Obatoclax 诱导腺样囊性癌细胞自噬与凋亡【推荐论文】 .doc

精品论文Obatoclax 诱导腺样囊性癌细胞自噬与凋亡的研究梁立中，马犇，梁玉洁，苏宇雄，廖贵清5（中山大学附属口腔医院口腔颌面外科，广州 510055）摘要：目的 唾液腺腺样囊性癌是唾液腺中第二常见的恶性肿瘤，其细胞内过表达 Bcl-2 和 Mcl-1 能够抑制凋亡，降低治疗效果。本研究旨在探讨 Bcl-2 拮抗剂：Obatoclax 在唾液腺腺 样囊性癌细胞中诱导自噬与凋亡的关系。方法 通过 western blot 和透射电镜检测 Obatoclax 刺激后 ACC-M 细胞自噬水平的变化，然后通过药物（3-MA 和 CQ）抑制细胞内自噬后，10使用 MTT 法观察 ACC-M 细胞活力以及 western blot 检测 caspase-3 裂解情况。结果 western blot 和透射电镜结果显示 Obatoclax 能促进 LC3-I 向 LC3-II 转化，细胞内部出现大量自噬体 结构。药物阻断 Obatoclax 诱导的自噬后，其细胞毒性明显增加，并且促进 caspase-3 裂解，最终导致细胞凋亡。结论 本研究证明 Obatoclax 能够在人唾液腺腺样囊性癌 ACC-M 细胞中诱导自噬，并且证实其诱导的自噬具有抑制凋亡的作用。15关键词：肿瘤学；自噬；凋亡；腺样囊性癌；Obatoclax中图分类号：R739.87A study of autophagy and apoptosis induced by Obatoclax in adenoid cystic carcinoma cells20LIANG Lizhong, MA Ben, LIANG Yujie, SU Yuxiong, LIAO Guiqing(Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-SenUniversity, GuangZhou 510055)Abstract: Objective salivary adenoid cystic carcinoma (ACC) of the salivary glands is the secondmost common malignancy in salivary gland. However, over-expression of Bcl-2 and Mcl-1 in the25ACC cells leads to inhibition of apoptosis, which reduces the anti-tumor effect of the treatments.This study was designed to study the relationship between autophagy and apoptosis induced by theBcl-2 antagonists (Obatoclax) in salivary adenoid cystic carcinoma. Method The transmission electron microscopy was used to detect the autophagy level in ACC-M cells under Obatoclax stimulation. When 3-MA or CQ inhibited Obatoclax-mediated autophagy, ACC-M cells vitality30was examined by MTT and the cleavage of caspase-3 was detected by western blot. ResultsWestern blot and transmission electron microscopy results showed that Obatoclax promoted autophagy in ACC-M cells. Pharmacologically inhibiting Obatoclax-induced autophagy significantly increased cytotoxicity and promoted caspase-3 cleavage, and eventually leaded to apoptosis. Conclusion This study provided the evident that Obatoclax induced autophagy in35adenoid cystic carcinoma cells, and confirmed that Obatoclax -induced autophagy has a role in inhibiting apoptosis.Keywords: Oncology; Autophagy; apoptosis; adenoid cystic carcinoma; Obatoclax0引言40涎腺腺样囊性癌（ACC）占涎腺恶性肿瘤的 7.5-10.0，约占头颈部恶性肿瘤的 3-5。 手术和手术后的放射治疗是治疗腺样囊性癌的主要手段。然而，远处转移到肺部，骨和其他 软组织仍然发生在约 40-60的患者身上1，是治疗失败的主要原因之一。对于防止远处转移化疗是必要的，但腺样囊性癌对现有化疗或分子靶向治疗不敏感。有基金项目：中山大学医科教育部博士点基金(20090171120105)；国家自然科学基金(30901682) 作者简介：梁立中，(1983-)，男，博士在读，主要研究方向：唾液腺肿瘤发生发展机制。 通信联系人：苏宇雄，(1977-)，男，副教授，主要研究方向：唾液腺肿瘤发生发展机制。E-mail:suyuxionghotmail.com- 6 -报道 Bcl-2 和 Mcl-1 在 ACC 组织中高表达2，这些抗凋亡分子的高表达可能是导致耐药原因45之一。因此，有必要更好地了解 ACC 的发病的分子机制，为治疗提供良好的靶点。 自噬是一种进化上高度保守的氨基酸和能量回收过程，在这过程中，细胞质和细胞器在溶酶体内被降解3。当细胞饥饿或在其他应激条件下，自噬基因如 Beclin-1，将被激活，并 启动自噬过程而产生 ATP。除了维持细胞的生存，过度的自噬也可导致细胞死亡，而被称 为 II 型程序性细胞死亡。50文献报道 Bcl-2 和 Beclin 1 同时调节细胞自噬和凋亡4。换句话说，BCL-2 和 Beclin 1 复合体，在一定程度上决定细胞的命运。我们前期的研究发现， Beclin 1 高表达的涎腺腺 样囊性癌患者预后比较好。但是，Bcl-2 和 Beclin-1 复合物在调节 ACC 细胞死亡中所起的作 用仍缺乏研究。Obatoclax 是一个泛 BCL-2 家族抑制剂，能够分离 Bcl-2 和 BH3-only 蛋白，如 BAX 和55BAK 之间的连接，激活线粒体途径的凋亡。此外，研究发现，Obatoclax 能够将 Beclin 1 从 Beclin 1 与 Bcl-2 复合体中释放出来，并诱导自噬甚至自噬性细胞死亡5。因此，本研究的 目的是检测 Obatoclax 是否能够诱导 ACC 细胞发生自噬，以及自噬与凋亡的关系。1材料与方法1.1 试剂和抗体60GX15-070（Obatoclax）来自 selleck 公司。3-甲基腺嘌呤（3-MA）购自 Sigma-Aldrich 公司。 LC3B 和剪切 caspase-3 的抗体来自 Cell Signaling Technology 公司。兔抗人 Beclin 1 和兔抗人 GAPDH 多克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology 公司。山羊抗兔多克隆抗体从康 为世纪公司购买。1.2 细胞培养65人涎腺腺样囊性癌的细胞株 ACC-M 由上海交通大学医学院附属第九人民医院，口腔颌 面外科馈赠。ACC-M 细胞在含 10胎牛血清（Invitrogen 公司），以及 100 U / ml 青霉素/ 链霉素（Invitrogen 公司）的 RPMI 1640（Invitrogen 公司）培养基内培养，培养条件为 37，5CO2。1.3 细胞活力检测70MTT 用于检测存活的细胞数目。经过处理后的培养基中加入 20L/孔 MTT（20,10,5）， 然后在 37下孵育 4h，将 MTT 的结晶溶解在每孔 150LDMSO 中。最后，酶标仪（Tecan 公司）在 490nm 波长中读取吸光度，计算细胞生长的 50抑制浓度（IC50）。1.4 Western blot 检测蛋白提取：处理过后细胞用 PBS 冲洗 3 次，加入蛋白裂解液（RIPA:PMSF=99:1）（碧75云天公司）4冰箱静置 10min，冰上刮取细胞，收集到 EP 管内，放置-80冰箱 30min 后 冰上自然融解，4下 12000rpm 离心 15min 后吸取上清，分装保存于-80。蛋白定量及变 性：用 BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天公司）检查各样本蛋白质浓度。将各蛋白样本按照说 明书加入上样缓冲液及 reducing agent（Fermentas 公司），PCR 仪 99变性 10min 后立即置 于冰上保存。SDS-PAGE 电泳。总蛋白于 12%（LC3-I、LC3-II 和 cleave caspase-3） 及 10%80（Beclin-1）分离胶中电泳，60V30min 后转 100V1h，在 100V 下 1.5h 将凝胶内蛋白转移至859095100PVDF 膜(Roch)上。将膜放在含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液中室温孵育 1 小时以封闭膜上的非特异性结合位点。然后与一抗1:500 多克隆兔抗人 LC3B 抗体和 1:1000 多克隆兔抗人 Beclin-1 抗体，1:250 兔抗人多克隆抗 cleave caspase-3 抗体 4摇床震荡过夜。反应后用 TBST 缓冲液洗膜 3 次，加入 1:1000 羊抗兔辣根过氧化物酶标志的二抗（康为世纪），在室温孵 育 1 小时。采用增强型 ECL 发光试剂盒定量检测 LC3-I、LC3-II、Beclin-1 和 cleave caspase-3 的表达情况， 本实验以 GAPDH 作为内参。1.5 透射电子显微镜透射电子显微镜检测在 ACC-M 细胞内自噬体。经过处理的细胞用胰蛋白酶消化，并在37下用含 4的多聚甲醛和 2.5戊二醛及 0.1M 的二甲胂酸钠缓冲液中固定 4h，样品经 过二甲砷酸缓冲液洗涤后，再次在 1四氧化锇固定 4-6h，然后在乙醇中脱水，嵌入在树脂 中，并切成超薄切片。最后使用透射型电子显微镜（菲利普斯 CM-10）进行观察。2结果2.1 Obatoclax 在 ACC-M 细胞诱导自噬自噬被激活时，LC3-I 脂化形成 LC3-II，定位于自噬体膜上。Obatoclax 处理后的 ACC-M 细胞中 LC3-I 向 LC3-II 的转换，并且具有浓度依赖性（图 1A）和时间依赖性（图 1B）。 如图 2 所示透射电子显微镜下发现 Obatoclax 处理的细胞（图 2C, D）中的自噬结构比对照 细胞（图 2A, B）明显增多。我们还发现，细胞中线粒体的肿胀。图 1 Obatoclax 处理后的 ACC-M 细胞中 LC3-I 向 LC3-II 的转换，A 表示随浓度增加 LC3-I 向 LC3-II 的转 换增多；B 表示随时间增加 LC3-I 向 LC3-II 的转换增多。Fig. 1 Obatoclax induced time-dependent and concentration-dependent accumulation of LC3-II in ACC-M cells，AThe conversion from LC3-I to LC3-II increased as the concentration of Obatoclax increased. B The conversion from LC3-I to LC3-II increased with time.105110115120图 2A、B 显示正常 ACC-M 细胞在透射电镜下的形态，C、D 显示在透射电镜下 Obatoclax 处理 48h 后大量 自噬体结构形成Fig. 2 A, B show normal ACC-M cell morphology under the transmission electron microscope, C, D show a large number of autophagosomes formation after Obatoclax treated for 48h under the transmission electron microscope2.2 药物抑制 Obatoclax 诱导的自噬促进细胞凋亡本研究使用两种公认的自噬抑制剂：3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）。 3-MA 抑制能够 PI3 激酶，而型 PI3K 是诱导自噬的主要分子通路。而 CQ 能够抑制自噬体和溶 酶体的融合,阻断自噬体的成熟。本研究结果表明：3-MA 可以一定程度抑制 LC3 的转换;另 一方面 CQ 能有效地抑制自噬体的成熟和 LC3-II 在溶酶体内的降解,反映自噬被阻断。ACC-M 细胞在含有 5 mM 3-MA 和 5M Obatoclax 培养基内培养 48 小时后，如图 3 所示，细胞活力分析提示 Obatoclax 的细胞毒性比对照组(只含 5MObatoclax)升高，其 IC50 值从 10m 减少到 3m。当细胞在 20MCQ 预处理 2h 后再加入 5MObatoclax,也能得 出类似的结果。此外，如图 4 所示 western blot 结果提示 3-MA 抑制自噬后 caspase-3 裂解显 著增多。这些结果表明，抑制 Obatoclax 诱导自噬可以促进细胞凋亡。图 3MTT 实验结果显示 3-MA+Obatoclax 共同培养 48h 后细胞抑制率明显高于 Obatoclax 组Fig. 3 The MTT assay result showed that the cell inhibition rate was significantly higher when ACC-M cells were co-culture with 3-MA and Obatoclax for 48h than Obatoclax alone125130135140145150图 4 3-MA 有效抑制 Obatoclax 诱导的自噬，同时引起 caspase-3 的裂解Fig. 4 3-MA effectively inhibited Obatoclax-induced autophagy, and caused the cleavage of caspase-33讨论许多前期临床研究已证实在各种血液肿瘤细胞，包括慢性粒细胞白血病，淋巴瘤和骨髓 瘤6，固体肿瘤，包括非小细胞肺癌，前列腺癌，结肠癌和子宫颈癌中 Obatoclax 均有抗肿 瘤作用7。现在，它在不同类型的恶性肿瘤如小细胞肺癌等治疗已经进入期临床试验8。 作为一个 BH3 结构类似物，合成 Obatoclax 的目的是要拮抗抗凋亡 Bcl-2 蛋白。它已被 证明能够有效诱导线粒体途径的凋亡,并且依赖于 BAX 和 BAK9。最近的研究表明 Obatoclax 同时诱导自噬，这与我们的结果相一致，可能是因为 Obatoclax 能够将 Beclin 1 从 Beclin 1 与 BCL-2 的结合中释放出来从而诱导自噬10。然而，Obatoclax 诱导的自噬与凋亡之间的关 系错综复杂，在不同类型的肿瘤细胞，对不同的刺激和不同的环境下自噬与凋亡之间存在截然不同的关系。A Eisenberg-Lerner 总结为：自噬可起合作、拮抗或者促细胞凋亡的作用11。 在这项研究中，我们提供的证据表明 Obatoclax 诱导的自噬能够减少细胞凋亡。细胞活力实验及 westernblot 数据表明 Obatoclax 本身并没有引起 ACC-M 细胞明显的凋亡，但当自 噬受到 3-MA 或 CQ 抑制后，细胞凋亡明显增加。Pan10等人发现在食道癌，骨肉瘤的肿瘤 细胞株中，Obatoclax 诱导的自噬具有细胞保护作用，本实验结果与之相一致。自噬这种抗凋亡的作用可能解释为：首先当能量和营养缺乏时，自噬降解细胞器和大分 子提供的能量和营养以维持细胞存活。当肿瘤细胞受到化疗或放疗刺激后，自噬能够去除受 损的细胞器（如线粒体），折叠的蛋白质和活性氧（ROS）从而保持基因组的完整性12-13。 因此，抑制在乳腺癌，前列腺癌和结肠癌细胞的自噬能够有效增强放疗诱导的凋亡14-15。4结论本研究证明 Obatoclax 能够诱导在人唾液腺腺样囊性癌 ACC-M 细胞中诱导自噬，并且 证实 Obatoclax 诱导的自噬具有保护细胞的作用。而唾液腺腺样囊性癌细胞中的自噬与凋亡 的关系，及其分子机制尚待进一步研究。参考文献 (References)1551 Rapidis AD, Givalos N, Gakiopoulou H, Faratzis G, Stavrianos SD, Vilos GA, et al. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Clinicopathological analysis of 23 patients and review of the literature J. Oral Oncol, 2005. 41:328-335.1601651701751801852 Norberg-Spaak L, Dardick I, Ledin T. Adenoid cystic carcinoma: use of cell proliferation, BCL-2 expression, histologic grade, and clinical stage as predictors of clinical outcome J. Head Neck, 2000, 22(5):489-497.3 Chen N, Karantza-Wadsworth V. Role and regulation of autophagy in cancer J. Biochim Biophys Acta, 2009,1793: 1516-23.4 Giansanti V, Torriglia A, Scovassi AI. Conversation between apoptosis and autophagy: "Is it your turn or mine?" J Apoptosis, 2011,16(4):321-3335 Marquez RT, Xu L. Bcl-2:Beclin 1 complex: multiple, mechanisms regulating autophagy/apoptosis toggle switch J. Am J Cancer Res, 2012, 2(2):214-21.6 M. Konopleva, J. Watt, R. Contractor, T. Tsao, D. Harris, Z. Estrov, W. Bornmann, et al. Mechanisms of antileukemic activity of the novel Bcl-2 homology domain-3 mimetic GX15-070 (Obatoclax) J. Cancer Res,2008, 68 (9) :3413-3420.7 T. Oltersdorf, S.W. Elmore, A.R. Shoemaker, R.C. Armstrong, D.J. Augeri, B.A. Belli, et al. An inhibitor ofBcl-2 family proteins induces regression of solid tumours J. Nature, 2005, 435(7042):677-681.8 Paik PK, Rudin CM, Pietanza MC, Brown A, Rizvi NA, Takebe N, et al. A phase II study of Obatoclax mesylate, a Bcl-2 antagonist, plus topotecan in relapsed small cell lung cancer J. Lung Cancer, 2011,74(3):481-485.9 JI X G, DENG Y Y, WANG P. Characters of atmosphere pressure, pure oxygen fixed bed gasification of seven kinds coalJ. Clean Coal Technology, 2004, 25(4): 50-52.JI X G, DENG Y Y, WANG P. McCoy F, Hurwitz J,McTavish N, Paul I, Barnes C, O'Hagan B, et al. Obatoclax induces Atg7-dependent autophagy independent of beclin-1 and BAX/BAK J. Cell Death Dis, 2010, 16;1:e108.10 Pan J, Cheng C, Verstovsek S, Chen Q, Jin Y, Cao Q. The BH3-mimetic GX15-070 induces autophagy, potentiates the cytotoxicity of carboplatin and 5-fluorouracil in esophageal carcinoma cells J. Cancer Lett, 2010,293(2):167-174.11 Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon HU, Kimchi A. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them J. Cell Death Differ, 2009, 16(7):966-975.12 Karantza-Wadsworth V, Patel S, Kravchuk O, Chen G, Mathew R, Jin S et al. Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis J. Genes, 2007, 21: 1621-1635.13 Mathew R, Kongara S, Beaudoin B, Karp C, Bray K, Degenhardt K et al. Autophagy suppresses tumor progression by limiting chromosomal instability J. Genes Dev, 2007, 21:1367-1381.14 Paglin S, Hollister T, Delohery T, Hackett N, McMahill M, Sphicas E et al. A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles J. Cancer Res, 2001, 61: 439-444.15 Ito H, Daido S, Kanzawa T, Kondo S, Kondo Y. Radiation-induced autophagy is associated with LC3 and its inhibition sensitizes malignant glioma cells J. Int J Oncol, 2005, 26:1401-1410.