PDTC对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1mRNA表 的调节作用1.doc

精品论文 http:/www.paper.edu.cn PDTC对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1mRNA表 的调节作用1王大龙冷玉芳兰州大学第一医院麻醉科，兰州（730000）dpwdl8278163.com摘要：目的：探讨二硫代氨基吡咯烷 (pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)对内毒素（LPS）诱导急性肺损伤大鼠肺组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA 表达的影响及其可能 的保护机制。方法：72 只 Wista 大鼠随机分为三组：对照组（C 组 ），LPS 组(L 组)，PDTC+LPS 组(P 组)。其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组，每组六只。 观察大鼠肺组织病理变化，肺组织湿/干重(W/D)比变化，同时使用 RT-PCR 法检测大鼠肺组 织 ICAM-1mRNA 表达。结果：与 C 组比，L 组大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织 ICAM-1mRNA 表 达明显增强（P<0.05），病理学显示肺组织结构破坏严重，肺组织湿 /干重比（W/D）明显 增大（P<0.05）。与 L 组比，P 组应用 PDTC 后 ICAM-1mRNA 表达明显减少（P<0.05）,肺组 织结构的破坏有明显减轻，肺组织湿/干重比（W/D）明显减小（P<0.05）。结论：应用 PDTC 能明显抑制 ICAM-1mRNA 表达，对 LPS 诱导急性肺损伤有一定保护作用。提示 PDTC 的肺保 护作用机制可能与抑制 ICAM-1 的转录，进而抑制炎症反应有关。关键词：PDTC；核因子-B；ICAM-1；内毒素；肺损伤中图分类号：R655.31. 引 言：急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)是由严重感染、创伤和体克等多种病 因所致的弥漫性肺实质损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过 度表达，伴有多种炎症介质的产生。炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸 多肺外器官，其中，核因子 -B（NF-B）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。 多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有B 位点，如细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、白 细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）等。活化的 NF- B 可调控上述介质基因的表达 1,2。研究证明，抗氧化剂二硫代氨基吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)能够通过抑制重要的核转录因子-B(nuclearfactor-kappaB，NF- B)活化，减少致炎细胞因子表达与合成释放3.4 ，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模 型，研究 PDTC 对 LPS 诱导急性肺损伤大鼠肺组织 ICAM-1mRNA 影响，以探讨 PDTC 肺损伤的 保护作用及其机制。1 本课题得到甘肃省基础研究计划资助（0710RJZA038 ）- 7 -精品论文2. 材料与方法2.1材料实验动物及主要试剂： Wista 大鼠（由兰州大学医学院实验动物中心提供） 72 只，雌 雄各半，200250g，LPS（EColi055:B5）购自 sigma 公司，PDTC 购自 sigma 公司，核酸提 取试剂购自百泰克，RNA 试剂盒购自 Fermentas 公司。72 只 Wista 大鼠随机分为三组：对照组（ C 组），LPS 组(L 组)，PDTC+LPS 组(P 组)。 其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组，每组六只。L 组和 P 组采用腹腔注射 LPS8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，C 组注射同体积的生理盐 水。P 组在腹腔注射内毒素前 30min，尾静脉注射 PDTC120mg/kg（60mg/ml），L 组和 C 组 给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点，10水合氯醛 350mg/kg 腹腔注射麻醉，开 胸心脏放血处死，采集标本。2.2方法221RT-PCR 检测用 PCR 专用器械迅速取右肺下叶，经预冷的 DEPC 水冲洗表面的血液后立即置于液氮中 速冻，-80冰箱保存，待用于 RT-PCR。用 RNA 提取试剂 Trizol 提取肺组织总 RNA，反转 录合成 cDNA 第一条链。取反转录产物 2l 进行 PCR 反应（94变性 5min，59复性 30s，72延伸 1min，35 个循环）。扩增组织中 ICAM-1 的引物为:5-AGGTATCCATCCATCCCACA-3和 5-AGTGTCTCATTCCCACGGAG-3，片段长度为 388bp；扩增内对照-actin 的引物为: -actin 引物 5-GTGGGCCGCTGTAGGCACCAA-3和 5-CTCTTTGATGTCGCACGATTTC-3，片 段长度为 540bp。由上海赛百盛有限公司合成。PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙 锭染色显示，凝胶图像分析系统分析，以 ICAM-1mRNA/-actinmRNA 电泳带的荧光强度比 值作为 ICAM-1mRNA 的表达量指标。222肺组织病理检查取左肺下叶，4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，HE 染色后光镜下观察肺组织形态学变化。223 肺组织湿/干重比值（W/D）取左肺下叶，滤纸拭去表面血液，称湿重后（W）置于 80烤箱烘烤 48 小时使肺组织 达恒重后称干重（D），计算 W/D 比值，224 统计学处理采用 SPSS11.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（ x ±s）表示。统计 分析采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。3. 结果31RT-PCR 检测 ICAM-1mRNA 表达结果C组大鼠肺组中ICAM-mRNA只有少量表达；L组ICAM-1mRNA表达量从注射内毒素后1h就开 始显著增加，与C组有差异（P0.05），直到12h达到高峰；在P组，ICAM-mRNA随时间的变化规律与L组相同，但是应用PDTC后能明显的抑制内毒素引起的ICAM-1mRNA的表达。与L组相比，P组在1、3、6、12h四个时间点ICAM-1mRNA的表达量都显著的降低（P0.05）。见表1、 图1。表 1 各组肺组织中 ICAM-mRNA 的表达水平比较（n=6， x ±s）组别1h3h6h12hC组L组P组0.40±0.0180.72±0.028*0.52±0.023*0.41±0.0260.92±0.023*0.65±0.037*0.39±0.0191.02±0.054*0.73±0.032*0.41±0.0201.12±0.039*0.81±0.020*与 C 组相比，*P<0.05；同一时间点与 L 组相比，P<0.05图 1 各组肺组织中 ICAM-mRNA 的表达水平1，2为C组；3，4，5，6分别为LPS1h、3h、6h、12h组；7，8，9，10分别为PDTC+LPS1h、3h、6h、12h组。32肺组织光镜病理学结果C组在光镜可见肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，无炎症细胞浸润；L组可见片状出血， 光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构，肺间质有严重的水肿、淤血，大量的炎症细胞 浸润；P组，肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显的水肿、淤血，仅有 少量的炎症细胞浸润。见图2。图.2 各组腹腔注射内毒素 6 小时后病理（HE×200）33 肺组织湿/干重比值（W/D）与C组相比，P组和L组W/D比值在相同时间点均明显升高（P0.05），与L组相比P组， W/D比值在相同时间点均明显降低（P0.05）。有统计学意义。表1 各组肺组织中W/D比值（ x ±s，n=6）组别1h3h6h12hC组L组P组4.27±0.164.61±0.08*4.36±0.10*4.26±0.114.83±0.12*4.56±0.24*4.25±0.205.22±0.14*4.83±0.16*4.26±0.235.75±0.27*5.24±0.38*与 C 组相比，*P<0.05；同一时间点与 L 组相比，P<0.054. 讨论在ALI时，影响肺血管内皮细胞的有害物质可破坏内皮细胞的完整性，诱导其血液动力 学和血液流变学的改变，促进肺内皮细胞与循环血细胞的相互作用，导致血管通透性增加， 肺水肿形成。因此，肺血管内皮细胞损伤的评估较为重要，而其释放的粘附分子是损伤活 化的标志物，肺组织W/D的变化可以很好的反映肺泡血管的通透性及肺间质的改变程度。LPS 主要与巨噬细胞表面的Toll受体结合，启动胞内信号传递链，促进 IB亚型的降解并活 化NF-B的DNA结合能力，启动基因转录，表达和释放多种细胞因子，发挥其毒性作用5,6,7。 本研究中，L组注射LPS后，大鼠呼吸加快，肺组织的 ICAM-mRNA表达增强，W/D增加，并且 光镜观察到明显的肺损伤的形态学变化，证明了成功的建立了ALI模型。ICAM-1 是一类大分子糖蛋白，属于免疫球蛋白基因超家族，可以表达于多种类型的细 胞，它通过介导细胞与细胞间，细胞与细胞外基质间的粘附作用，参与一系列生理及病理 过程8。目前的研究认为大量的多形核白细胞（PMN）黏附于肺血管内皮细胞、在肺内扣押 并释放生物活性介质是 ALI 发生的主要机制之一；通过有效的减少或清除肺内的 PMN 而控 制炎症反应，可以减轻 ALI9。ICAM-1 在肺组织中的表达增强 ,一方面通过与其配体即表达 于 PMN 表面的 CD11/CD18 相结合有助于 PMN 与血管内皮细胞相黏附 ,促使 PMN 移行于血 管外;另一方面 PMN 与靶细胞黏附结合后 ,形成了 PMN 与靶细胞之间的一个较紧密且相对稳 定的微环境 ,此微环境有利于 PMN 释放的毒性介质在局部保持较高浓度 ,从而对靶细胞发 挥有效的毒性作用，进而导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释放 10。本研究中，与 C 组 比较，L 组的 ICAM-1mRNA 表达增加，光镜下可见肺泡结构基本消失，肺间质淤血水肿，肺 组织间隙有大量的 PMN 聚集扣押，表明在 LPS 的刺激下，大量激活的 PMN 向肺组织转移， 聚集在肺组织并激活，继而产生肺损伤。同时 ICAM-1mRNA 表达随时间变化增强，炎症反应 加重。ICAM 的表达受到多条信号传导通路的调控。目前研究认为 ICAM-1 的表达可能与 NF- B 的活化有关。NF-B 是一种细胞内普遍存在的转录因子，具有和某些基因启动子区固定 核苷酸序列结合而启动基因转录的功能；正常情况下，与其抑制物 IB 结合，存在于静止期细胞的胞浆中。已证实，ICAM-1 基因启动子上含有 NF-B 结合位点，各种细胞外的刺激信号使胞浆中未活化的 NF-B 激活进入胞核，促进其细胞粘附分子的表达；细胞粘附分子又可反过来进一步活化 NF-B，由此形成一个反馈调节，使炎症不断放大。NF-B 诱导 ICAM-1 表达和增强 PMN 粘附的作用已通过很多试验证实11、12。研究证明，PDTC 是一种抗氧化剂， 也是 NF-B 的特异性抑制剂，可在 NF-B 活化通道的不同水平发挥抑制作用，如抑制 NF- BP65 亚单位，抑制IB（NF-B 抑制剂）的降解或减少 NF-B 的核移位，从而减少致炎 细胞因子表达与合成释放3.4。本研究中，与 C 组相比，P 组 ICAM-1mRNA 表达仍有增加，病 理学显示肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显的水肿、淤血，仅有少 量的炎症细胞浸润，W/D 比值也较大，可能与 PDTC 只干预了部分 ALI 的发病机制有关。与L 组相比，ICAM-1mRNA 表达减轻，病理学损伤减少，W/D 减小。表明 PDTC 通过减少 ICAM-1mRNA 表达，进而减轻 PMN 在肺组织内的聚集和激活，抑制肺损伤时的炎症反应。综上所述，PDTC 预先给药对 LPS 诱导的大鼠 ALI 有一定的保护作用，可能与减少肺组 织的 ICAM-1mRNA 表达，进而抑制 PMN 的聚集和激活有关。参考文献1. 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Results : The rats were injected with LPS, pathology biopsy showed the structure of lung tis sue was serious ly damaged , the wet / dry weight ratio (W / D) of lung tis sue was increas ed s ignificantly,the expres s ion of ICAM-1m RNA was enhanced. Applicat ion of PDTC, compared with us ing of LPS, the damage of lung tis sues structure was s ignificantly reduced, lung wet / dry weight ratio (W / D) was s ignificantly reduced (P <0.05), the expres s ion of ICAM-1m RNA was s ignificantly reduced (P <0.05 ). Conclus ion: PDTC could inhibit the expres s ion of ICAM-1m RNA.Showed the lung protective mechanis m of PDTC may be relate with inhibit ing the transcription of ICAM-1, and inhibit ing inflamma tion ,s o it showed the protective effect in acute lung injury of rats which caused by LPS.Keywords: PDTC；NF- B；ICAM -1；LPS；ALI