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蛋白质组学实验,2012.09,考 试 安 排,科 学 素 质：10% 实 验 操 作：10% 实验结果与报告：40% 实验原理测验： 40%,科 学 素 质,课堂提问 原始实验记录 团队合作 课堂纪律,仪器、用具的使用 台面整洁 考勤 卫生值日,实 验 操 作,1、平时表现 2、以其中两次实验的操作为主要评分依据。,实验结果与报告,根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。,实验原理测验,考试时间：第8周 考试地点：本实验室 考试形式：笔试 考试内容： 实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。,实 验 一,目的基因的原核表达、纯化及鉴定,实验目的,掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 掌握考马斯亮蓝染色的方法,目的蛋白质的诱导表达 目的蛋白质的纯化 目的蛋白质的检测,实验原理,转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白,1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1.确定表达时间和温度的最佳条件 2.分析蛋白溶解性 3. SDS-PAGE, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化,（一）,目的蛋白的原核诱导表达,实 验 目 的,掌握蛋白质诱导表达的原理 学习蛋白质诱导表达的方法 了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点,背景理论知识,Section 1,蛋白质的表达是指为获取大量的目标蛋白而进行的有目的性的蛋白质合成。 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其他载体，然后导入活细胞，外源基因可在宿主细胞高效表达，从而获得有重要价值的蛋白质产品。 包括外源基因的克隆、转录、翻译、加工、分离纯化。 进行大量表达和纯化是为了在体外进行功能分析。,外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品,需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞,克隆获得目的基因,酵母表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 表达的蛋白具有正常的活性、构象 技术难度较大、耗时、耗资,大肠杆菌表达系统 实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备 不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体,原核细胞表达系统 真核细胞表达系统,蛋白质表达系统,大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。,原核表达的特点,细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, 要求cDNA 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体,在E.Coli中表达重组蛋白： 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 充分诱导: 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 非诱导条件下: 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录,实验原理,目的蛋白质的诱导表达 lacI （Lactose） lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。 IPTG（异丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。,实验原理,E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。,原核表达系统菌株 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 经典的E. coli BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。 大名鼎鼎的BL21(DE3) 则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。,原核表达质粒的构建 目的基因 表达载体,表达载体 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 元件 启动子、终止子、核糖体识别序列 诱导性表达所需要的元件 操纵子序列 调控基因 多克隆位点 融合Tag 复制起始序列 筛选标记/报告基因 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。,启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子， 转录终止子 核糖体结合位点,启动子、终止子、核糖体识别序列,操纵子序列及配套的调控基因,诱导性表达所需要的元件,多克隆位点 复制起始序列,筛选标记/报告基因表达 抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。 GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因，半乳糖苷酶，荧光素酶。,常用表达载体 pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。 Ptac Promoter Amp pGEX KG GST （26kDa） pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 T7 Kana pET-DSBA 6 His Tag （660Da-2kDa）,pET系列,pGEX系列,DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。 影响转录水平的因素：强启动子，强终止子等。 影响翻译水平的因素：SD序列，mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。,影响表达效率的主要因素,优化表达 （1）,增加蛋白质溶解性及折叠: 温度: 37C 蛋白质以聚集的形式表达-包涵体 30C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成 稀有密码子: 多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E. Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止 毒性基因和质粒稳定性: 抗生素的使用 补充葡萄糖,提高翻译水平： 调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增加mRNA稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象）,优化表达 （2）,实验操作,Section 2,实验器材,1、E. coli BL21(DE3)/pET-DSBA 每组同学（30ml菌液/三角瓶） 2、IPTG （乳糖结构类似物） 3、LB(Ampr) 4、摇床 5、离心机,实验步骤(1),原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。 挑取单菌落于2 mL Amp+ LB培养基37振荡培养过夜。（已做） 以1%的比例转接于20 mL Ampr LB培养基中， 37振荡培养约1小时至OD600=0.4-0.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。 取1mL菌液,制样作为未诱导对照。 三角瓶中加入IPTG 20 uL至终浓度为0.1mM，继续37振荡培养1 h。,制样： 取1 mL菌液置于1.5 mL EP管中， 12000 rpm离心1 min，去掉上清；其余菌液装入50 mL离心管中，6000 rpm离心5 min，弃上清收集菌体，冰箱冷冻保存。 向1.5 mL EP管中加入25 uL ddH2O，重悬(充分分散细胞)。 加入25 uL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀。 沸水浴5 min(蛋白质变性)，取出后立即置于冰上。 冷却后，冰箱冷藏，备用。,实验步骤(2),实验关键点,诱导和取样时要进行无菌操作。 制备样品时,细菌培养基上清除干净,且要充分悬浮。,如何通过调节IPTG的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？,思 考 题,下 次 实 验,诱导表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测,开始吧！ LETS BEGIN NOW！,