 培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然 后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 8灭菌 将上述培养基于 121湿热灭菌 20min。 如因特殊情况不能及时灭菌， 需保存在冰箱中。 9摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长 度不超过试管总长的 1/2（图 7-2）。 10无菌检查 将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 2448h，