天然雌激素降解菌的筛选鉴定及其降解特性研究.pdf

。刈 0 t 摘要 捅要 近年来环境雌激素的污染逐渐引起国内外学者的关注，并开始对其在环境中 的污染水平及其生物降解特性等进行探讨。本文从厦门湾、赁笃湖及厦门某污水 处理厂活性污泥中驯化、分离得到1 9 株降解1 7 1 3 一雌二醇( E 2 ) 的好氧菌株，其 中5 株可以降解E 1 ，一株为交替赤杆菌属新种，为含环境激素类废水的生物强化 处理提供了新菌株材料。 本文通过查阅相关文献归纳了E 2 的降解途径，考察了降解菌株对雌酮( E 1 ) 雌三醇( E 3 ) 、睾酮( T ) 和苯酚的降解性能，并推测了T 的降解途径，比较了降 解菌和已报道的E 2 降解菌株K C 8 对E 2 的降解效果，同时考察了K C 8 两株模式 菌株对E 2 的降解性能。主要结论如下： 1 本实验成功地从活性污泥和咸水湖中筛选出1 9 株能降解E 2 的菌株。其 中从咸水湖中分离得到的菌株M H B 为交替赤杆菌属新菌种，查阅相关文献，少 有海水中分离到的雌激素降解菌，只有熊光明等从波罗的海分离到一株E 2 降解 新菌H 5 ( 未鉴定) ，所以本实验分离到的菌株M H B 是目前报道的第一株鉴定的 海水雌激素降解菌。 2 测定了A X B 、A H C F 、A H C 等菌株的分离地点某污水厂中各工艺的3 种 天然雌激素含量，结果表明该污水厂中3 种天然雌激素的含量较高，E 1 、E 2 、E 3 进水浓度分别为8 3 5 5 5n g L 、2 2 2 8 6n g m 和5 5 6 3 0n g L ；出水浓度分别为6 9 3 1 3 n L 、1 3 8 6n g L8 和1 4 1 1 6n g L 。查看了菌株M H B 分离环境赞笃湖和厦门湾中 这3 种雌激素含量，半数以上采样点都检测到雌激素，浓度范围E 1 在 E 2 E 1 E 3 。K o m e r L 5 8 j 等采用该方法对德国 西南部5 家污水处理厂的出水进行研究，结果发现所取9 个样品中雌激素活性很 高，在2 5 2 5 n g E E Q L ( E E Q ：E 2 当量浓度) 之间，这说明污水厂废水排放有可 安徽理工大学硕士学位论文 能是自然水体中雌激素物质的主要来源。现行大多实验方法实验材料来自动物体， 导致实验结果外推到人体时会存在诸多不确定性，该方法所用细胞源于人体，排 除了这种不肯定性，因此检测结果具有更高的可信度。但M C F 一7 细胞培养要求条 件高，成本比较高。 D 重组基因酵母检测法 A r n o l d 等建立了酵母雌激素筛选实验( Y e a s te s t r o g e n s c r e e na s s a y , Y E S ) 来评 价化合物的拟雌激素活性。方法原理：酵母细胞一般不含E R ，重组基因酵母检测 法是将人类雌激素受体基因( H E R ) 片段整合到酵母基因组中的雌激素应答表达 。 子( E I 也) 质粒中，该质粒上还带有编码1 3 半乳糖苷酶的L a c Z 基因。在这个系 统中，H E R 与E R E 组成转录因子，可以调节L a c Z 基因的表达。外界物质与E R 结合后，激活转录因子，促使L a c Z 基因表达生成1 3 半乳糖苷酶分泌到介质中， 在介质里，1 3 半乳糖苷酶可以使1 3 D 吡喃半乳糖苷氯酚发生代谢变化，变成红色， 通过检测1 3 半乳糖苷酶的量就可以定量检测出化学品的类雌激素活性【5 9 】。该方法 灵敏极度，它对E 2 的检测限位l O O f m ，比人类乳癌细胞M C F 7 细胞增殖法和子 宫增重试验高2 5 个数量级。由于筛选是在9 6 孔板上进行，所以可以允许同时筛 选大范围剂量的复合化合物，所需时间仅为3 4 d ，因此又有快速、方便、高通量 的特点。又由于酵母不含E R 不会受其他基因靶的影响，故而克服了E R 和其他肽 类和类固醇类激素受体之间的相互影响。方法无需细胞计数，结果既可定性又可 定量，操作简便易行。不过由于酵母细胞与哺乳动物对激素和毒物的代谢差异很 大，而且细胞膜结构也不相同，可能会使化合物进入酵母细胞与E R 结合受到影响； 此外这种方法不能用于检测雌激素前体物质，对抗雌激素的敏感性低，即便如此， 因其方便快捷仍被广泛应用。国外大约在2 0 世纪9 0 年代开始发展这一方法，至 今已经历多次改进。国内何世华等人于2 0 0 1 年在国内率先建立了基因重组酵母测 评系统，用以检测环境雌激素及其危害性的评价工作，各项指标均达到或超过了 国内外同类检测系统。现在，重组基因酵母法不仅应用于检测多氯联苯( P C B s ) 、 苯胺等化合物的环境雌激素活性，也开始应用于检测家畜粪便废物和化石燃料燃 毒 烧释放物的雌激素活性对环境的影响。 2 化学方法 ， 目前，环境雌激素的化学分析方法主要指的是色谱分析方法，如高效液相色 谱( H P L C ) 、气相色谱( c c ) 用( G C M S ) 等，其中高效 是雌激素最常用的色谱分析 2 文献综述 A 气相色谱( G C ) 及其联用技术 气相色谱法是一种以气体为流动相的柱色谱法，溶于流动相的各组分在经过 固定相时，由于与固定相发生作用( 吸附、分配、离子吸附、排阻、亲和) 的大 小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。G C 法优点： 分离效率高，分析速度快；样品用量少和检测灵敏度高；选择性好，可分离、 分析恒沸混合物，沸点相近的物质；应用范围广，虽然主要用于分析各种气 体和易挥发的有机物质，但在一定的条件下如将待测物进行衍生化反应，也 可以分析高沸点物质和固体样品。G C 法缺点是在对组分直接进行定性分析 时，必须用已知物或已知数据与相应的色谱峰进行对比，或与其他方法( 如 质谱、光谱) 联用，才能获得直接肯定的结果。在定量分析时，常需要用已 知物纯样品对检测后输出的信号进行校正。 目前，雌激素对水体污染不断加剧，利用气相色谱及其联用技术来测定水环 境中雌激素方面的研究也日益活跃，G C M S 结合了G C 高效率的分离能力和M S 检测器良好的定性能力两方面优势，可以同时对受测物质定性定量，另因其高灵 敏度和高选择性能够适应目前待测环境内分泌干扰物种类繁多与应用领域多样化 的需求，成为目前测定各种环境和生物样品中环境雌激素的主要方法之一。 近年来，G C M S 联用技术取得了很大进展，与G C 一起成为各国对环境雌激 素的检测的标准检测方法。表4 列出了近5 年来采用G C M S 法或G C 法对环境内 分泌干扰物进行检测的部分文献 6 0 6 4 。 安徽理工大学硕士学位论文 表5G C - M S 法测定环境雌激素 T a b l e5D e t e r m i n a t i o no fe n v i r o n m e n t a le n d o c r i n e d i s r u p t o rb yG C - M S B 高效液相色谱法( H P L C ) 及其联用技术 高效液相色谱( H P L C ) 是一种以液体为流动相的柱色谱法，其分离机理是基 于混合物中各组分对两相亲和力的差别，根据固定相和流动相的相对极性不同， 又可以分为正相色谱和反相色谱。H P L C 具有“三高一广一快”的特点，即“高 压”：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色 谱柱，必须对载液加高压；“高效”：分离效能高；“高灵敏度”：紫外检测器 可达0 0 1 n g ，进样量在uL 数量级；“应用范围广”：百分之七十的有机物可 用高效液相色谱，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分 离分析，显示出优势，分离速度快，载液流速快。 H P L C 与G C 比各有所长，相互补充。H P L C 检测器的灵敏度不及气相色 谱，却无需像G C 那样将挥发性差的分析物衍生化成高挥发性物质，实验操作方 便快捷。此外，H P L C 分离分析过程无需高温，可用于热稳定性差的分析物的分离 分析，所以应用更为广泛。 随着科技的不断发展，高效液相色谱联用技术在环境监测方面的应用也日益 广泛。最常用的联用技术是液相色谱与L C M S 及液相色谱串联质谱法谱法 ( L C M S M S ) ，也是目前环境雌激素检测方法 液相色谱和质谱检测器两方面的优势，简化了 选择性和灵敏度，减少了样品介质对分析结果 2 文献综述 染物分析时的检测灵敏度和分析结果的确定性【6 2 】。在实际应用中，除了少数研究 者使用A P I 源外，大部分都使用E S I 离子源接口，负离子状态检测雌激素( E l 、 E 2 、E 3 、E E 2 ) ，正离子检测孕激素和雄激素【6 3 】。因为雌激素和雄激素电离较困难， 灵敏度较低，也有研究者将这些物质进行衍生化生成易电离物质后检测，使得 L C M S 测定雌激素灵敏度大大提高。不过由于L C M S 与L C M S M S 相对昂贵， 而且与常规分析方法相比需要更高的专业技能培训，成为发展的障碍。 2 3 6 天然雌激素的去除途径 环境中天然雌激素的去除途径主要有三种途径：物理降解、生物降解和化学 降解。 1 物理降解 物理降解主要包括蒸发、固体吸附和膜分离。如表1 所示，游离雌激素的蒸 气压非常小，它们的亨利常数很小，因此，常温常压下，天然雌激素很难挥发， 这一途径的去除效率非常有限。所以本文说物理降解主要是指吸附降解和膜分离 法。 A 吸附降解 环境雌激素可吸附在活性炭、有机物、活性污泥上，通过沉淀除去。B r a g a 【6 5 】 等人研究了雌激素通过活性污泥的去除情况，结果表明，污水中的雌激素在初级 处理时的去除率为5 0 7 5 。S 仃e 皿【6 6 】等用F r e u d l i c h 动力学研究了E 2 和E E 2 在 活性污泥和失活污泥上的吸附行为，发现雌激素在污泥上的吸附与p H 值有关，E 2 和E E 2 对污泥吸附剂有高度的亲和力。国内也有相关的研究，有文献报道活性污 泥和失活污泥对雌激素的吸附，研究者们还用具有代表性的雌激素E 1 和E 2 来评 价活性炭吸附的效果，此外，一些影响因素如吸附剂浓度、p H 值以及表面活性剂 和腐殖质等物质对吸附降解效果的影响也有研究【6 7 1 。 B 膜分离法 膜分离技术作为一种痕量有机物的去除方法，在废水处理和高级水制备中正 在得到越来越广泛的应用。与传统处理方法相比，膜处理法有非常显著的优点， 那就是出水质量高，出水含有的有机物浓度极低，且在没有进行化学消毒的情况 下即可去除水红的细菌病毒。对于膜技术去除微污染国内外都有诸多研究，主要 包括两方面，( 1 ) 雌激素的物理化学性质对膜分离效果的影响，( 2 ) 膜结构及其 他影响因素如废水中溶解态的有机质含量对膜截留雌激素能力的影响。A g e n s o n 和U r a s e 【6 8 1 研究了在纳米孔径及反渗透条件下膜分离法对有机污染物去除，发现纳 1 7 安徽理工大学硕士学位论文 米膜对B P A 的去除率随着膜的堵塞程度的增加而不断增加，新膜的去除率为2 1 ， 过滤过废液的膜的去除率为2 9 ，过滤过废液的膜的去除率为6 0 8 ，对反渗透体 系而言，去除效果刚好相反，未经使用的膜、过滤过废液的膜、过滤过废液的膜 对B P A 的去除率依次为：9 6 6 、8 5 、8 2 。 2 化学降解 A 光降解 雌激素由于其结构相当稳定，在自然环境下的降解程度非常微弱。在L a y t o n 所做类似研究中，发现自然光条件下，E 2 和E E 2 发生了光降解，在相同实验条件 置于黑暗环境下的对照组没有发生降解，而且L a y t o n 还发现了在此条件下E 2 和 E E 2 的半衰期分别为1 2 4 h 和1 2 6 h ，对E 2 而言，这比其生物降解要慢得多，对E E 2 而言，对比生物降解光降解更重要，因为他在河水中的生物降解半衰期约为1 7 d 6 9 1 。 此外，C o l e m a n 等【7 川证实在T i 存在下，紫外光可使E 2 发生降解。中国的刘彬7 1 】 研究了E 1 在水溶液中的光降解情况，研究发现在光降解时E 1 发生破环作用生成 羟基氧化物。 B 高级氧化 近些年来，很多学者们研究利用不同的化学氧化剂氧化去除雌激素，这种方 法被称为高级氧化( C A O ) 。随着研究的不断深入和扩展，高级氧化已经成为去除 雌激素的一种有效途径。高级氧化主要机理是：雌激素可以和一些强氧化剂发生 氧化还原反应，最终矿化成二氧化碳或者降解成其他的低分子物质。因此C A O 去 除雌激素的的关键是氧化剂的选择，许多研究为了提高去除效果会将几种氧化剂 联合起来，例如U V 0 3 ，U V H 2 0 2 ，U V F e n d o n 等。这些方法的主要特征就是反 应过程中会产生羟基自由基( 0 H ·) ，而O H ·的氧化还原电位很高( 2 8 0 V ) ，具 有强氧化性，能有效的降解雌激素。因此，所谓高级氧化狭义上是指几种氧化剂 联合的氧化技术。 人们对利用高级氧化去除雌激素的研究主要分为三部分：( 1 ) 高级氧化去除 效率和操作条件的优化研究，( 2 ) 高级氧化去除雌激素的降解动力学研究，( 3 ) 高级氧化对雌激素降解途径的研究。 3 生物降解 生物法是利用微生物自身的代谢过程来降解污染物，目前被污水厂广泛利用 的活性污泥法和生物膜法等就是利用微生物净化废水，因其具有运行成本低、无 二次污染等优点，被称为“绿色”的污染治理技术。 迄今为止，能够降解天然雌激素的微生物菌种资源非常有限。对于雌激素降 2文献综述 解菌的分离研究，国外起步相对较早，在上世纪6 0 年代就已经有学者研究【7 2 1 ，国 内雌激素降解菌研究相对起步较晚。目前，国内外已经发现多株雌激素降解菌， 如表6 所示 7 3 - 9 5 l 。 表6 分离到的雌激素降解菌【7 3 - 9 5 T a b l e6I d e n t i f i e de s t r o g e n d e g r a d i n gb a c t e r i u m 7 3 - 9 5 1 1 9 安徽理工大学硕士学位论文 表6 ( 续) 分类 降解能力与 分离地点参考文献 7 3 - 9 5 1 降解机制 B 变形 菌纲 o e s t r a d i o l i c u m A c B E 2 1 T 降解E 2 ，E 1 活性污泥 ( W e b e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 降解E 2 ，T土壤 将E 2 降解成E l 或将肠道微生 E l 转化为E 2物 ( P a y n ea n dT a l a l a y , 1 9 8 5 ) ( J a r v e n p a ae ta 1 ， 1 9 8 0 ) 无氮情况下降解E 2 ，( F a h r b a c h e ta 1 ， 活性污泥 E 1 2 0 0 6 ) L e p t o t h r i xd i s c o p H o r a产生M n 氧化物氧化 比利时菌 ( S a b i r o v ae ta 1 ， ( L M G8 1 4 2 ) E E 2 种保藏中心 2 0 0 8 ) N i t r o s o m o n a s 共代谢及硝基置换 E E 2 降解E 1 ，E 2 ，E 3 R a l s t o n i a p i c k e t t i iB P 2在E 1 ，E 2 ，E 3 存在下 R a l s t o n i as p 共代谢E E 2 降解E 1 ，E 2 G 变形 A c i n e t o b a c t e rs p L H J l 将E 2 转化为E 1 菌纲 A c i n e t o b a c t e rs p B P 8 A c i n e t o b a c t e rs p B P l 0 E s c h e r i c h i ac o l iK C13 降解E 1 ，E 2 ，E 3 在E l ，E 2 ，E 3 存在下 共代谢E E 2 在E 1 ，E 2 ，E 3 存在 下，共代谢E E 2 ( G a u l k ee ta 1 ，2 0 0 8 ； A T C CS k o t n i c k a - P i t a ke t a 1 ，2 0 0 9 ) 堆肥 口踟1 8e t a l 。， 2 0 0 8 ) 活性污泥 ( W e b e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 沙质含水 ( K ee ta 1 ，2 0 0 7 ) 层 堆肥 p 删e 1 8e ta l 。' 2 0 0 8 ) 堆肥 p 洲1 8 e ta l ， 将E 2 转化为E 1 活性污泥 2 0 0 8 ) ( V ue ta 1 ，2 0 0 7 ) ， 一 ! 茎堕簦垄 表6 ( 续) 分类 降解能力与 分离地点 参考文献降9 5 】 分类 降解机制 分离地点 爹考又眼 1 G 变形菌 纲 P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s aB P 3 P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s aT J1 P s e u d o m o n a s p u t i d a M n B l ( L M G2 3 2 1 ) P s e u d o m o n a s p u t i d a M n B 6 ( L M G2 3 2 2 ) P s e u d o m o n a s p u t i d a M n B 2 9 ( L M G2 3 2 3 ) P s e u d o m o n a ss p B P 7 S t e r o i d o b a c t e r d e n i t r i f i c a n sF S T 降解E 1 ，E 2 ，E 3 在E 1 ，E 2 ，E 3 存 堆肥 在下共代谢E E 2 ( P a u w e l se ta 1 ， 2 0 0 8 ) 代谢E 2活性污泥( Z e n g e ta 1 ，2 0 0 9 b ) 产生M n 氧化物 氧化E E 2 产生M n 氧化物 氧化E E 2 产生M n 氧化物 氧化E E 2 降解E 1 ，E 2 ，E 3 共代谢E E 2 无氮条件下降解 E 2 ，T ' 雄烯二酮 比利时菌种 保藏中心 比利时菌种 保藏中心 比利时菌种 保藏中心 堆肥 缺氧消化污 泥 ( S a b i r o v ae ta 1 ， 2 0 0 8 ) ( S a b i r o v ae ta 1 ， 2 0 0 8 ) ( S a b i r o v ae ta 1 ， 2 0 0 8 ) ( P a u w e l se ta 1 ， 2 0 0 8 ) ( F a h r b a c he ta 1 ， 2 0 0 8 ) 放线菌 A c t i n o m y c e sv i s c o s u s 厌氧降解E 2 和龈下血小板( K o m m a n a n d 门 3 7 8 5孕酮样L o e s c h e ，19 8 2 ) 有氧条件下降解 A g r o m y c e ss p L H J 3 E 2 ，E 3 ，并伴随有沙质含水层( K e e ta 1 ，2 0 0 7 ) E 1 累积 M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s E 2 。E 1 相互转化， 将1 6Q - O H - E 1 肠道微生物 ( J a r v e n p a ae a l ， 1 9 8 0 ) 化为E 3 M i c r 0 6 叩幼妇舾加P 搠 将E 2 转化为E l活性污泥( Y u e ta 1 ，2 0 0 7 ) 将E 2 转化为E l 活性污泥， K C 5 N o c 硼讲。i d e ss i m p l e x 将E 2 转化为E 1 活性污泥 Y ue ta l ( V ue ta 1 ，2 0 0 7 ) 将E 2 转化为 活性污泥， K C 3 2 l 安徽理工大学硕士学位论文 。2 2 r ， 2 文献综述 安徽理工大学硕士学位论文 除了细菌外，真核生物也可以降解雌激素。目前发现一些真菌可以降解雌激 素。2 0 0 4 年，C h o u d h a r y 等【9 6 J 研究雅致小克银汉霉菌( C u n n i n g h a m e l l ae l e g a n s ) 降 解E E 2 ，观察到了E E 2 的羟基化过程，以及羟基基团的甲氧基化过程，而且还发 现该过程产生了一些代谢分子。其实在2 0 0 2 年，S h i 等7 】就从牛棚里采集的样品 中分离出能够降解炔雌醇的真菌层出镰刀菌( F p r o l i f e r r a t u m ) H N S 一1 ，发现了一种 极性比E E 2 强的未知产物累积。S u z u k i 等人( 2 0 0 3 ) 的相关研究中发现酶促降解 完毕后仍然会有雌激素活性，认为是由于某些转化产物所致，不过，他们用液相 a 色谱并未检测到这些转化产物。 另外，一些微藻类也能够转化类固醇类雌激素。2 0 0 2 年，L a i 9 8 】等发现普通小 ， 绿藻能够让E 2 和E l 发生相互转化，在有光无光条件下都可以发生，有光照时， 5 0 的雌二 四尾栅藻、 同的产物。 2 文献综述 很多酶如锰过氧物酶，辣根过氧化物酶，真菌漆酶等【1 0 0 。0 2 1 可以催化天然与人 工雌激素的氧化反应，但是反应过程会产生哪些代谢产物，它们是否会呈现出激 素活性更强的二次污染特征，还有待进一步研究。 根据相关文献，本文对天然雌激素降解途径进行了总结，如图2 所示。其实 天然雌激素降解途径早在4 0 年前就有报道。1 9 6 6 年，C o o m b e 等利用U VM S 和 N M R 研究卡氏菌( N o c a r d i as p E l l 0 ) 对E 1 的降解，首次提出了雌激素降解机制 经由双加氧酶催化A 环裂解【1 0 3 】，如图1 中反应c 1 所示。随着越来越多的研究发 现，无论是好氧、缺氧还是无氧，E 2 的降解通常由生成E 1 开始1 0 4 , 1 0 5 】；对于E E 2 的降解，一般也是先生成E 1 1 0 6 1 ，之后，E 1 再做进一步降解。 如图1 所示，E 1 主要有以下几条降解途径。途径一：E 1 在D 环开环生成内酯 代谢物，之后进一步降解进入三羧酸循环( 反应途径a ) 1 0 5 】。途径二：E 1 经C - 9Q 位羟化、酮化后，B 环开裂( 反应b 1 ) ，然后A 环羟化为3 ，4 一邻苯二酚( 反应b 2 ) ， 之后C 4 与C 5 之间经双加氧酶氧化断键后加入1 分子氧( 反应b 3 ) 。接着C 5 ，C 1 0 ， C 6 水解开环生成产物2 一羟基一2 ，4 一二烯一1 ，6 一己二酸( 反应b 。) 或产物丁二酸( 反 应b 。) 1 0 6 J 。途径三：E 1 的C 4 羟化形成4 - 0 H - E 1 ，之后4 - 0 H - E 1 的C 4 、C 5 进一步 裂解( 反应c 1 ) 1 0 7 】。途径四：C 1 6 羟化生成1 6Q O H E 1 ( 反应d 1 ) 【8 0 】。 安徽理工大学硕士学位论文 F u t h e rd e g r a d a t i o n n H o O c _ 弋H C O O H 2 - h y d r o x y - 2 ，4 - d i e n e - 1 ，6 - d i o i e ' c 0 2 ，H 2 0 L a g t o n e ' C 0 2 ，H 2 0 图2 雌激素的降解途径分析图【1 0 3 1 0 7 】 F i g u r e2P r o p o s e dc a t a b o l i cp a t h w a yf o re s t r o g e n sd e g r a d a t i o nb ys t r a i n s 1 0 3 _ 1 0 7 】 I 瞵蒯 3 材料与方法 3 1 实验材料 3 材料与方法 3 1 1 样品来源 厦门某污水厂氧化沟活性污泥；厦门湾与簧答湖水样。 3 1 2 主要仪器 实验使用主要实验仪器如表7 所示： 表7 仪器清单 T a b l e 7L i s to fe x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t 仪器名称 型号生产厂家 数控超声波清洗器 双向电泳仪电源 多用途水平电泳仪 可见光透射仪 微波炉 干式恒温器 微量台式离心机 恒温振荡器卧式 电子天平( 万分之一精度) p H1 十 电热恒温水浴锅 超净工作台 8 0 度冰箱 K Q 一5 0 0 D E D Y Y - 6 C 型 B G s u b M m I 蓝盾5 0 2 G 8 0 F 2 3 C N 2 L A 9 ( S O ) 2 0 L E G E N DM i c r 0 21 Z H W Y 二3 3 4 T B 一2 1 4 U B 7 P K _ $ 2 4 S W 二C J 一1F 0 D W 8 6 L B 8 6 昆山市超声波仪器有限公司 北京六一仪器厂 北京百晶 厦门百维信生物科技有限公司 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有 限公司 杭州奥盛仪器有限公司 德国T h e r m o F s is h e r 公司 上海智诚分析仪器制造有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 美国D E N V E R 上海精宏实验设备有限公司 苏净安泰空气技术有限公司 青岛海尔特种电器有限公司 安徽理工大学硕士学位论文 3 1 3 主要药品与试剂 实验室使用药品与试剂如下表8 所示： 3 材料与方法 表8 主要实验试剂 T a b l e8T h em a i ne x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 安徽理工大学硕士学位论文 3 1 4 培养基 A M S 培养基( g L ) ： ( N H 4 ) 2 S 0 4 0 7 7 7 K E S 0 40 1 7 0 8 K H 2 P 0 4 0 5 3 0 8 N a E H P 0 4 2 1 8 4 7 M g S 0 4 。7 H 2 0 0 0 3 6 9 7 C a S 0 4 ·H 2 0 0 0 1 2 0 4 C o M 0 0 4 0 0 0 8 7 6 K 10 1 6 6 ×1 0 - 3 Z n S 0 4 ·7 H 2 0 0 5 7 5 ×1 0 。j M n S 0 4 ·H 2 0 0 3 3 8 ×1 0 。j H 3 8 0 3 O 1 2 4X1 0 。 F e S 0 4 ·7 H 2 0 0 0 2 2 2 4 n E S 0 4 9 8 0 8 可配浓缩液，使用时再混合，调P H 值为6 8 7 0 。 磷酸盐缓冲液( P B S 溶液) ( g L ) ： N a C l8 0 0 7 K C l 0 2 0 1 K H 2 P 0 4 0 2 7 2 N a 2 H P 0 4 3 5 8 1 超纯水l L ，调p H 为7 4 。 R E A 培养基( g L ) ： 胰蛋白胨 0 2 5 酸水解酪蛋白 O 5 酵母浸粉 0 5 可溶性淀粉 0 5 磷酸氢二钾 0 3 硫酸镁 O 1 丙酮酸 蛋白胨 3 材料与方法 葡萄糖 0 5 蒸馏水1 L ，固体培养基中加入1 5 9 L 的琼脂，P H 值7 2 + 0 2 。 2 1 6 L 培养基( g L ) ： 乙酸钠 1 硝酸铵 O 2 柠檬酸钠 O 5 普通肉汤培养基0 5 蛋白胨 l O 酵母粉 2 加海水至1 L ，固体培养基中加入1 5 9 L 的琼脂，调p H 7 5 。 L B 培养基( g L ) ： 酵母提取物 5 N a C l1 0 胰蛋白胨 1 0 蒸馏水1 L ，固体培养基中加入1 5 9 L 的琼脂，调P H 7 4 。 Y N B 培养基( g L ) - 胰蛋白胨 5 葡萄糖 O 5 ( N H 4 ) 2 S 0 4 0 1 0 F e S 0 4 ·7 H 2 0 0 0 7 蒸馏水1 L ，固体培养基中加入1 5 9 L 的琼脂，调P H 值为5 5 。 T S A 培养基( g L ) ： 胰蛋白胨 1 5 大豆胨 5 氯化钠 2 0 蒸馏水1 L ，固体培养基中加入1 5 9 L 的琼脂，调P H 值为7 2 。 安徽理工大学硕士学位论文 3 2 实验方法 3 2 1 降解菌的富集 向2 5 0 m i 三角瓶中加入1 0 01 1l 浓度为1 0 0 0 m g L 的雌激素丙酮溶液，置于通 风橱内待丙酮完全挥发后，加入1 0 0 m l 的A M S 培养基或经O 4 5um 滤膜过滤的天 然海水，配成雌激素浓度约为l m g L 的培养液。1 2 1 ，高压灭菌1 5 m i n ，常温冷 凉后备用。将采集的水样按5 0 的体积分数加入到该培养液中，此后，每2 3 天更 换一次培养基，重复8 周，以富集E 2 降解菌。 3 2 2 降解菌的分离 取适量富集后的菌液，用无菌水逐级稀释浓度梯度为1 0 、1 0 2 、1 0 一、1 0 4 、 1 0 一、1 0 石、1 0 ，各取5 0ul 稀释液分别涂布于2 1 6 L 平板上，置于3 0 。C 培养箱内培 养5 7 天，观察生长情况。挑取长势较好的稀释浓度平板上的单菌落继续划平板， 直至分离出较为纯正的单菌落。将分离得到的菌株进行复筛，通过雌激素E 2 降解 试验，保留有降解能力的菌株，淘汰无降解能力的菌株。 3 2 3 菌种鉴定 1 1 6 S r D N A 序列鉴定及系统发育树建立 A 细菌裂解( 总D N A 提取) ( 1 ) 取5 0ulL y s i sB u f f e rf o rM i c r o o r g a n i s mt oD i r e c tP C R 于M i c r o t u b e 中。 ( 2 ) 用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，置于M i c r o t u b e 中搅动几下取出。 ( 3 ) 8 0 。C 热变性1 5 分钟后，低速离心，取1 5u 裂解后的上清液作为P C R 反应 的模板。 B P C R 扩增 表9P C R 反应体系的配制 T a b l e9P r e n p a r a t i o no f t h eP C Rr e a c t i o ns y s t e m 试剂体积 裂解上清液 P r e m i xE xT a qV e r s i o n2 0 ( 酶的混合液) F o r w a r d R e v e r s e D H 2 0 1 5ul 2 5ul 3 材料与方法 调整好反应程序，将混合液立即置于P C R 仪上，执行扩增。P C R 反应条件： 9 4 “ C 预变性l O m i n ，3 0 个循环( 9 4 “ C 变性3 0 s ，5 5 。C 退火3 0 s ，7 2 “ C 延伸9 0 s ) ，最 终7 2 延伸1 0 m i n 。 C 凝胶电泳 本试验P C R 产物采用E B ( E t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭) 染色，1 浓度的琼 脂糖凝胶，即1 0 0 m L 的电泳缓冲液( 0 5 ×T B E ) 中加入l g 琼脂糖，摇匀后置于微波 炉中加热至暴沸，取出冷却一会，倒入制胶板中，完全冷凉之后即形成凝胶。电 压1 2 0 V ，电流ll O m A ，电泳时间为2 5 m i n 。P C R 扩增产物经1 0 A g a r o s e 胶检验 后于2 0 保存( 一般保存时间不超过7 天) 等待送交菌种鉴定公司测序。 D 菌株16 S r D N A 序列鉴定及系统发育树分析 将测序结果同G e n B a n k 中的基因序列进行同源性比较分析，选取1 4 0 0 b p 左右 长度进行比对 C l u s t e l x ( 1 8 1 ) 】，采用邻位连接( N e i g h b o u rJ o i n i n g ，N J ) 法建立系 统发育树进行系统学分析( M e G A ) ，确定菌株种属情况及其在遗传学上的地位。 2 生理生化特性 A 温度实验 准备2 0 支试管，分别装入5 m l2 1 6 L 培养基后接入等量的种子液，分别于1 0 、1 5 、2 0 。C 、2 5 “ 1 2 、3 0 、3 5 “ C 、4 0 、4 5 。C 中其他相同条件下培养，测O D 6 3 0 ， 测定时间为4 d ，观察不同温度下菌的生长情况。 B p H 实验 准备1 0 支试管，配备不同p H 分别为4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、 8 5 、9 0 、9 5 、1 0 的2 1 6 L 培养基，各取2 0 0l al 于9 6 孔板中，接入1 0p1 的种子 液，每个梯度做三组平行，完成后将9 6 孔板放于B i o s c r e e n 全自动生长曲线分析 仪测O D 6 0 0 ，测定时间为4 d ，观察不同p H 菌的生长情况。 C 盐度实验 配制含氯化钠梯度为0 、1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 2 1 6 L 液体培养基，各取2 0 0 l al 于9 6 孔板中，接入1 0 ul 的种子液，每个梯度做三组平 行，完成后将9 6 孔板放于B i o s c r e e n 全自动生长曲线分析仪测O D 6 0 0 ，测定时间为 4 d ，观察不同盐度菌的生长情况。 D 电镜观察 菌体离心，5 0 m l E P 管，2 0 0 0 r p m ，3 0 m i n 。用P B S 缓冲液洗涤2 次。再次离 心，去上清液。 用2 5 戊二醛磷酸缓冲液( 7 2 ) 静置l h ( 由于加入活性炭，需要提前用 安徽理工大学硕士学位论文 有机膜进行过滤，备用) 。 再次离心，去上清液。用P B S 洗涤2 次( 此洗涤步骤可以省略) 。 将菌体用过滤纸包裹，加入乙醇逐级梯度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为 3 0 一5 0 7 0 9 0 ，梯度脱水各1 0 1 5 m i n ，再用1 0 0 脱水，2 0 m i n ( 4 、7 0 的酒精里或是4 。C 、戊二醛条件下可以稳定放置一段时间) 。 进行临界干燥( 此时间较长，2 5 h 左右) 。 喷金。 上机观察。 E B i o l o g 实验 根据B i o l o g 说明书进行实验操作。B i o l o g 的工作原理是：1 不同种类的微生物 利用碳源具有特异性。2 微生物在利用碳源进行新陈代谢时，产生的酶能使四唑类 物质( 如T V ) 发生颜色反应。3 微生物利用碳源代谢，不断增值，浊度也会发生