大孔树脂分离精制葛根芩连汤的工艺研究.doc

精品论文大集合大孔树脂分离精制葛根芩连汤的工艺研究李君富，韦娟，李肖屹，罗燕，尹蓉莉成都中医药大学，四川成都（611130）E-mail: langzi1655sina.com摘要：目的：优选葛根芩连汤的大孔树脂分离精制工艺；方法：以葛根素与黄芩苷的吸附量及洗脱率为指标，选择树脂型号，并考察上样速度，最大上样量，洗脱剂浓度、用量及洗 脱速度等因素对葛根素及黄芩苷含量的影响；结果：最佳工艺如下：大孔树脂型号为 D141， 上样速度为 2BV·h-1，最大上样量为 4 倍柱体积，洗脱剂为 70%乙醇，洗脱速度为 3 BV·h-1， 洗脱剂用量为 5 倍柱体积；结论：D141 型大孔树脂综合性能优良，适合葛根芩连汤的分离 精制。关键词：大孔树脂；葛根素；黄芩苷；吸附量；洗脱率葛根芩连汤出自伤寒论，由葛根、黄芩、黄连、甘草等四味药组成，具有清热燥湿， 升清止泻等功效，常用来治疗湿热泄泻、急性肠炎、细菌性痢疾等疾病1,临床现已开发出葛 根芩连丸、葛根芩连片等传统剂型。本课题为减小剂量，提高临床疗效，丰富其临床剂型， 拟将其制成分散片。但中药分散片由浸膏入药，虽经醇沉等传统工艺除杂，仍然普遍存在出 膏率大，崩解迟缓的问题。为解决此问题，作者应用近年来广泛运用于中药制剂分离纯化领 域的大孔树脂精制葛根芩连汤，方法简便可行，取得了取得了令人满意的结果。1. 材料和仪器WATERS 2695/2996 型高效液相色谱仪( 美国)；Sartorius BP2110 型电子天平（德国赛 多利斯公司）；所有药材均购于成都市西南大药都；葛根素标准品（中国药品生物制品检定所，批号 (0752-20020)；黄芩苷标准品(中国药品生物制品检定所，批号 110715-200212)；大孔树 脂:D101、DM-301 型（天津市海光化工有限公司），AB-8、X-5、NKA-9 型（天津南开大学 化工厂），D141 型（成都晨光化工研究院）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。2. 方法和结果2.1 含量测定方法的建立2.1.1 HPLC 法测定葛根素的含量参考中国药典2005 版一部中葛根素的含量测定方法进行测定2。色谱条件 色谱柱为 Dikma Diamonsil 柱，检测波长为 250 nm，流速为 1.0mL·min-1，柱温 为 30，流动相为甲醇-水（25：75），理论塔板数按葛根素计不得少于 4000。标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的葛根素标准品 11.96mg,置 25mL 的容量瓶中，甲 醇定容后，从中精密吸取 2mL，转移置 10mL 的容量瓶中，甲醇定容，摇匀，既得 95.68g·mL-1 的葛根素标准品溶液。取葛根素标准品溶液，分别自动进样 2，5，8，12，15，20L，按上 述色谱条件测得峰面积。以峰面积为纵坐标，葛根素含量(g ）为横坐标，得回归方程 y=40313476x+425052(R=0.9993)，葛根素在 0.192g1.921g 之间呈良好的线性关系。供试品溶液的制备 量取洗脱液适量，挥干溶剂，残渣加甲醇适量，超声使溶解，0.45m微孔滤膜滤过，既得。- 6 -2.1.2 HPLC 法测定黄芩苷的含量参考中国药典2005 版一部中黄芩苷的含量测定方法进行测定2。色谱条件 色谱柱为 Dikma Diamonsil 柱，检测波长为 280nm，流速为 1.0mL·min-1，柱温 为 30，流动相为甲醇-水-磷酸（47：53：0.2），理论塔板数按黄芩苷计不得少于 2500。标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的黄芩苷标准品 8.20mg,置 25mL 的容量瓶中，甲醇 定容后，从中精密吸取 2mL，转移置 10mL 的容量瓶中，甲醇定容，摇匀，既得 65.60g·mL-1 的黄芩苷标准品溶液。取黄芩苷标准品溶液，分别自动进样 1，2，5，10，15，20l，按上 述色谱条件测得峰面积。以峰面积为纵坐标，黄芩苷含量（g）为横坐标，得回归方程 y=2483070x-59389(R=0.9994)，黄芩苷在 0.0656g1.312g 之间呈良好的线性关系。供试品溶液的制备 同 2.1.1 项下操作。2.2 上柱液的制备按处方量称取药材，加药材量 8 倍的 50%乙醇回流提取两次，每次 1.5h,合并滤液，回 收乙醇至无醇味，5000r·min-1 离心 30min，取上清液加水适量，配成含生药 0.4g·mL-1 的溶液 备用。测得葛根素及黄芩苷的物质量浓度分别为 4.53mg·mL-1，6.74mg·mL-1。2.3 静态吸附取 6 种未经预处理的干大孔树脂各 10 g,分别用乙醇连续洗涤数次,洗至加适量水无白 色浑浊现象,再用蒸馏水洗至流出液澄清，用 1 mol·mL - 1 的盐酸溶液冲洗后用蒸馏水洗至中 性，再用 1 mol·mL - 1 的氢氧化钠液冲洗后再用蒸馏水冲洗至中性即可 。分别加入 100mL 葛根芩连汤上柱液，每 10min 振摇一次，振摇 2h，静置过夜，使达饱和吸附。分别取各树 脂吸附后的溶液测定葛根素、黄芩苷的含量。按下式计算各树脂的吸附量，结果见表 1。树脂吸附量/mg·g-1 树脂=(C0-Cr)×V/W式中，C0 为原液浓度/mg·mL-1；Cr 为吸附后浓度/mg·mL-1；V 为吸附液体积/mL；W 为树脂 重量/g。2.4 静态洗脱取上述吸附饱和的树脂分别加入 50%乙醇 50mL，每 10min 振摇一次，振摇 2h，静置过 夜，滤过，收集续滤液，分别测定其中葛根素、黄芩苷的含量。按下式计算洗脱率，结果见 表 1。洗脱率=CD×VD/ (C0-Cr )×V ×100%式中，CD 为洗脱液浓度, VD 为洗脱液体积, C0 , Cr , V ,同上表 1 6 种大孔树脂对葛根素及黄芩苷的吸附量与洗脱率比较树脂型号葛根素吸附量葛根素洗脱率黄芩苷吸附量黄芩苷洗脱率/mg·g-1 树脂/%/mg·g-1 树脂/%D10125.2278.5644.3279.63D14135.3885.3255.1487.96DM-30121.4569.6539.8777.81AB-833.8081.1251.3583.64X-526.3370.2446.5169.93NKA-918.2177.3628.6578.69由表 1 结果可知，D141 与 AB-8 型树脂对葛根素及黄芩苷的吸附量明显大于其他树脂，且二者的洗脱率都达到了 80%，故选择 D141 与 AB-8 型树脂进行下一步动态筛选。2.5 动态吸附-洗脱取 D141 与 AB-8 型树脂各 10g,预处理同静态吸附，湿法装柱（柱体积大约 20mL）。 分别取 100mL 上柱液以 2BV·h-1 的流速上样,先用 4BV 水以 4BV·h-1 的流速洗脱，再用4BV50%乙醇以 4BV·h-1 洗脱,收集洗脱液,分别测定流出液及 50%乙醇洗脱液中葛根素及黄 芩苷的含量,计算干树脂的动态吸附量及洗脱率,结果见表 2。表 2 D141 与 AB-8 型树脂对葛根素及黄芩苷的吸附量与洗脱率比较树脂型号葛根素吸附量葛根素洗脱率黄芩苷吸附量黄芩苷洗脱率/mg·g-1 树脂/%/mg·g-1 树脂/%D14131.3388.7451.3689.21AB-829.6582.2344.4584.64由表 2 结果可知，在动态吸附-洗脱实验中，D141 型树脂的吸附与解脱性能要优于 AB-8型树脂，故最终选择 D141 型树脂来分离精制葛根芩连汤。2.6 D141 型树脂分离精制葛根芩连汤的具体参数优化2.6.1 上样速度的考察取经预处理的 D141 型树脂 20mL(树脂干重 11.06g),湿法装柱，量取 100mL 上柱液分别 以 1，2，3，4，5 BV·h-1 的流速上样，收集流过液，测定其中葛根素及黄芩苷的含量，测定 干树脂的吸附量，结果见表 3。上样速度/BV·h-1表 3 上样速度的考察结果葛根素吸附量/mg·g-1 树脂黄芩苷吸附量/mg·g-1 树脂132.6549.24231.0548.33325.3639.10421.2433.79515.2424.31由表 3 结果可知，当上样流速为 1BV·h-1 时，葛根素与黄芩苷的吸附量最大，但两者与 上样流速为 2BV·h-1 时差别不大，为节省时间，确定最佳的上样速度为 2BV·h-1。2.6.2 最大上样量的考察取经预处理的 D141 型湿树脂 20mL，湿法装柱，取上柱液以 2BV·h-1 的流速上样，按 柱体积（每份 20mL）收集流出液，依次标号，测定其中葛根素及黄芩苷的含量，以再绘制 泄漏曲线。结果见图 1。7指标成分物质量浓度/mg·mL-16葛根素 黄芩苷5432101234567 上样体积/BV图 1 葛根素及黄芩苷的泄漏曲线由结果可知，葛根素在第 4 份时开始泄漏，而黄芩苷在第 5 份时开始泄漏，所以确定 最大上样量为 80mL，即 4 倍柱体积。2.6.3 洗脱剂浓度的考察取经预处理的 D141 型湿树脂 20mL，湿法装柱，取上柱液 80mL 以 2BV·h-1 的流速上样， 先用 4BV 的水洗脱后，再分别用 5BV 的 10%，30%，50%，70%，90%乙醇以 2BV·h-1 的速 度洗脱，收集洗脱液，测定其中葛根素及黄芩苷的含量，计算二者的洗脱率，结果见表 4。表 4 洗脱剂浓度的考察结果乙醇浓度葛根素洗脱率/%黄芩苷洗脱率/%10%28.6531.5430%46.6649.7150%73.5875.4270%85.6387.0990%87.7489.56由结果可知，随着乙醇浓度的升高，对葛根素及黄芩苷的洗脱率有增大的趋势，但 70%乙醇的洗脱率与 90%乙醇的差别不大，为节省成本，确定洗脱剂为 70%的乙醇。2.6.4 洗脱速度的考察取经预处理的 D141 型湿树脂 20mL，湿法装柱，取上柱液 80mL 以 2BV·h-1 的流速上样， 先用 4BV 的水洗脱后，再用 5BV 的 70%乙醇分别按 1，2，3，4，5BV·h-1 的流速洗脱，收 集洗脱液，测定其中葛根素及黄芩苷的含量，计算二者的洗脱率，结果见表 5。表 5 洗脱速度的考察结果流速/BV·h-1葛根素洗脱率/%黄芩苷洗脱率/%187.3689.63286.6788.81385.6987.54477.5679.11571.4473.79由结果可知，随着洗脱流速的增大，对葛根素及黄芩苷的洗脱有减弱的趋势，尤其当流速增大到 4 BV·h-1 时，洗脱率降低较明显，但流速为 1 BV·h-1 与 3 BV· h-1 时，两者相差不大， 为节省时间提高效率，确定最佳的洗脱速度为 3 BV·h-1。2.6.5 洗脱剂用量的考察取经预处理的 D141 型湿树脂 20mL，湿法装柱，取上柱液 80mL 以 2BV·h-1 的流速上 样，先用 4BV 的水洗脱后，再用 70%乙醇，以 3BV·h-1 的流速洗脱，按树脂床体积数（即 每份 20mL）收集洗脱液，依次标号，测定其中葛根素及黄芩苷的含量，再绘制洗脱曲线， 结果见图 2。7.00指标成分物质量浓度/mg·mL-16.00葛根素 黄芩苷5.004.003.002.001.000.0001234567 洗脱剂体积/BV图 2 葛根素及黄芩苷的洗脱曲线由结果可知，当洗脱剂用量为 4BV 时，葛根素基本洗脱完全；而当洗脱剂用量为 5BV时，黄芩苷基本洗脱完全，因此，确定，洗脱剂的用量为 5BV，即 100mL。3. 结论与讨论3.1 结论大孔树脂分离精制葛根芩连汤的最佳工艺为：取上柱液（相当于 0.4g 生药·mL-1）上 D141 型大孔树脂，上样速度为 2BV·h-1，最大上样量为 4 倍柱体积，洗脱剂为 70%乙醇，洗脱速 度为 3 BV·h-1，洗脱剂用量为 5 倍柱体积时，指标成分基本洗脱完全。3.2 讨论本实验采用 D141 型大孔树脂分离精制葛根芩连汤，在极大程度保留了葛根素及黄芩苷的 前提下（两者保留率都达到了 80%，其中葛根素保留率为 82.1%，黄芩苷保留率 85.6%）， 还显著降低了处方的干膏得率（干膏率仅为 7.4%），为后期的分散片成型工艺打下了良好 的基础。本实验的不足之处在于仅仅考虑了复方中葛根素及黄芩苷的保留情况，而没有全面考 察其他成分如小檗碱、甘草酸等成分的含量变化，而且有条件最好能结合药理学指标来优化 该方的纯化工艺；另外，对于树脂的使用期限、有机残留等问题，都应该在以后的实验中进 一步研究。参考文献1王孝先.葛根芩连汤实验研究及临床应用J.新疆医科大学学报,2000,23（3）:279. 2国家药典委员会编.中华人民共和国药典2005 版一部S.北京:化学工业出版社,2005:211212,233234.Study on the Separating and Refining Process ofGegenqinlian Decoction by Macroporous ResinLI Junfu, WEI Juan, LI Xiaoyi, LUO Yan, YIN RongliChendu University of TCM, Chengdu, Sichuan (611130)AbstractObjective:To optimize the Separating and refining process of Gegenqinlian decoction by macroporous resin .Methods：To select the resin type using the adsorption and eluent rate of puerarin and baicalin as index,and investigate the effects of flow rate of sample loading，maximum sample volume, theconcentration, volume and velocity of the eluent on the content of puerarin and baicalin .Results : The optimal purification conditions are as follows:The resin type is D141, flow rate of sample loading is2BV·h-1 ,maximum sample volume is 4 times of given column volume , eluent is 70% ethanol ,eluent velocity is 3 BV·h- 1and eluent volume is 5 times of given column volume Conclusion :The comprehensive properties of D141 macroporous resin is excellent, and it is suitable for Separating andrefining the Gegenqinlian decoction.Keywords: macroporous resin; puerarin; baicalin; adsorption; eluent rate