圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)21167菌株产油脂的研究.pdf

圆红冬孢酵母( R h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e s ) 2 1 16 7 菌株产油脂的研究 摘要 近些年，全球石油价格 I 上涨，石油资源紧缺状况日益凸显，国际消息称， 全球石油储量只够用4 0 年，因此，可再生能源资源的开发与利用成为必然。生 物柴油是以动植物油脂为原料与甲醇( 乙醇) 经过酯交换反应制得的长链脂肪酸 酯，安全无毒、燃烧性好、可再生，可咀作为石化燃料的替代品。在适宜条件下， 某些微生物可在体内积累单细胞油脂，例如细菌、酵母和藻类等，尤其是产油脂 酵母生长速率快，油脂含量高，具有广泛的应用前景。 从实验室已有的7 株圆红冬孢酵母( Rt o r u l o i d e s ) 中筛选得到一株油脂含量 较高的菌株2 1 1 6 7 。采用单因子实验对浚菌株产油脂培养基及发酵条件进行优化， 得到最佳培养基配方为( w v ) ：8O 葡萄糖，5 2 2 碳氨比( 00 4 酵母粉) ， 0 1 K H 2 P O a 01 5 M g S 0 47 H z O ，00 2 I - h ) z S 0 4 ，00 0 5 C a C l z ，00 0 1 F e C b “ 6 H 2 0 ，0 0 0 2 Z n S 0 4 7 H 2 0 ，0 0 0 0 2 M n S 0 4H z O ，培养基初始p H 值为40 。 按1 0 ( v v ) ( O D 删，矿3 0 ) 的接种量，在2 8 , 和1 8 0r p m T 振荡培养1 2 0h 。 为降低生产成本，利用产淀粉酶扣囊复膜酵母( S a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r a ) I F O 菌株水解木薯淀粉，以木薯淀粉水解液作为碳源进行分批发酵，菌体生物量达到 2 20g L ，油脂含量达到6 34 ( w w ) 。对2 11 6 7 菌株产生的油脂进行脂肪酸成 分分析，C m o 和c l 总含量达到8 38 ，说明该菌株产生的油脂主要成分为长链 脂肪酸，可以作为合成生物柴油的原料。 实验室获得了一株能产生高活力淀粉酶的扣囊复膜酵母( S f i b u l 啦r a ) 突变 菌株A l l - c ，具有同时水解洳1 ，4 和一1 ，6 糖昔键的能力，非常适合水解木薯淀粉 ( 术薯淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成) 。为了实现木薯淀粉边水解边利用生 产油脂，采用细胞固定化技术，将菌株A 1l c 细胞进行固定，并与游离的圆红冬 孢酵母细胞混合培养。A l1 - c 细胞将术薯淀粉水解转化为单糖，供圆红冬孢酵母 细胞生产油脂。经止交实验分析，获得A l I c 细胞壤佳固定化条件( w v ) ：60 聚乙烯酵，25 海藻酸钠3O 氯化钙，p H 值为8 0 ，4 固定8h 。固定化细 胞最高淀粉酶活力可以达到3 2 53U m L 。经发酵罐1 2 0h 联合培养之后，圆组冬 十目& # # m ± * * i 孢酵母苗体生物量选N 2 01g L ，油脂含量达i t l 5 49 ( w w ) 。 将L 述实验获得的油脂与甲醇在N a O H 催化剂作用下进行酯交换反应制各 生物柴油。反应的工艺参数为：催化剂用量为油脂质量的10 ，醇油库尔比为 6 ：1 ，在6 5 下搅拌，反应10h 经三次酯交换反应，得到可以在空气中充分燃 烧的生物柴油。 关键词：圆红冬孢酵母；油脂；生物柴油：木薯淀粉；固定化 十目* # # mL 论女 S t u d i e so nl i p i dp r o d u c t i o nb yt h ey e a s t R h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e s2 11 6 7 A b s t r a c t R e c e n ly e a r s ，t h ep r i c eo ff o s s i lf u e l si s b e c o m i n gh i g h e ra n dh i g h e r T h e s h o r t a g eo fo i li sm o r ea n dm o r es e v e r e I th a sb e e nr e p o s e dt h a tg l o b a lo i lr e s e r v e s a r ea v a i l a b l ef u ro n l y4 0y e a r s ，t h e r e f o r e ，d e v e l o p m e n ta o du t i l i z a t i o no fr e n e w a b l e o i lr e s o u r c e si si m p e r a t i v eB i o d i e s e l ，n o n t o x i ca n dr e n e w a b l e ，i sp r o d u c e db y t r a n s e s t e r i f i c a t i o no ft r i a c y l g l y c e r o l sf r o ma n i m a lf a t sa n dm e t h a n o l ( a l c o h 0 1 ) ， y i e l d i n gm o n o a l k y le s t e r so fl o n g - c h a i nf a t t ya c i d sw i t hs h o r tc h a i na l c o h o l s U n d e r s u i t a b l ec o n d i t i o n s ，s o m eo l e a g i n o u sm i c r o o r g a n i s m ss u c ha sy e a s t s ，f i l a m e n t o u s f u n g i ，b a c t e r i a , a n dm i c r o a l g a ec a na c c u m u l a t es i n g l ec e i lo i l ( S C O ) I ng e n e r a l ， o l e a g i n o u sy e a s t sa n dm o l d s ，w h i c hc a na c c u m u l a t em u c hm o r el i p i d s h a v er e c e i v e d i n c r e a s i n g a t t e n t i o n A m o n g7s t r a i n so f Rt o r u l o i d e s ，t h ey e a s ts t r a i n2 1 1 6 7 w a s f o u n d t op r o d u c e t h e h i g h e s ta m o u n to fl i p i di ni t sc e l l s “O n e - v a r i a b l e ·a t - a t i m e ' m e t h o dw a su s e d t o o p t i m i z et h em e d i u mc o m p o n e n t sa n dg r o w t hc o n d i t i o n sf o rl i p i dp r o d u c t i o nb ys t r a i n 2 1 1 6 7T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o n e n t sf o rt h eh i g h e s tl i p i d p r o d u c t i o nb ys t r a i n2 1 1 6 7w e r eg l u c o s e8 0g ，5 2 2C N ( 0 0 4gy e a s te x t r a c t ) ，01g K H 2 P 0 4 ，0 15g M g S 0 47 H 2 0 ，0 0 2g ( N H 4 ) 2 S 0 4 ，0 0 0 5g C a C l 2 ，00 0 1gF e C l 3 6 H 2 0 0 0 0 2gZ n S 0 47 H 2 0 ，00 0 0 2gM n S 0 4H 2 0w i t h i nl O O m Ld i s t i l l e dw a t e ra n dt h e i n i d a lp F v a l u eo ft h em e d i u mw a s4 0T od e c r e a s et h ep r o d u c t i o nC 0 8 t ，a m y l a s e s p r o d u c e db yS a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r aI F Ow e r eu s e dt oh y d r o l y z ec a s s a v as t a r c h A f t e rt h es t r a i n2 11 6 7w a sc u l t i v a t e di nt h ef l a s kc o n t a i n i n g80 f w v 1c a s s a v a s t a r c hh y d r o l y s a t ef o r1 4 4h ，c e l lm a s sa n dl i p i dc o n t e n ti nt h ec u l t u r er e a c h e d18 5 g L ，a n d6 32 ( w w ) ，r e s p e c t i v e l y , w h i l ea f t e ri t w a sg r o w ni nt h e2 - 1f e r m e n t o r c o n t a i n i n gt h es a m em e d i u mf o r1 9 2h ，c e l lm a s sa n dl i p i dc o n t e n ti nt h ec u l t u r e r e a c h e d2 20g ，La n d6 34 ( w w ) ，r e s p e c t i v e l yO v e r8 38 o ft h e 恬“ya c i df r o m J i i 十f q 海# 学砚L 忸论Z t h es t r a i n 2 I1 6 7w a sC 1 6na n dC 1 8 i s u g g e s t i n gt h a tt h ef a t t ya c i d sc o u l db eu s e da s 伦e d s t o c kf o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o n A m y l a s ep r o d u c e db ySf i b u l i g e r a A 1I - cC a l l h y d r o l y z e 一I 4a n d - I 6 - g l y c o s i d i cl i n k a g e si nt h ec a s s a v as t a r c h I no r d e rt oc o n v e r tc a s s a v as t a r c hi n t ol i p i d b yRl o t u l o M e sd i r e c t l y t h ec e l l so ft h es t r a i nA 11 一cw e r ei m m o b i l i z e d a n d c o c u l t u r e dw i t ht h ef r e ec e l l so fRt o r u l o i d e s 2 11 6 7A f t e rt h e o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t st h ec o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z a t i o nw e r e ( w v ) ：60 P V A ，25 s o d i u m a l g i n a t e 30 C a C l 2 ，p H 2 8a n dh a r d e n e s sf o r8hI nt h i ss t u d y ，i tw a sf o u n dt h a tt h e i m m o b i l i z e da m y l a s e p r o d u c i n gc e l l so fsn b u l i g e r 。A Il - cc o u l dp r o d u c e3 2 53 U m Lo f a m y l a s ea c t i v i t yW h e nt h ec o - c u l t u r e sw e r eg r o w ni n2 - 1f e r m e n t o r , t h ef r e e c e l l so fRt o r u l o i d e s2 11 6 7c o u l da c c u m u l a t e5 49 r w w 1o i lf r o mt h ec a s s a v a s t a r c hi ni t sc e l l sa n dc e l ld r yw e i g h tr e a c h e d2 01g 1 w i t h i n1 2 0h F o rt h et r a n s e s t e f i f i e a t i o no fs i n g l ec e l lo i l ，t h e y i e l do ff a t t ya c i dm e t h y le s t e r c o u l db em o r et h a n5 00 w h e nt h eq u a n t i t yo fc a t a l y s tr N a O H ) t h em o l a rr a t i oo f m e t h a n o lt ot h eo i l ，r e a c t i o nt i m ea n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew e r el 0 ( b a s e do nt h e o i l ) ，6 ：1 ，6 0m i n u t e sa n d6 5 ，r e s p e c t i v e l yA f t e rb i o d i e s e lw o so b t a i n e df r o ml i p i d i nt h ec e l l so f Rt o r u l o i d e s2 11 6 7 ，i tc o u l db ec l e a r l yo b s e r v e dt h a tl tb u r n e dw e l l K e y w o r d s ：R h o d o s p o r l d i u mt o r u l o i d e s ；s i n g l ec e l lo i l ；b i o d i e s e l ；C a $ S a V Rs t a r c h ； i m m o b i l i z a t i o n 十国# ±学位论文 目录 第一章绪论 微生物油脂 2 产油微生物概述 2 1 产油微生物的种类 1 2 1 1 产油细菌 1 2 12 产油酵母2 2 l3 产油霉菌 3 2 14 产油藻类 3 2 2 产油微生物的优点 5 3 微生物油脂的合成机制 5 3 1 脂肪酸合成的基质 3 2 脂肪酸的生物合成 6 3 3 甘油三酯( T A G ) 的合成 4 影响微生物油脂积累的因素8 4 1 菌种 8 4 2 碳源、氮源及培养基C N 的影响 8 4 3 培养温度的影响 9 44 培养基初始p H 值的影响 9 45 通气量的影响 1 0 4 6 培养时间的影响 1 0 47 培养基中无机盐和微量元素的影响 1 0 5 微生物油脂的应用及研究方向 1 1 5 1 微生物油脂P U F A s 的应用 5 2 微生物油脂制备生物柴油 5 0 微生物油脂研究方向 6 生物柴油制各技术 一1 2 6 1 生物柴油研究现状 1 2 62 生物柴油的制各方法 1 3 6 2 I 酸碱催化法 1 3 6 22 生物酶法 j 4 6 23 超临界浊1 5 6 3 生物柴油几种制备方法的比较 1 5 7 固定化细胞技术一1 6 7 1 固定化细胞的方法 7 1 】共价结台法 7 12 交联法 7 13 吸附法 7 14 包埋法 72 固定化细胞的载体 1 7 1 7 8 研究内容及意义 1 8 第二章圆红冬孢酵母利用木薯淀粉水解液产油脂的研究2 0 1 前言 2 0 2 实验材料与方法2 0 2 I 菌株2 0 2 2 培养基2 0 2 3 试剂 2 4 方法2 2 4 1 培养条件 2 42 扣囊复膜酵母粗淀粉酶液及木水淀粉水解液的制各 2 2 2 43 油腊含量测定 2 44 脂肪酸成分分析2 2 2 45 还原糖，总糖含量测定 2 3 2 46 发酵条件的优化 2 3 3 结果2 4 i 十国洋大学硕L 学位论文 3 】高产菌株的筛选 2 4 3 2 不同葡萄糖浓度对菌体及油脂含量的影响 2 5 3 3 不同碳氮比对菌体及油脂含量的影响 2 6 3 4 培养基初始口H 值对菌体及油脂含量的影响 2 6 35 不同接种量对苗体及油脂含量的影响 2 7 3 6 培养基中添加不同金属离子对菌体及油脂含量的影响 2 8 37 不同木薯淀粉水解液浓度对菌体及油脂含量的影响 2 9 38 以禾薯淀粉水解液利用发酵罐生产油脂3 0 3 9 脂肪酸成分分析 3 I 4 本章小结3 2 第三章游离产油脂酵母与固定化产淀粉酶酵母联合培养直接利用木 薯淀粉生产油脂 3 4 1 前言 3 4 2 实验材料与方法 3 5 2 1 菌株 2 4I 固定化细胞的制作方法 2 42 游离细胞与固定化细胞淀粉酶活力测定 3 6 2 43 确定固定化小球的最佳配比 3 6 2 44 游离圆红冬孢酵母与固定化扣囊复膜酵母联合培养 245 油脂含量测定 3 7 3 7 2 46 脂肪酸成分分析 3 7 2 47 还原糖，总糖测定 3 结果讨论 3 7 31 正交实验确定固定化细胞成球条件 3 2 不同浓度产淀粉酶细胞包埋量结果 3 7 3 9 “ “ ” 基 一 养剂法培试方i 2 2 2 中国海洋 学顾十 位论立 33 游离细胞与固定化细胞产酶曲线 4 0 3 4 不同浓度木薯淀粉对小球稳定性的影响 4 l 35 以木薯淀粉为原料固定化培养发酵罐实验 4 3 3 6 脂肪酸成分分析 4 本章小结 4 5 第四章以微生物油脂为原料制各生物柴油 4 6 I 前言 4 6 2 生物柴油制各方法 4 6 2 1 实验试剂 22 实验仪器 2 3 实验操作 2 3 1 转化阶段 2 32 精制阶段 4 7 4 7 4 8 3 结果 4 8 4 本章小结 4 9 总结与创新点 5 0 参考文献5 2 附录 5 8 发表论文 5 9 个人简历 6 0 致谢6 1 塑竺兰坐壁里坐堕型竺苎竺，竺! ! ! 生塑l ! ! 堕堡兰苎堕塑塑塑 1 微生物油脂 第一章绪论 单细胞油脂( S C O ，s i n g l ec e i lo i l ) 又被称作微生物油艏，是酵母、霉菌和藻类 等产油微生物在一定条件下转化碳水化合物并储存在苗体内的油脂( 颜治等， 2 0 0 3 ) 。长链脂肪酸组成的H 油i 酯约占微生物油脂的8 0 以上，磷脂约占1 0 左右。我们对油脂的脂肪酸成分进行分析，得知其主要为c mc i 8 系脂肪酸。 微生物生命活动重要的代谢产物之一就是油脂，与动植物油脂一样，微生物 油脂在细胞中有两种存在形式：一种是体质脂形式，即作为细胞结构的组成部分 而存在于细胞中，在微生物细胞c p 含量非常恒定，如微生物细胞膜上的磷脂；另 一种是贮存脂形式，油脂在微生物细胞内以脂滴或脂肪粒的形式贮存于细胞质 中，本研究所用的2 1 1 6 7 苗株细胞中，油脂在细胞中形成脂滴。微生物油脂的成 分组成大致类似植物油，主要为中性脂肪酸、游离脂肪酸、磷脂及不皂化物 ( R a t l e d g ee ta l ，1 9 9 3 ) 。 2 产油微生物概述 在适宜条件下，在体内合成的油脂占该微生物细胞于重2 0 以上的微生物称 为产油微生物( O l e a g i n o u s m i c r o o r g a n i s m s ) ( R a t l e d g ee ta l ·2 0 0 2 ) 。 2 】产油微生物的种类 产油微生物分布广泛，种类繁多， 直接利用二氧化碳在光照下台成油脂； 细苗等，而目前产油细菌的研究较少。 包括藻类，如普通小球藻、葡萄藻，可以 异养藻类，原壳小球藻：以及酵母、霉菌、 2 1 1 产油细菌 产油细菌种类比较少，已报道过的有分枝杆菌属( M y c o b a c t e r i u m ) 、捧状杆 塑坚兰塑壁里! ! ! 唑咝! 竺业塑型! ! 堕堡! 兰堕竺竺壅 一 菌属( C o r y 月e b a c t e r i u m ) 、喏 氏菌属( N o c a r d i a ) 、浑浊红球菌( R h o d o c o c c u s 洲“5 ) ( H e c t o re l 刚，1 9 9 6 ) 、弧菌属( V i b r i o ) 等。其中浑浊红球菌在葡萄 糖中生长甘汕三酯的含量能够达到茵体干重的7 6 - 8 7 ( w w ) 。 有些细菌在特殊环境条件F 能够积累油脂，但大多数细菌合成的是复杂的类 脂，只有很少一些种类细菌可以台成作为生物柴油原料的油脂因此细菌只用于 特殊脂肪酸的合成。 细菌脂肪酸合成的基因表达系统已经清楚( A l v a r e z ，2 0 0 2 ；A l e x a n d e re ta l ， 2 0 0 7 ) ，所以，可以利用基因改造手段修饰细菌表达系统来提高油脂积累量。据 报道，利用基因1 = 程改造的大肠杆菌可以直接生产生物柴油，在一批发酵中其脂 肪酸酯的浓度达到l3 9 L ( K a l s c h e u e re ta l ，2 0 0 6 ) 。利用这样方法生产的生物柴 油产量有限，但为微生物步发酵制各生物柴油开辟了一条新的道路。 2 j2 产油酵母 产油酵母种类繁多，受到国内外科研工作者的广泛关注。其中常见产油酵母 菌有：胶红酵母( R h o d o t o r u l am u c i l a g i n o s a ) 、圆红冬孢酵母( 月t o r u l o i d e s ) 、 解脂亚罗威亚酵母( Y a r r o w i a l i p o l y t i c a ) 、弯隐球酵母( C t T p l o c o c c u sa l b i d u n ) 、 斯达氏油脂酵母( L i p o m y c e ss t a r k e y i ) 、产油油脂酵母( L i p o m ys l i p o f e r ) 、出芽 丝孢酵母( T r i c h o s p i r o n p u l l u l a n s ) 、丛生丝孢酵母( T r i c h o s p o r o n p u l l u l a n ) 等( L i u c ta l ，2 0 0 0 ；L i a n ge la l ，2 0 0 6 ) 。斯达氏油脂酵母在其晟适生长条件下油脂含量达 到菌体干重的4 31 ( w w ) ( 徐鑫等，2 0 0 7 ) ；在我们实验室以前的研究中发 现胶红酵母油脂含量能够达到苗体干重的5 22 ( w w ) ( L ie ta l ，2 0 1 0 ) ；通 过基因改造过的解脂亚罗威娅酵母可以直接利用菊粉积累油腊，油脂含量达到 5 06 ( w w ) ( Z h a oe la l ，2 0 1 0 ) 。本研究在后续的试验中成功利用酵母油脂 在N a O H 的催化下，合成了生物柴油。 微生物中油脂的含量与它们的生睦条件有很大关系：碳源充足，氮源相对缺 乏的情况下，微生物缅胞不再增殖，开始在细胞内积累油脂，这是高产油脂酵母 的普遍特征。产油酵母可以利用的碳源种类很多，如葡萄糖、蔗糖、乳糖等，有 些工业淀粉生产的废弃物由于含有丰富的单糖，也可以被许多油脂酵母利用。酵 母转化碳水化合物为油脂的理论转化率为3 2 ，但实际转化率很少超过2 0 ( 薛 飞燕等，2 0 0 5 ) 。 目# m * 日( R h o d o s p o r l d t u m f ¨t o , d e s ) 2 1 1 6 7 菌株产油脂的“ 究 油脂积累量在不同油脂酵母中差别较大，脂肪酸组成上也是如此。酵母中的 油脂主要为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、麻酸。有人对不同酵 母进行分离、筛选得到棕榈油酸的高产酵母菌株，其油脂中5 0l 的成分为棕榈 油酸( 罗玉萍等，1 9 9 5 ) 。绝太多数酵母仅有C 1 6 和C l E 系脂肪酸，主要含棕榈 酸饱和脂肪酸，和油酸不饱和脂肪酸，亚油酸含量一般较少。 2 】3 产油霉菌 除了细菌和酵母，霉菌也能够在特殊的培养条件下合成油腊。常见的产油霉 菌有：土曲霉( A s p e r g i l l u s t e r r e u s ) 、小克银汉霉属( C u n n i g h a m e l l a ) 、轮枝霉 属( D m s p o r a n g i u m ) 、高山被孢霉( M o m e r e l l aa l p i n a ) 、深黄被孢霉( M o r t i e r e l l a i s a b e l l i n a ) 、毛霉属( M u c o r ) 、樟疫霉( P h y t o p h t h o r ac m n a m o m i ) 、水霉属 ( S a p r o l e g n i a ) 、高梁褶孢黑粉菌( T o 扛P o s p o f f z l me h r e n b e r g l i ) 等( 曲威等，2 0 0 6 ) 。 在高浓度葡萄糖( 初始糖浓度达1 0 0 以) 培养基中培养深黄被孢霉( M i s a b e l l i n a ) ，每升发酵液中油脂产量达到l81g ( P a p a n i k o l a o u se ta l ，2 0 0 4 ) 。 霉菌油脂含量高，但大部分产油霉菌只生产特定的油脂例如二十二碳六烯酸 ( D H A ) 、T - 亚麻酸( G L A ) 等( D ue t a l ，2 0 0 7 ：S a k u r a d a n ie ta l ，2 0 0 9 ) 与酵 母苗相同，霉菌的脂肪酸组成也有很大差别，如土曲霉的脂肪酸组成与食用植物 油特别相近。被孢霉属其突变栋能产生蓖麻油酸等，该属霉菌能产生大量的T 一 亚麻酸，而不是常见的d 一亚麻酸。被孢霉突变株M 6 油脂含量为3 28 ( w w ) 7 亚麻酸占到油脂总量的2 69 ( 张俊等，1 9 9 3 ) 。 2 14 产油藻类 许多海洋藻类能产生油脂，很多自养藻类能够直接以二氧化碳为碳源，以光 照作为能源合成油脂，目前常见的产油海藻主要是微藻。微藻油脂含量高，从 微藻中提取得到的油脂成分与植物油的成分相似，因此具有广泛的应用价值，它 不仅可以替代石油作为生物柴油直接应用于工业上还可以作为植物油的替代 品。目前国内外报道较多的是小球藻( C h l o r e l l av u l g a r 打) ，其总脂含量高达细 胞干重的1 2l ( w w ) ，由于藻类生长缓慢且细胞密度较低，因此微藻的油脂 产量不容可观。但是微藻脂肪酸很丰富，尤其是功能性多不饱和脂肪酸，如二十 碳五烯酸( E P A ) 、二十二碳六烯酸( D H A ) 、花生四烯酸( A R A ) 等含量较 圆“ 斑酵母( 肭甜一油“m t o l a i d e s ) 2 1 1 6 7 茁# F 脂的研究 高。目前研究较多的是小球藻属( C h l o r e l l as p ) 和绿色巴夫藻属( P a v l o v a v i r i d i s s p ) ，其E P A 所占油脂成分的比重分别高达2 5 和2 8 ( 殷梦华等，2 0 0 5 ) 。 除自养藻类，有些一样藻类可利用有机碳源柬积累油脂。缪晓玲等通过异养细胞 工程技术获得丁脂类含量高达细胞干重5 5 ( w w ) 的异养藻细胞( 缨晓玲等， 2 0 0 4 ) 。 不同产油微生物油脂含量以及脂肪酸成分差别较大，如表1 1 ( 李梅，2 0 1 0 ) 所示。另外有些藻类所产油脂中还含有相对较多的豆蔻酸( c 他o ) ，其中绿色巴 夫藻与等边金藻分别占总脂古量的1 I5 和1 2O ，而大多数酵母菌和霉菌油脂 中的豆蔻酸含量很低。 表I - l 不同油脂微生物细胞中脂肪酸成分比较( ) ! 竺竺! ! ! ! ! ! ! 竺! ! ! 竺! 竺1 竺1 111 竺竺! ! 竺! 竺竺竺 【f | 脂含棕榈酸棕榈油酸硬脂酸 油酸亚油酸亚麻酸 菌种 量( ) ( c 限o )( c 1 6 1 ) ( C mo ) ( CL z 1 )( c 眦) ( c 僦3 ) 堕塑兰塑壁壁! ! ! ! 塑竺! 坐! ! 竺型塑型! ! 堕壁兰苎塑竺型坚 22 产油微生物的优点 ( 1 1 微生物个体小繁殖迅速 ( 马艳玲，2 0 0 6 ) 。 f 2 1 微生物生产油腊不受场地 产( L ie ta l2 0 0 8 ) 。 生长周期短，易于进行品种改良和基因改造 气候和季节变化等的限制，能连续大舰模生 f 3 1 微生物生长可以利用的原料来源广泛，现在多使用农产品副产物、食品 加工以及造纸业的废弃物作为原料，避免与人类争粮食，还可以起到减少环境污 染的作用，一举两得。 ( 4 1 i 午多微生物能够合成多不饱和脂肪酸，可以用来开发功能性食品。如微 生物油脂中的G L A 、A R A 、E P A 和D H A 等成分。 ( 5 ) 利用微生物突变株，可以获得微生物特有的脂肪酸或新的脂肪酸种类。 ( 6 ) 微生物油脂可以代替动、植物油脂来制造生物柴油，作为新的生物质能 源。 3 微生物油脂的合成机制 微生物发酵生产油脂大体分为两个阶段，即菌体增殖期和油艏积累期。发酵 前期为细胞大量增值的时期这个时期细胞快速消耗培养基中的碳、氮源，以保 持自身旺盛的代谢。当培养基中碳源充足而氮源相对缺乏的时候，细胞分裂速度 减慢，代谢活动主要以消耗碳源并合成和积累油脂为主，即到达油脂积累期。此 时，微生物不再进行细胞增殖，而是将过量的碳水化合物转化为脂类( G i l le ta l ， 1 9 9 7 ) 。微生物产生油脂的过程，本质上与动植物产生油腊的过程相似，都是从 乙酰辅酶A 羧化酶催化羧化的反应开始，然后经过多次链延长，或再经过去饱 和作用等完成整个生化过程。 3 1 脂肪酸合成的基质 微生物在体内积累油脂需要两个必备条件：一是乙酰一C o A 作为脂肪酸合 成的前体；二是充足的N A D H 葡萄糖和苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸的同时 目# 孢# q ( R h o d o s p o r i d i ”m t o r M o i d e s ) 2 1 1 6 7 自椿P 油目“ 充 伴有N A D H 的生成。 乙酰C o A 可由糖氧化分解或由脂肪酸、酮体和蛋白分解生成，该反应 发生在线粒体中，而脂肪酸的合成部位是细胞质，因此乙酰C o A 必须由线 粒体转运至细胞质。这时需要通过柠檬酸一丙酮酸循环( c i t r a t ep y r u v a t e c y c l e ) 来完成，如图卜1 所示，乙酰一C o A 以柠檬酸的形式通过三羧酸运输系 统被运送到细胞质中，在细胞质中，柠檬酸是由A T P 驱动的A T P 柠檬酸裂解反 应转化为草酰乙酸和乙酰C o A 。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用l 、转化为苹果 酸，重新进入循环中。 图1 1 柠檬酸一丙酮酸循环( 王镜岩等，2 0 0 2 ) F i g 1 一IC i t r a t ep y r u v a t ec y c l e 3 2 脂肪酸的生物合成 首先在羧化酶催化羧化下，乙酰- C o A 与C 0 2 合成丙二酰一C o A ，然后经过多 次链延长，或再经去饱和作用等完成整个生化过程。脂肪酸的合成实际上是一个 重复循环的过程，由1 分子乙酰一C o A 与7 分子丙二酰一C o A 经转移、缩台、加氢、 脱水和再加氢重复过程完成。每一次使碳链延长两个碳，最终生成古十六碳或十 八碳的脂肪酸。脂肪酸合成过程如图1 - 2 所示： 目“g 孢B 目( R h o d “p o r i d i u m f 。m 抛，2 1 1 6 7 菌株F m 臼勺“ R 。畦一。“百瓦 。C o A + 8 两峨一C a A 叫还原 N A D F o I B 一疆酞- - A L “ P _ 脱水 舅彳l $ 。 | N A D P H 还原 ； 一 图1 2 脂肪酸的生物合成( 赵舂海，2 0 F i g 1 2B i o s y n t h e s i so f f a t t ya c i d 3 3 甘油三酯( T A G ) 的合成 普遍认为T A G 是生物体内脂肪酸的储存形式，它的主要功能是作为碳源和能 源的储备化台物，一经氧化将产生很高的能量。T A G 合成过程需要多种酶的参与， 磷脂酸( P A ) 和甘油二酯( D 0 ) 是合成代谢中两个关键的中间产物( S o n g e r e ta l ， 2 0 0 3 ) 。P A 的台成存在两条合成途径，即甘油3 磷酸( G 3 一P ) 途径和磷酸二羟 丙酮( D H A P ) 途径。T A G 的合成如图1 3 所示： 圆“g 孢* q ( R h