ASIC1a 开放诱导大鼠关节软骨细胞基质【推荐论文】 .doc

精品论文ASIC1a 开放诱导大鼠关节软骨细胞基质代谢失衡的作用及机制研究唐杰1，胡伟2，吴繁荣1，葛金芳1，陈飞虎15（1. 安徽医科大学药学院，合肥 230032；2. 安徽医科大学第二附属医院，合肥 230032）摘要：目的：研究 ASIC1a 开放对胞外酸化诱导的 AA 大鼠关节软骨细胞代谢失衡的作用及部分机制。方法：实验分正常组（pH 7.4）、pH 6.0、特异性阻断剂 PcTX-1、沉默组、非特 异性阻断剂 Amiloride 处理的酸化组，对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上10清中 GAG 的含量，氯胺 T 法检测 HYP 的含量，ELISA 法检测 MMP-2、TIMP-2 的含量。 Western blot 法检测酸化及阻断 ASIC1a 后 ERK1/2、p38MAPK 磷酸化蛋白的表达。结果： 阻断酸敏感离子通道后，能明显抑制胞外酸化引起的 GAG、HYP 和 TIMP-2 的水平降低 (p<0.01)，对 MMP-2 的水平降低抑制作用较弱(p<0.01)。酸刺激能引起 ERK1/2、p38MAPK 磷酸化水平升高，阻断酸敏感离子通道后磷酸化水平升高受到抑制(p<0.01)。结论：ASIC1a15参与了酸诱导的大鼠关节软骨细胞基质代谢的失衡，并且激活 ERK1/2 和 p38MAPK 信号通 路，阻断 ASIC1a 能抑制基质代谢的失衡，减少 AA 大鼠关节软骨的损伤。 关键词：酸敏感离子通道 1a；类风湿关节炎 2；关节软骨细胞；基质代谢；丝裂原激活的蛋 白激酶中图分类号：R968.420ASIC1a contributes to the matrix metabolism imbalance of articular chondrocytes induced by extracellular acidosisTANG Jie1, HU Wei2, WU Fanrong1, GE Jinfang1, CHEN Feihu1(1. School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230032;2. The Second Hospital of Anhui Medical University, Hefei Anhui230601)25Abstract: AIM To study the effect of blocking ASIC1a on the cell metabolism of the rats articularchondrocytes with extracellular acidosis and its possible molecular mechanism. METHODS Establish and identify the ASIC1a-silencing model. The GAG content of cell culture supernatant was determined by dimethyl-methylene blue spectrophotometric assay, while HYP content by chloramine T assay. ELISA assay was used to measure MMP-2, TIMP-2 content. Furthermore, the ERK1/2, p38MAPK30phosphorylation protein expression level were tested by western blot assay. RESULTS Blocking acidsensing ion channels could significantly inhibit the famous decrease of GAG, HYP and TIMP-2 levels induced by extracellular acidification, while the effect of MMP-2 was weaker. CONCLUSION Blocking ASIC1a could regulate rat articular chondrocyte matrix metabolism and thereby inhibit the AA rats articular cartilage damage induced by acidosis.基金项目：国家自然科学基金（81271949）高等学校博士学科点专项科研基金（20093420110005） 作者简介：唐杰（1989-），男，硕士研究生，从事微生物与生化药学研究通信联系人：陈飞虎（1962-），男，博士生导师，教授，主要从事分子药理及中药活性成分研究. E-mail:cfhchinasohu.com- 5 -35Key words: Acid sensing ion channel 1a; Rheumatoid arthritis; Articular chondrocytes; Matrix metabolism; Mitogen-activated protein kinase0引言酸敏感离子通道（acid-sesing ion channels, ASICs）是一类由胞外酸化后被 H+激活的阳 离子通道，激活的 ASICs 导致胞外 Na+Ca2+内流并激发各种病理生理效应1，其中 ASIC1a40因介导 Ca2+内流并具有广泛的生物学功能和重要的病理学意义成为研究的热点1,2。Xiong 等3用特异性阻滞剂 Psalmotoxin-1(PcTx-1) 阻断 ASIC1a，发现其不仅特异性阻断由 ASIC1a 介导的电流，而且能特异性抑制细胞内 Ca2+的超载，使脑缺血病灶模型的梗死体积显著减小， 敲除 ASIC1a 基因或用 ASIC1a 阻滞剂都可以保护缺血性脑损伤。本课题组前期研究证实， ASICs 非特异性阻滞剂 Amiloride 通过阻断酸敏感离子通道减轻 AA 大鼠关节软骨破坏，发45挥关节软骨保护作用4。关节软骨是覆盖在关节内骨质表面的一层软骨组织，由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix ,ECM)组成。软骨细胞来源于间充质干细胞，只占软骨组织体积的 3%， 其主要功能是通过分泌 II 型胶原（type II collagen）和蛋白多糖(aggrecan, Acan)以及基质金 属 蛋 白 酶 (matrix metalloproteinas,MMPs) 和 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 因 子 (tissueinhibitor of50metalloproteinas, TIMPs)保持关节软骨的功能。在正常生理状况下，软骨基质的合成以及酶 及酶抑制剂之间保持动态平衡，调节软骨 ECM 的产生和破坏，以维持软骨正常的代谢和功 能。但在 RA 等病理状态下，软骨细胞基质代谢异常直接导致关节软骨的结构和功能丢失。 研究表明，胞外酸化对软骨细胞基质代谢具有重要的作用5,6,7。那么这种作用是否与酸感受 器 ASICs 有关？55为此，本研究以大鼠关节软骨细胞为试验对象，从细胞和分子水平深入开展 ASIC1a 对 大鼠关节软骨细胞的功能和代谢以及细胞内信号通路的研究。旨在进一步探索 ASIC1a 在关 节软骨细胞功能和代谢中的作用，初步阐明阻断 ASIC1a 对 AA 大鼠关节软骨保护的细胞和 分子机制，以丰富人们对 ASIC1a 功能的认识，为 RA 的防治提供新思路。1试验材料与方法601.1 动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重 160 g ± 20 g；由安徽医科大学实验动物中心提供。合格证号：皖医实动准字第 01 号。1.2 材料与试剂RNA 引物，由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine2000 通用转染试剂盒，65Invitrogen 公司产品；Syber Green 染料，Fermentas 公司产品；Amiloride，为 sigma 公司产 品；蛋白磷酸酶抑制剂，roche 公司产品；ASIC1a 抗体，Santa Cruz 公司；P38 MAPK ，Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(12F8) Antibody，Cell signaling Technology 公司产品；p44/p42 MAPK(ERK1/2)，Phospho-p44/p42 MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204) Antibody，CST公司产品；MMP-2 、TIMPELISA 试剂盒：美国 RD 公司；羟脯氨酸标准品：美国 sigma 公70司产品；硫酸软骨素标准品：美国 sigma 公司产品1.3 软骨细胞的分离鉴定取四周龄左右 SD 大鼠，采用胰酶-型胶原酶消化法分离出原代软骨细胞，放入 37，5%CO2 培养箱培养，48h 后首次换液，一周后传代。将已经消毒的盖玻片（20 mm2）置于 培养皿（90 mm2）中，按 2×104 个/mL 的密度将软骨细胞接种于培养皿中，5 天后，细胞爬75片结束，常规操作，甲苯胺蓝染色，型胶原免疫组化鉴定软骨细胞。1.4 酸化刺激和药物处理将软骨细胞分组如下：pH 7.4 正常组、pH 6.0 组、pH 6.0+Amiloride 组（100M）、pH6.0+PcTX1 组（100ng/ml）、pH6.0+siRNA 组。各组于给药 30 min 后，加入 pH 6.0 的 培养基共培养 3 h，换回 pH7.4 的正常培养基培养 48h，收集上清，检测阻断 ASIC1a 对酸80化引起的含量变化的影响。其次，细胞分组如下：pH 7.4 正常组、pH 6.0 组、pH6.0+PcTx-1 组（100ng/ml）检测酸化及阻断 ASIC1a 对 P38MAPK 和 ERK1/2 磷酸化的影响。1.5 对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中 GAG 的含量收集软骨细胞培养液，3000 rpm 离心，取上清液 500L 和 500L 木瓜蛋白酶缓冲液（木85瓜蛋白酶 20mg、乙二胺四乙酸 584.6mg、半胱氨酸 6mg，溶于蒸馏水至 50ml 体系）混合，55消化 12h 后，取上清液 200L 加入 2.5 mL 对二甲基亚甲基蓝溶液（16 mg 对二甲基亚 甲基蓝、3.04g 甘氨酸、2.37g 氯化钠、95 mL 0.1M HCL 加双蒸水至 1L，摇匀，调 PH3.0）, 在波长 525 nm 处用分光光度计比色，读取吸光度值，代入标准曲线计算软骨细胞培养液中 GAG 的含量。901.6 氯胺 T 法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中 HYP 的含量精密吸取 2mLHCl（12 mol/L）加到含 2mL 培养液的 EP 管中，110水浴 12h（将 EP管中 4mL 液体转移至安瓿瓶中，拉丝封口），水浴后可见黑色残渣，将滤纸剪成 2cm 半径 大小，过滤，取滤液 2mL，配制 12 mol/LNaOH 溶液调 pH 至 6.5-7.0（可见培养液酸中 性碱性），取上面调过 pH 值的滤液 0.5mL，依次加入 2mL 异丙醇和 0.5mL 氯胺 T 试剂95（1.27g 氯胺 T、50%异丙醇 20 mL，加双蒸水稀释至 100mL，摇匀),25放置 25min.最后加 入 0.5mL 恩里克试剂(对二甲氨基苯甲醛 15g 置于 100mL 容量瓶中，用 65mL/35mL 异丙醇/高氯酸（21）定容至 100mL，临用前配制)混匀后，65水浴，显色 20min，冷却后读取560nm 吸光度。将吸光度值代入标准曲线计算软骨细胞培养液中 HYP 的含量。1.7 ELISA 法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中 MMP-2、TIMP-2 的含量100105110115从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，标准品孔各加不同浓度的标准品 50L；样本孔先加待测样本 10L，再加样本稀释液 40L；空白孔不加。除空白孔外，每孔加入辣 根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100L，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱 温育 60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水 纸上拍干，如此重复洗板 5 次。每孔加入底物 A、B 各 50L，37避光孵育 15min。每孔加入终止液 50L，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值绘制标准曲线： 在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应 OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回 归曲线。将检测的 OD 值代入标准曲线计算软骨细胞培养液中 MMP-2/9、TIMP-1/2 的含量。1.8 Western Blot 检测酸化激活 ASIC1a 引起的 p-38MAPK 和 ERK1/2 信号通路的 变化加入 pH 6.0 的培养基培养 3 h 后，收集细胞，每瓶加入 800l 强 RIPA 裂解液（含10%PMSF）裂解 30 min，吹打将细胞转移到 1.5ml EP 管中，离心 30min，取上清，使用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白与 5x 上样缓冲液以 4:1 的比例混合，100°C 煮10 min 变性。蛋白样品进行 SDS-PAGE，电泳分离，经 PVDF 膜转移，5%脱脂奶粉封闭 3 h， 随后加入一抗（1:500） 孵育。TBST 洗去多余的一抗，加入相应二抗，孵育，漂洗，ECL 发光显影。结果应用 Image-Pro Plus 处理 。1.9 统计学分析采用 SPSS 13.0 软件实验结果均以均数±标准差（ x ±s）表示，所有统计分析均采用 方差分析完成。各组数据运用单因素方差分析进行统计检验，P<0.05 认为差异有统计学意 义。1202结果2.1 软骨细胞的分离鉴定125甲苯胺蓝染色结果显示：大鼠关节软骨细胞爬片经染色后,软骨细胞单层生长，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，清晰可见 12 个核仁，细胞外基质为浅蓝色（Fig. 1A）。 免疫组织化学染色结果显示：大鼠关节软骨细胞胞浆被染成棕黄色，细胞相互接触少的地方 棕色较淡，细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。说明在培养的大鼠关 节软骨细胞和细胞外基质中有型胶原表达，即可以从细胞中分泌型胶原到细胞外基质， 证实本研究中分离并传代培养的细胞为关节软骨细胞（Fig. 1B）。130135140145图 1 体外培养大鼠关节软骨细胞鉴定Fig. 1 Identification of articular chondrocytes. A. Biosynthesis of glycosaminoglycan was shown by positive staining with toluidine blue (×100). B. Positive result of subculture of chondrocytes for type II collagen (×100). Typecollagen protein expression was detected by immunocytochemical staining and glycosaminoglycanexpression was detected by toluidine blue staining.2.2ASIC1a 激活对软骨细胞 GAG 代谢的影响结果如 Fig. 2 所示，酸化刺激组关节软骨细胞培养液中 GAG 的含量与正常组比较显著 下降（P<0.01）；与酸化刺激组相比，ASIC1a 特异性阻滞剂 PcTx-1（100 ng/mL）和 ASIC1a siRNA 可显著增加 GAG 的含量（P<0.01）。ASICs 非特异性阻滞剂 Amiloride(100M)也可 显著增加 GAG 的含量（P<0.01）。图 2 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 GAG 代谢的影响Fig. 2 Effect of ASIC1a on GAG levels in acid-induced articular chondrocytes by1,9-dimethylmethylene blue Spectrophotometric.( Normal group, pH6.0 group, pH6.0+100ng/mL PcTX-1 group, pH6.0+ASIC1a siRNA group, pH6.0+100M Amiloride group). Data are expressed as mean ± SD, n = 6 per group. #P <0.01 vs. nomal group,*P<0.01 vs. pH 6.0 group.2.3ASIC1a 激活对软骨细胞 HYP 代谢的影响结果如 Fig. 3 所示，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞培养液中 HYP 的含量与正常组比较显著下降（P<0.01）。与酸化刺激组相比较，ASIC1a 特异性阻滞剂 PcTx-1（100 ng/mL）和ASIC1a siRNA 可显著增加 pH6.0 组抑制的 HYP 表达（P<0.01），ASICs 非特异性阻滞剂Amiloride(100M)也可显著增加 HYP 表达（P<0.01）。- 10 -150155图 3 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 HYP 代谢的影响Fig. 3 Effect of ASIC1a on HYP levels in acid-induced articular chondrocytes by chloramine T method. (Normal group, pH6.0 group, pH6.0+100 ng/mL PcTx-1 group, pH6.0+ASIC1a siRNA group, pH6.0+100M Amiloride group). Data are expressed as mean ± SD, n = 6 per group. #P <0.01 vs. nomal group, *P<0.01 vs. pH 6.0 group.2.4ASIC1a 激活后对软骨细胞 MMP-2 和 TIMP-2 的影响对于 MMP-2，结果如 Fig. 4 所示，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞培养上清中 MMP-2 的含量与正常组比较显著下降（P<0.01）。与酸化刺激组相比较，ASIC1a 特异性阻滞剂 PcTx-1（100 ng/mL）组可 MMP-2 含量显著增加（P<0.01），ASIC1a siRNA 可增加 MMP-2 含量（P<0.05），ASICs 非特异性阻滞剂 Amiloride(100M) 可显著增加 MMP-2 含量（P<0.01）。160图 4 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 MMP-2 代谢的影响Fig. 4 Effect of ASIC1a on MMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA. (Normal group, pH6.0 group, pH6.0+100 ng/mL PcTX-1 group, pH6.0+ ASIC1a siRNA group, pH6.0+100M Amiloride group).165Data are expressed as mean ± SD, n = 6 per group. #P <0.01 vs. nomal group, *P<0.05 vs. pH 6.0 group.*P<0.01 vs. pH 6.0 group.170对于 TIMP-2，结果如 Figure. 5 显示：pH6.0 组大鼠关节软骨细胞培养上清中 TIMP-2的含量与正常组比较显著下降（P<0.01），ASIC1a 特异性抑制剂 PcTx-1 组（100 ng·mL-1） 和 ASIC1a siRNA 可 显 著 增 加 TIMP-2 含 量 （ P<0.01 ） 。 ASICs 非 特 异 性 阻 滞 剂 Amiloride(100M)组可显著增加 TIMP-2 含量（P<0.01）。175180图 5 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 TIMP-2 代谢的影响Figure. 5 The effect of ASIC1a on TIMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA (Normal group, pH6.0 group, pH6.0+100ng·mL-1PcTx-1 group, pH6.0+ASIC1a siRNA group,pH6.0+100mg·L-1 Amiloride group). Data are expressed as mean ± SD, n = 6 per group. #p <0.01 vs. nomal group, *p<0.01 vs. pH 6.0 group.2.5 ASIC1a 激活对软骨细胞 ERK1/2 和 p38MAPK 磷酸化的影响对于 p38 MAPK，结果见 Figure. 6 所示，酸化刺激大鼠关节软骨细胞 3h 后，与正常组 比较，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞 p38 MAPK 蛋白磷酸化明显增加，且差异具有显著性（P <0.01）。与酸化刺激组比较，ASIC1a 特异性阻滞剂 PcTx-1（100 ng·mL-1）组显著抑制 了酸化刺激大鼠关节软骨细胞 p38 MAPK 蛋白磷酸化表达（P <0.01）。185190195图 6 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 p38MAPK 蛋白磷酸化的影响：与对照组相比：#p <0.01；与酸化刺激组相比：*p<0.01.Figure. 6 Analysis of the effect of ASIC1a on p38MAPK phosphorylation in articular chondrocytes. Data are expressed as mean ± SD, n = 3 per group. #p <0.01 vs. nomal group, *p<0.01 vs. pH 6.0 group.对于 ERK1/2，结果如 Figure. 7 所示。酸化刺激大鼠关节软骨细胞 3h 后，与正常组比 较，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞 ERK1/2 蛋白磷酸化明显增加，且差异具有显著性（P<0.01）。与酸化组比较，ASIC1a 特异性阻滞剂 PcTX-1（100 ng·mL-1）预处理组显著减少 了酸化刺激大鼠关节软骨细胞 ERK1/2 蛋白的磷酸化（P <0.01）。图 7 ASIC1a 对大鼠关节软骨细胞 ERK 蛋白磷酸化的影响：与对照组相比：#p <0.01；与酸化刺激组相比：*p<0.01.Figure. 7 Analysis of the effect of ASIC1a on ERK1/2 phosphorylation in articular chondrocytes. Data are expressed as mean ± SD, n = 3 per group. #p <0.01 vs. nomal group, *p<0.01 vs. pH 6.0 group.3讨论200205210215220软骨细胞能够感受周围环境的变化而不断调整细胞外基质的代谢活动。适当的 pH 值会促进关节软骨细胞和胞外基质的代谢，不适当的 pH 值（pH 小于 7.0）不仅影响关节软骨细 胞的代谢，而且还能诱导分解基质的酶表达和活性，导致软骨细胞外基质的破坏8,9。其中， MMPs 几乎能降解所有的细胞外结缔组织基质。在正常情况下，其与 TIMPs 以 1:1 不可逆结 合，对 MMPs 起抑制作用，使 ECM 始终处于降解速度不快于更新速度。ASICs 是一类由胞外酸化后被 H+激活的阳离子通道10。胞外酸化能激活 ASICs 各亚基 的开放，影响 ASICs 的转运，导致细胞进行 Na+、Ca2+等离子转运，Ca2+ 作为重要的第二 信使并进一步影响细胞的生命活动。本研究发现，ASIC1a 调控胞外酸化诱导的软骨细胞 MMP-2 以及相应的 TIMP-2 的合成，并影响 GAG、HYP 的代谢和更新。 pH6.0 胞外酸化处 理软骨细胞 3h 后，正常培养 48h，pH6.0 组显著降低培养基中 GAG 和 HYP 的含量，与 Wilkins RJ 等3研究胞外酸化对软骨细胞基质代谢的作用结果相一致。此外，与正常组相比，胞外 pH6.0 酸化刺激可使关节软骨细胞 MMP-2、TIMP-2 含量分别下降 51.39%、79.05%，而阻断 ASIC1a 后则可使 MMP-2、TIMP-2 的含量分别恢复至正常含量的 71.79%、71.89%，提示 ASIC1a 激活可导致软骨细胞分泌 MMP2 和 TIMP2 减少，其中 MMP2 的减少较为缓慢，而 TIMP2 的含量则呈现快速下降，从而破坏 MMPs 和 TIMPs 间的平衡，导致 MMPs 含量水 平相对增加，关节软骨细胞外基质降解加剧，阻断 ASIC1a 可通过恢复 MMPs 和 TIMPs 的 相对平衡，从而保护 AA 大鼠关节软骨。众多研究表明，MAPKs 信号通路参与了软骨细胞的基质代谢11,12，其中 ERK1/2 和 p38MAPK 信号蛋白的激活是调控 MMPs 表达的重要因素13,14。阻断软骨细胞的 p38 MAPK 信 号通路可抑制 MMPs 的活性和表达，抑制关节软骨 COII、PG 的降解15,16。而且 ERK1/2、 p38MAPK 信号通路参与了乳铁蛋白调控软骨细胞的代谢 MMPs 和蛋白多糖的过程17。本实 验证实，阻断酸敏感离子通道，可以抑制酸刺激引起的 ERK1/2 和 p38MAPK 的磷酸化，而 至于是否会由此调控 MMPs/TIMPs 的表达，是下一步研究的方向和目标。4结论225230本研究证实大鼠关节软骨细胞的细胞膜中存在 ASIC1a 的表达。大鼠关节软骨细胞ASIC1a 激活可导致细胞内 Ca2+浓度升高，持续升高的 Ca2+与大鼠关节软骨细胞的损伤有关， 阻断 ASIC1a 可有效抑制酸化刺激诱导的大鼠关节软骨细胞损伤，对关节软骨细胞发挥保护 作用。阻断 ASIC1a 还可增加软骨细胞对基质的合成，恢复 MMPs 与 TIMPs 的代谢平衡。 因此阻断 ASIC1a 可通过保护关节软骨细胞，进而增加软骨细胞对基质的合成，减少 MMPs 对软骨基质的降解，抑制关节软骨的损伤，恢复关节软骨的结构和功能，从而保护 RA 关节 软骨。进一步研究发现 ASIC1a 的激活参与了 p38 MAPK/和 ERK1/2 的磷酸化。有理由相信， ASIC1a 是 RA 关节软骨损伤的关键因素，ASIC1a 激活可导致关节软骨细胞损伤、基质合成 减少、MMPs 和 TIMPs 平衡破坏，使关节软骨基质降解相对增加，形成关节软骨的结构和 功能丢失，造成关节软骨损伤，最终成为 RA 致残的主要原因。抑制 ASIC1a 的激活可保护 软骨细胞的损伤并恢复软骨细胞的代谢平衡，是 RA 防治的新目标。致谢（可选）235感 谢 陈 飞 虎 教 授 对 本 实 验 的 悉 心 指 导 与 帮 助 ， 本 项 目 受 国 家 自 然 科 学 基 金（No.30901526）及高等学校博士学科点专项科研基金（342011 000 5）资助。参考文献 (References)2402452502552602652702751 Lin YC, Liu YC, Huang YY, Lien CC. 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