异常毕赤酵母(Pichia anomala) HN1--2菌株产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究.pdf

R * ￥女目4 ( P i c h t a m 口b ) H N I _ 2m # P 4 自§自目镕§目f “ R 异常毕赤酵母( P i c h i aa n o m a l a ) H N l 2 菌株产单细胞蛋白和 嗜杀因子的研究 摘要 红树林生态系统分布在全球1 j 2 个国家，总面积达到1 8 1 0 0 0K m 2 ，覆盖了 世界热带和亚热带6 0 7 5 的海岸线。中国现存的红树林约占世界红树林面积 的O1 。红树林中含有丰富的微生物资源，其中已分离鉴定出的真菌超过1 0 0 种，成为海洋真菌的第二大类群。本论文从红树林生态系统中分离得到一株同时 产单细胞蛋白和嗜杀因子的酵母萄株H N l 2 ，通过传统方法和分子生物学方法的 鉴定，该菌株属于异常毕赤酵母，这是该现象的首次报道。 本论文以廉价的豆饼粉水解渡为基础，通过单因子优化的方法，对异常毕赤 酵母H N l 2 菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀园子的条件进行了优化。最 终确定最佳培养基组成( w v ) 为：4O 豆饼粉水解液，3 0 葡萄糖。堆佳起始 p H 40 ，最佳接种量( v v ) 为8O ( O D 6 = 83 ) ，最佳培养温度2 8 。在5 一L 发酵罐中发酵时，该嗜杀菌株在1 2h 内即可产生大量的单细胞蛋白和嗜杀因子。 此时，菌体细胞的蛋白含量、生物量、还原糖含量以及透明圈直径分别达到5 6O ( w w ) ，73g ，L ，95 9 L 和1 90N l m 。对发酵后菌体细胞的氨基酸组成进行分析 的结果显示苗体细胞中古有大量的必需氨基酸，如赖氨酸( 含量占总蛋白的 78 ) 、甲硫氢酸( 含量占总蛋白的18 ) 和亮氨酸( 含量占总蛋白的90 ) 。 以对虾肌肉蛋白为参考蛋白时，必需氨基酸指数( E A A I ) 为l0 4 ，属于优质蛋 白源。异常毕赤酵母H N 2 菌株分泌的嗜杀因子可以杀死长孢路德酵母、白色 假丝酵母、二尖梅奇酵母、季也蒙毕赤酵母、酒精酵母、解N I t I I 罗威亚酵母以及 海尼克鲁维酵母等自然界中广泛存在的多种酵母但对丝状真苗和细菌没有嗜杀 衍性。通过与敏感野生菌林北培养的研究，发现异常毕赤酵母H N l 2 菌株在生 K 过程中可以防止野生菌株的污染，这在发酵工业中意义重大。 生产单细胞蛋白的种最要方法是固体发酵( S S F ) 。通过单因子优化的方 法，对以麦麸稻壳棍台物为基质的硎体发酵条件进行优化。最终确定最佳条件 为：罄质含水肇4 5 ( w w ) ，葡萄糖浓度I5 ( w w ) ，硫酸铵浓度为O3 ( w w ) ，p H 45 发酵温度2 8 ，发酵2 4h 后1 捌体混台物的平均蛋白含量由 异$ ￥卉B 日( P i c h l aa n o m a l a ) I N I2 自# 产$ 日虽自嗜糸日子的研究 发酵前的1 42 3 ( W W ) 提高到2 97 8 ( w w ) ，透明圈直径达到1 01m m 。通 过固体发酵的方式提高混合物的蛋白含量，增加其饲用价值，这在畜牧业中具有 重要意义。 关键词：红树林：单细胞蛋白：嗜杀园子：固体发酵：异常毕赤酵母 异常毕赤酵日( P w h i aO M O m O O ) 洲I2 菌株产单细胞蛋白和嗜系目于的研究 R e s e a r c ho f s i m u l t a n e o u sp r o d u c t i o no f s i n g l ec e l lp r o t e i n a n dk i l l e rt o x i nb yP i c h i aa n o m a l aH N l - 2 A b s t r a c t M a n g r o v ef o r e s t s ，w i t ht h et o t a la r e ab e i n g18 1 0 0 0K i n 2 ，a r ew i d e l yd i s t r i b u t e d i nI1 2c o u n t f i e sa n dc o v e r6 0 7 5 o fc o a s tl i n e so ft r o p i c a la n ds u b t r o p i c a l z o n e sC h i n ah o s t s01 o ft h ew o r l dm a n g r o v ef o r e s t sM a n g r o v ef o r e s t sa r er i c hi n m i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e sa n do v e r1 0 0f u n g a ls p e c i e sh a v eb e e ni n d e n t i f i e df r o m t h e s ee c o s y s t e m sU s i n gr o u n f i n ea n dm o l e c u l a rm e t h o d s ，t h ey e a ts l r a i nt l N I ·2t h a t c a np r o d u c eb e t hs i n g l ec e l lp r o t e i na n dk i g e rt o x i ni s o l a t e df r o mC h i n e s em a n g r o v e f o r e s t sw a si n d e m i f i e da saPa n o m a l as t r a i nT h i si st h ef i r s t r e p o r to fs u c h p h e n o m e n o n B a s e do nt h eo n ef a c t o ro p t i m i z a t i o nt h e o r y , c u l t u r a le o n d i t o n sf o rs i m u l t a n e o u s p r o d u c t i o no fS C Pa n dk i l l e rt o x i nb yPa ，t o t i $ a l as t r a i nH N I 一2w e r eo p t i m i z e dT h e b e s tc u l t u r em e d i u mw a sf o u n dt ob ec o m p o s e do f40 ( w v ) o fs o y b e a nm e a l h y d r o l y s a t e a n d3 0 ( w v ) o f g l u c o s e T h eb e s t i n i t i a lp H ，b e s t i n o c u l u ms i z ea n db e s t f e n n e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew e r ef o u n dt ob e4 0 ，80 ( v v ) a n d2 8 ，r e s p e c t i v e l y W h e nt h ek i l l e ry e a s tc e l l sw e r eg r o w nb yb a t c hc u l t i v a t i o ni n5 - Lf e r m e n t o r , c r u d e p r o t e i ni nt h ec e l l s ，c e l lm a s s ，r e d u c i n gs u g a r a n dd i a m e t e ro ft h ei n h i b i t i o nz o n e r e a c h e d5 60gp e r1 0 0go fc e l ld r yw e i g h t ，7 3gp e rl i t e r , 9 5gp e rl i t e r , a n d1 90 m n l r e s p e c t i v e l yw i t h i n 1 2ha n dt h i s y e a s ts y n t h e s i z e dal a r g ea m o u n to ft h e e s s e n t i a la m i n oa c i d s ，s u c ha sl y s i n e ( 78 ) ，m e t h i o n i n e ( 18 ) ，a n dl e u c i n e ( 90 ) T h ec n t d ek i l l e rt o x i np r o d u c e db yt h ek i l l e ry e a s ti s o l a t eH N I 一2c o u l dk i l lt h ec e l l s o f L o d d e t o n w c e se l o n g i s p o r u s C a n d i d aa l b i c a n s M e t s c h n i k o u i ab i c u a L o i d a t a , P i c h i a g u d l i e r m o n d i iS a c c h a r o m y c ev e r c v i s i a eg a r r o i a | I ) ¨I ) t i c 【lL l l l dK l u y v e l o m y c e s ( F Pv f f I “，i iw h i c ha r ew i d c l ? d i s l f i b e l e di nn a t u r a le n v i r o n m e n t slh er e s u l t sa l s o s h o w e dt h a tt h eu n d e s ir a b l e ? ' c a s tc o u l db ea v o i d e dd ur i n gc e l lg r o l h0 1 “ t h ek i l l e r y e a s ta n dt h a ti sv e r yi m p o n a n li nt h n n e n t a t i o ni n d u s t r y 异$ $ 靠B 4 ( P t c h i aa n o m a l a ) 州12 自株P 4 胞噩自和嗜彖崮于的研究 O n eo f | h c m e t h o d 5 f o rS C Pp r o d u c t i o n i ss o l i ds b | e f o r m e n t a t i o n ( S S F ) C u l t u r a c o n d i t o n sf o rS S Fw h e nw h e a tb r a na n dr i c e h u l lm i x t u r ew a su s e da st h es u b s t r a t e w e r eo p t i m i z e db a s e do no n ef a c t o ro p t i m i z a t i o nt h e o r y T h eb e s tc u l t u r a lc o n d i t i o n s w e r ef o u n dt ob ea sf o l l o w s ：S u b s t r a t em o i s t u r e4 5 ( w w ) ，g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 15 ( w w ) ，( N H 4 ) 2 S 0 4c o n c e n t r a t i o n03 ( w w ) ，p H 45 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 A f t e r2 4ho ff e r m e n t a t i o n ，t h ep r o t e i nc o n t e n tw a sr a i s e df l o m1 42 3 ( w w ) t o 2 97 8 ( w 们，a n d t h ed i a m e t e ro fc l e a rz o n e w a s l 0 Im m R a i s i n gp r o t e i nc o n t e n to f m i x t u r eu s i n gS S F m e t h o d m a y f i n d i t s f u t u r e i n A n i m a l H u s b a n d r y K e y w o r d s ：m a n g r o v ef o r e s t ；s i n g l e e e l l l p r o t e i n ；k i l l e r t o x i n ；s o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n ：P i c h i aa n o m a l a 异常毕赤酵4 ( ，m a n o m Q k l 洲r 2 苗株产$ 目胞蛋自和口# 日子研究 目录 第一章绪论 红树林生态系统 I I 红树林生态系统简介 1 2 红树林生态系统在中国的分布 I 3 红树林生态系统中的微生物资源 2 13 1 红树林生态系统中的细菌 2 13 2 红树林生态系统中的放线菌 3 I 3 3 红树林生态系统中的真菌 3 2 嗜系因子 2 】嗜系因子和嗜杀酵母简介 2 2 产嗜杀因子的真菌及其应用前景 2 2 】产嗜杀园子的真菌 4 2 22 嗜乐因予和嗜杀酵母的应用前景 6 2 3 嗜杀因子的性质 2 3 1 分子量 7 2 32 影响嗜杀因子作用的因素 7 24 嗜杀作用机理及检测方法 9 2 4 l 嗜杀因子受体 2 42 嗜杀因子对敏感细胞的作用 1 0 2 43 嗜杀因子检测方法 l l 3 单细胞蛋白 l l 3 1 单细胞蛋白简夼 l l 3 2 单细胞蛋白f l 勺来源及生产单细胞蛋白的底物】2 33 单细胞蛋白的营养价值及其米源的限制因素 】5 33l 藻类的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 1 5 3 32 真菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 1 6 3 34 细菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 】7 3 4 单细胞蛋白生产的优化 1 8 4 本论文的研究内容和意义 1 9 第一章高蛋白含量同时产嗜系园子的菌株的筛选及鉴定 0 前言 2 1 1 材料与方法 2 l ¨菌种 2 1 t 2 培养肇2 0 试荆 2 1 2 】培养基 2 2 试剂 3 试验疗法 】3 l 高蛋白食量菌株的筛选 3 + 2 嚷杀活性的检测 2 1 2 2 2 3 2 3 2 4 异# # 寿辞Sf ，汹w 甜研删f j M 一2m 替P * 细胞噩白和镕呆目 的研究 l3 3 酵母菌种鉴定 2 4 2 结果与讨论 2 7 2l 高蛋白含量菌株的筛选结果 2 7 2 2 高蛋白含量菌株嘈杀活性的榆测 2 7 23 苗刊噬定结果 2 8 23 1 常规方法鉴定结果2 8 232 分予生物学方法鉴定结果 3 0 3 本章小结 3 2 第三章异常毕赤酵母H N I 2 菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究 0 前言 3 3 1 材料与方法 3 4 1l 菌种 3 4 2 培养基与试剂 3 4 1 2 1 培养基 3 4 1 22 试剂 3 4 3 试验方法 3 5 13 】粗蛋白含量的测定 3 5 13 2 生物量的测定 3 5 l33 嗜杀园子产量的检测 3 5 13 4 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀园子最佳条件的确定 3 5 l35 摇瓶发酵中菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径随时间的变化 3 7 13 6 在5 一L 发酵罐中发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子 3 7 13 7 还原糖含量的测定 3 7 3 8 总糖含量的测定 3 7 l39 氨基酸组成舶分析3 7 131 0 必需氨基酸指数( E A A I ) 的计算 3 8 2 结果与讨论 3 8 2l 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的优化 3 8 21 】豆饼粉水解液浓度对菌体蛋白音量、生物量和透明圈直径的影响3 9 2l2N 酊l 浓度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响3 9 2l3 不同碳源及其浓度对聋体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响4 0 214 不同起始p H 对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响4 2 215 培养温度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响 4 3 2l6 接种量对菌体蛋白含量、生物量和透n 月圈直径的影响 4 4 2 2 摇瓶发酵中菌体蛋白古量、c E 物量和透明圈直径随时问的变化 4 5 23 在5 L 发酵罐中发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子 4 6 2 4 异常毕赤酵母H N l 一2 菌株细胞氨基酸组成的分析 4 7 3 奉章小结 4 9 第四章异常毕赤酵母H N l 2 菌株培养过程r | 防污染的研究投固体发酵的初步研 究 0 前苦 l 材料与疗法 1 】菌种 5 0 5 l 5 l 异镕￥女* 4 ( P t c h i a 口口k ) I N l2 菌株F 单日胞蚩自I 镕系日f 的硝究 2 培养基与试剂 5 1 12 I 培养基5 l 122 试剂5 2 3 试验方法 5 2 l31 异常毕赤酵母I ' I N l - 2 菌株杀菌谱的测定5 2 13 2 异常毕赤酵母H N I - 2 葡株培养过程中防止野生菌株污染的研究5 2 】3 3 发酵体系平均蛋白含量的测定 5 3 l3 4 嗜杀园子产量的检测5 3 l3 5 异常毕赤酵母H N l 2 菌株固体发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的 优化 5 3 13 6 固体发酵时平均蛋白含量和透明圈直径随时问的变化 5 5 2 结果与讨论 5 5 2l 异常毕赤酵母H N 】2 菌株的杀菌谱 5 5 22 异常毕赤酵母H N l 2 菌株培养过程中防止野生菌株污染的研究 5 6 2 3 异常毕赤酵母I - I N l - 2 菌株固体发酵产单细胞蛋白和喏杀因子条件的优化 5 8 2 3l 固体基质含水量对平均蛋白含量和透明圈直径的影响 5 8 2 , 32 不同碳源及其浓度对平均蛋白含量和透明匿直径的影响 5 9 2 33 接种量对平均蛋白含量和透明圈直径的影响 6 】 234 不同D H 对平均蛋白含量和透明圈直径的影响 6 2 2 35 不同发酵温度对平均蛋白含量和透明圈直径的影响 6 3 236 不同氮源及其浓度埘平均蛋白含量和透明圈直径的影响 6 4 2 4 固体发酵时平均蛋白含量和透明圈直径睫时间的变化 6 6 3 本章小结 6 7 论文总结与创新点 参考文献 附录：英文缩写符号及其中英文名称 6 8 7 0 8 5 异常毕赤酵母( M m 。b ) I I N I2 菌株P 单目胞蛋白和咕杀日子的究 I 红树林生态系统 1 1 红树林生态系统简介 第一章绪论 红树林不仅指红树植物，还指这一系统中由丰富的生物群落所形成的生态系 统。通常红树林被定义为生长在热带、亚热带海岸低潮带和潮间带中上部，受周 期性潮水浸淹，以红树植物为主体的潮滩湿地生物群落( 张乔民1 9 9 7 ) 。红树 林生态系统分布在全球1 1 2 个国家，总面积达到1 8 1 0 0 0 K m 2 ( S a h o o K ，2 0 0 9 ) ，覆 盏了世界热带和! I E 热带6 0 7 5 的海岸线。海洋沿岸红树林生态系统是地球上 生产力水平最高的四大海洋生态系统之一( 林鹏2 0 0 3 ) ，并且在地球水分的海 陆大循环等方面发挥多种重要功能园而引起了学者的广泛关注。 I 2 红树林生态系统在中国的分布 红树林生态系统在中国主要分布在东南沿海各省份，包括海南、广东、广西、 福建和台湾等地区，地理位曩从1 8 ，N 到2 7 刊之间的地域。中国现存的红树林 约有1 7 8 0 0 公顷，约占世界红树林面积的01 ( L ie ta l ，】9 9 7 ) 。由于城市化的 发展，耕地面积的扩大以投水产养殖业的发展，中国红树林遭受了巨大的破坏 ( L ie ta l ，1 9 9 7 ) 。红树林在中国绝大部分位于海南、广东和广西三省，另外，在 浙江、台湾、香港和澳门有少量分和。红树林在中国各省和各地区的分布如表 1 ，l 所示。 异常毕赤酵母( P i c h i o m a l 口) I I N 一2 曲抹P * 日胞蛋自目嗜录目于研究 表1 1 红树林在中国再省的分布状况( L ie ta l ，1 9 9 7 ) T a b l e l - ID i s t r i b u t i o no f m a n g r o v e f o r e s t s i n C h i n a ( L ie ta l ，1 9 9 7 ) 1 3 红树林生态系统中的微生物资源 红树林独特的生态系统和丰富的生物多样性引起了人们的关注，细菌、真菌、 放线菌、微型藻类等是其主要的微生物类群。据报道，在热带红树林中，细菌和 真菌占微生物资源总量的9 1 ，藻类和原生动物分别占7 和2 ( A l o n g i 2 0 0 2 ： Z h u a n g e ta l ，1 9 9 8 ) 。相关学者的研究表明，在红树林这陆地和海洋交接处的 生态系统中，不同来源的微生物得到集中，因而其中的微生物多样性极其丰富。 1 3 1 红树林2 F 志系统中的细菌 H o l g u i n 等研究发现，硫酸盐还原苗、固氮菌、溶磷菌等细菌在红树林生态 系统一1 - 发挥着氮源固定、磷酸盐溶解苒雨要作用，因而这些细菌在红树林生卷系 统中营养物质的循环过程中是不可或缺的( H o l g u i nG e ta 1 2 0 0 1 ) ，有学者从南 印度红树林土壤巾分离得到多种细菌，E 中芽弛杆菌是优势属，与分离得到的细 菌总数的5 0 ( S h o m e R ，1 9 9 5 ) 。确- 红树林牛忐系统1 1 ·分离得到的细茼根多具仃 嗜盐制- ，其代谢产物在医学、农业、食；协州E 、石自f I 丌采等方面只有重要作J J ( 刘 2 异# $ 女g 目( P w h i a 删。柑m ) 州l _ 2 * # P $ §自# 嗜 目 研究 爱民2 0 0 2 ) 1 3 2 红树林! F 态系统中的放线菌 红树林土壤中可培养放线菌相对较少，主要以链霉苗、游动放线菌、小单 孢茜为主，w u 从红树林土壤中分离到链霉菌、小单胞菌、链轮丝菌、诺卡氏菌 和红球菌5 个属，其中链霉菌和小单孢菌在数量上占绝对优势( W u ，】9 9 3 ) 。 放线菌在生态环境中起重要作用并且可以产生多种抗生素、抗肿瘤物质、酶、酶 抑制剂等生物活性物质，已经在工业、农业、林业咀及制药业等行业得到了广泛 应用。红树林是分离生产生物活性物质的放线苗的潜在宝库。 1 3 3 红树林生态系统中的真苗 红树林土壤真菌类群较丰富，其中优势菌是子囊菌届，其次是半知菌。H y d e 曾列举了分离自全世界2 9 个红树林中的1 2 0 种真菌，发现其q a 8 7 种为子囊菌，3 1 种为半知苗，2 种为担子菌( H y d eK D e ta l ，1 9 9 0 ) 。K o h l m e y e r 等发现，红树林 生态系统中的绝大多数真菌生长在潮面或以下，并且其中予囊菌占多数 ( K o h l m e y e rJe ta 1 1 9 9 5 ) 。与其他海洋环境相比，红树林生态系统中子囊菌的 种群多样性更高，并且许多子囊类群是外束的，而且往往只能发现有代表性的几 个种( A r a u j oe ta 1 1 9 9 5 ) 。红树林生态系统中担于菌种群多样性与其它水域相比 并无显著差异。在受到污染的水域中，担子菌类酵母的数量要少于子囊菌类酵母 ( H a g l e re ta l ，1 9 8 7 ) 。 本实验室工作人员曾研究了中国南方红树林L 态系统中的酵母类群，从厦门 和海南红树林沉积物以及红树林植物上分离得到多种酵母。在厦门红树林沉积物 一l ·分离得到酵母菌株托3 3 株，属于假丝酵母、克鲁维酵母、伊萨酵母、拟威尔酵 母和毕赤酵母5 个属。其中热带假丝酵母( C a n d i d a t r o p i c a l i s ) ( 1 7 株) 和海泥克 鲁维酵母( K l u y l _ ' e r o m y c e sa e s l u a r i i ) ( 5 株) 数量最多。在海南红树林沉积物中分 离料到3 2 株酵母苗株属于假丝酵母、德巴利酵母、隐球酵母和拟成尔酵母4 个 槭，儿叫1 数量昂多的是热带假丝酵母( ct r o p i c a l i s ) ( 1 4 株) 毗k 逊德巴利酵母 ( D e b a r y o n l y c e _ h a n s e n i i ) ( 5 株) ( 池振叫锋，2 0 0 9 ) ：在两地红树林沉积物中分 离得到的似始酵母菌株最多达到4 5 株，所响菌株的6 9 。 3 异常毕赤酵母( P t c h m 口n o m a a ) H NL 一2 苗林产单胞蛋自嘴系固于的研究 本实验宦工作人员在红树林植物r 分离得到的酵母菌株1 7 4 株，分属于假丝 酵母、德巴利酵母，丝孢酵母、柯达酵母、伊萨酵母、毕赤酵母和胶红酵母8 个 属，其中假丝酵母最多共9 4 株，占所有菌株的5 4 ，毕赤酵母次之，共有1 6 株。 尤其需要注意的是，本实验室工作人员从红树林中分离得到一株可以产嗜杀 吲子的酵母菌株土星拟威尔酵母( W i l l i o p s i s 删“ 埘甜) W C 9 1 2 ，而另外一株异 常毕赤酵母( Pa n o m a l a ) F I N l - 2 的细胞具有较高的蛋白含量并能产生嗜杀因予， 它们在医药、食品和农业上面具有重要的潜在应用价值( 池振明等，2 0 0 9 ：S u ne t a I 2 0 1 2 ) 。 2 嗜杀因子 2 1 嗜杀因子和嗜杀酵母简介 嗜杀现象首次发现于1 9 6 3 年。B e v a n 和M a k o w e r 在酒精酵母菌 ( S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中发现酵母菌株问存在互相杀死的现象( B e v a na n d M a k o w e r ，1 9 6 3 ) 。所谓的嗜杀因子，是指一些酵母分泌的小分子蛋白质或者糖 蛋白，可以杀死同族或者亲缘关系较近的菌株。产生嗜杀因子的酵母菌株为嗜杀 药株，嗜杀菌株对其本身产生的嗜杀因子具有免疫性，被杀死的称为敏感菌株。 2 2 产嗜杀因子的真菌及其应用前景 2 2 1 产嗜杀因子的真苗 自嗜系因子首次在酒精酵母中发现后，嗜杀现象在C a n d i d a , C r y p t o c o c c u s D e b a r y o m y c e s H a n s e n i a s p o r a , H a n s e n u l a , K l u y v e r o m y c e s M e t s c h n i k o w i a , P i c h i a , U s l i l a g o ，T o r u l o p s i s , W i l l i o p s i s Z y g o s a c c h a r o m y e e s 以及M r a k i a 等酵母中相继 被发现，这醴明嗜系现象征酵母中是普遍存祚的( B u z d a re ta l2 0 1 1 1 。 托酒精酵母中，根据嗜杀特性，晴杀【矧r ”r 分为K 1 K 2 K 3 或K 2 8 这三 炎，从自然发酵的橄榄盐【如l ，分离t j 到的酵雌：j l i 大多数翻i 有嗜杀活性作为其中 的优势菌一牡P i c h i a m e m b r a n a P m c i e n s 简林的嗜系活陆尤其明显( L I o r e n e e I a t l 1 9 9 7 ) 。在临床和川L 分离的酵母菌株，如( ' u n d i d u t i l i s D e k k e r ab r u r e l l e n s i s # $ * 女“ 日( P m ma n o n a ) H N I2 自株P 目自自& 目 “ 究 S t e r i g m a t o m y c e sh a l o p h i l u sS t e p h a n o a s c u sc i f e r r f tP i c h i ah o l s t i i 和P i c b i a j a d i n i i 的菌株中也发现了嗜杀现象( A n t u n e sa n dA g u i a r ，2 0 1 1 ) 。其中，有些酵母嗜杀因 子的产生依赖于N a C I 的存在( Y o u n ga n dY a g i u 1 9 7 8 ) 。 尽管许多酵母都能产生嗜杀园子然而迄今为止在丝状真菌中研究人员 只发t 见U s t i l a g om a y d i s 能产生嗜系因子。um a y d i s 产生的嗜杀因子是一种由单 个d s R N A 片段编码的蛋白质。um a y d i s 嗜杀因子对黑粉茼科家族中的一些苗有 嗜杀作用，其中包括一些对小麦，燕麦以及大麦致病的菌种。um a y d i s 共有三种 嗜杀菌株：P I ，P 4 N P 6 ，它们分别分泌嗜杀因子K P l ，K P 4 和K P 6 ( G a g ee ta 1 2 0 0 1 ) 。 以上提到的所有嗜杀真菌均来自陆地环境。目前，我们对于海洋环境中的嗜 杀真菌和嗜杀因子仍然了解不多。对于海洋环境中的嗜杀现象本实验室一些人 员进行了相关的研究，取得了一定的成果。 本实验室的工作人员通过对3 0 0 多株海洋酵母的筛选，发现异常毕赤酵母 Y F 0 7 b 对梭子蟹致病菌二尖梅奇酵母( M e t s c h n i k o w i ab i c u s p i d a t e ) W C Y 的嗜杀 作用最强，并且发现最佳的产嗜杀因子条件足20 N a C l ( w v ) ，p H4 5 培养温度 2 0 。C ( W a n ge ta I ，2 0 0 7 a ) 。从红树林生态系统中分离的异常毕赤酵母H N l - 2 菌株 可以同时产生大量的嗜系因子以及单细胞蛋白( 细胞的蛋白含量以及抻菌圈的直 径分别达到5 6 0 以及1 90m m ) 。H N I 一2 菌株分泌的粗嗜杀因子可以杀死自然 界中广泛存在的L o d d e r o m y c e se l o n g p 。r m ca l b i c a n s Mb i c u s p i d a t a , P i c h i a g u i l l i e r m o n d i i , sc e r e v i s i a eY a r r o w i aU p o 扯i c a 以及芷a e s t u a r i i 的细胞( S u ne ta l ， 2 0 12 ) 。同时，实验结果也证明嗜杀酵母在生长过程中可以避免野生菌的污染( S u n e ta l ，2 0 2 ) 。在南极海洋沉积物中分离得到的耐冷酵母M r a k i a 户叫出2 E 0 0 7 9 7 可以杀死梭子蟹的致病菌Mb i c u a p i d a t a W C Y 。M f r i g i d a2 E 0 0 7 9 7 只能杀死M b i c u s T 】i d a t aW C Y ，c 1t r o p i c a l i s 和ca l b i c a n s ，其中ca l b i c a n s 已经被证明是 种人类致病苗( H u a e l a 1 2 0 1 0 ) 。另分离自红树林生态系统的菌株 K l u y v e r o m y c e ss i a m e n s i sH N l 2 - 1 同样可以产L 针对梭子蟹致病菌Mb i c u s p i d a t a W C Y 的I 崤系I 划f 。二j 培养条r 为p l l4 0 ，05 N a C l ( w v ) ，2 5 。C 时，改蘸林能 产q 最大量的哺录I 划r 。【女嗜系F H 能杀死M “m p i d a t a W C Y 的细J H ( B u z d a r c Ia l2 0 1 1 1 。 # 镕* 女# 日( P i c h i aa n o m a l a ) l I N l2 # P 4 目虽自H 镕§口 的W 究 2 22 晴杀因子和啃杀酵母的应用前景 很多研究表明，具有嗜杀能力的酵母苗以及它们所产生的嗜杀因子在发酵， 医药、环境、食品、养殖和农业等方面有重要的用途。另外，嗜杀现象在研究酵 母蛋白质、酵母所产外毒素、酵母细胞壁精细结构等方面具有重要意义( S c h m i t t a n dB e r i n i n g ，2 0 0 6 ) 。 1 ) 在食品及发酵工业中的应用。许多真菌尤其是酵母菌可以引起食品的腐 烂以及饲料的腐坏( L o w e se ta l ，2 0 0 0 ) 。利用嗜杀酵母可咀杀死敏感真菌和敏感 酵母菌的特性可以将之用于由真菌和酵母菌所引起的食品及饲料的防腐 ( C o m i t i n ie ta 】2 0 0 4 ；L o w e se ta 1 2 0 0 0 ) 。在我国，食品生产过程中大部分是开 放式发酵，很容易受到来自空气、原料、客器带柬的野生酵母等微生物的污染， 影响发酵工作的正常进行。酒精发酵过程是一个复杂的微生物学过程，常常伴随 着其它野生菌株的污染，从而导致发酵迟滞、停止等，使得最终产品的质量受到 严重影响。而利用嗜杀酵母进行发酵则能选择性杀死引起发酵停滞或产生异昧的 野生茼株，更容易主导发酵过程可以保证发酵食品的产品的稳定性，在发酵工 业上有广泛的应用前景( V a s q u e ze ta l ，1 9 9 8 ) 。 2 ) 嗜杀因子作为新型抗真菌药物。嗜杀因子可以抵抗病原酵母和类酵母微 生物的感染，有望作为一种新型的抗真菌剂( B u z z i n ie ta l ，2 0 0 1 ) 。P o l o n e l l i 等 人曾利用嗜杀因子生产出一种抗体，能发挥与异常毕赤酵母嗜系因子相似的作用 效果以使人体抵御ca l b i c a n s 的感染( M a g l i a n ie ta l ，2 0 0 8 ) 。Y J ，t “ ，S a