非综合征性唇腭裂与转化生长因子β3基因多态性的相.doc

精品论文非综合征性唇腭裂与转化生长因子3基因多态性的相关性研究1林健燕1，2，郭泽强3，陈永娟4，丁凯宏5，栾荣生1*1 四川大学华西公共卫生学院，成都（610041）2 广西右江民族医学院基础学院，百色（533000）3 广西百色市中医医院，百色（533000）4 贵阳医学院附属医院，贵阳（550004）5 广西百色市人民医院，百色（533000）E-mail: luanrongshengyahoo.cn摘要：目的：探讨转化生长因子 3(TGF3 )基因 641C/A、15572G/- 多态性与中国人群非综合征性唇腭裂(nsCL/P) 的关系。 方法：应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）核苷酸分型技术，对 212 例非综合征性唇腭裂患者与 221 例对照进行 TGF3基因 641C/A、15572G/- 多态性检测。并通过 DNA 序列测定验证基因分型结果。结果：TGF3641C/A 和 15572G/- 两位点的基因型、等位基因的频数在非综合征性唇腭裂患者组和对照组之间均无显著性差异（P >0.05）。单倍型分析也显示各倍型在两组人群中无显著性差异（P>0.05）。 结论：TGF3 641C/A 和 15572G/- 两位点的多态性可能与中国人群非综合征性唇 腭裂无关。关键词：非综合征性唇腭裂， 转化生长因子3， 基因多态性，遗传易感性 中图分类号：R782.21. 引言唇腭裂畸形是人类最常见的先天性发育缺陷之一，全世界发病率约为12，其发病 率因人种不同而有所差别1。我国是世界上唇腭裂的高发国家之一，发病率约为1.82。遗 传学上唇腭裂分为综合征性唇腭裂和非综合征性唇腭裂。非综合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without palate，nsCL/P）是指单发的唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂，占整个面 裂畸形的70%以上。先天性唇腭裂的发病原因较为复杂, 其发病机制尚未明确，目前多倾向 于由遗传与环境因素共同作用所致。然而，由于25%30%的唇腭裂有家族史,故许多学者认 为唇腭裂最主要的病因是遗传因素2。随着分子遗传学技术的发展，近年来的研究集中在寻 找与唇腭裂有关的基因上，由于不同人种间存在基因多态性差异，而相同人种间不同地区其 发病率也存在差异，因此，本研究对贵州和广西地区的非综合征性唇腭裂患儿进行转化生长 因子3 （Transforming Growth Factor beta 3，TGF3 ）基因多态性研究，以便探讨该地区人 群nsCL/P与TGF3 基因多态性的关系。2材料与方法2.1 研究对象自2007年3月至2008年8月，在贵阳医学院附属医院口腔颌面外科以及广西百色市人民医 院口腔科就诊的非综合征性唇腭裂患者212例。其中男141例，女71例，年龄为6个月18岁（平均年龄：5.7±12.8岁）。所有的病例均排除为我们所了解的如范伍德(Vander Woude)综 合征、歌舞伎面谱( Kabuki Made Up ) 综合征、MECKEL 综合征、腭心面(Shprintzen) 综合1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20060610086）的资助。- 4 -征等。按照病例来源的比例分别从各自来源医院中选取外伤病人和骨折病人共221例作为对照组。所有的对照组成员除了外伤或骨折外，无其它系统性、全身性以及遗传性疾病， 且无唇腭裂家族史。病例组和对照组在年龄、性别、民族和家庭社会经济状况等方面相匹配。 所有研究对象均无血缘关系。2.2 基因多态性检测2.2.1 基因组 DNA 提取抽取外周静脉血2ml, 3枸橼酸钠抗凝，用北京天根生物科技有限公司提供的血液基因 组DNA提取试剂盒DP318提取基因组DNA。2.2.2 引物设计与合成根据呼邦传等3的设计以及 GenomeDatabase 数据设计引物。TGF3 641C/A 的上游引物 为：5-CTGGTTTTCCTCCCTCCTTC-3，下游引物为：5-CTCCCAGCTCCAGTTCAGAC-3； TGF3 15572G/- 的上游 引物为： 5-CTTGAAGGTCCACTCTGAGC-3 ， 下游引物为 ：5-GGGCAAAGCAGAATTACTCA-3。两对引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司 合成。2.2.3 PCR 扩增PCR扩增在25µl 反应体系中进行, 其中包括2.0 µl模板DNA，上下游引物(10µM)各1.0µl，2×Taq PCR MasterMix （北京天根生物科技有限公司）12.5µl， ddH2O 8.5µl。PCR 反 应条件: 95预变性10min后,进行以下35个循环, 94变性30s、TGF3 641C/A 59 (TGF315572G/- 58)退火30s、72延伸1min，最后72延伸5min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电 泳,溴化乙啶（EB）染色检验扩增结果。2.2.4 扩增产物限制性片段长度多态性分析 限制性酶切反应在10µl体系中进行,其中包括PCR扩增产物3µl,限制性内切酶0.3µl(10U/µl)，相应的10×buffer 0.7µl，ddH2O 6.0µl。TGF3 641C/A 的限制性内切酶是PshAI，TGF3 15572G/- 的限制性内切酶是BseDI,将此两位点的酶切体系轻轻混匀后分别置于37 和55水浴过夜。酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，硝酸银染色检验个体基因型。2.2.5 PCR 产物测序为进一步验证结果，分别从不同基因型组中随机抽取 5PCR 产物送北京诺赛基因组研 究中心有限公司进行 DNA 序列测定。2.3 统计学分析基因型和等位基因频率的比较用2 检验。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、 基 因 的 连 锁 不 平 衡 及 单 倍 型 分 析 采 用 SHEsis 在 线 软 件 分 析（http:/analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）4。3. 结果3.1 TGF3 基因SNP位点的基因分型641C/A 位点扩增片段大小499bp，CC 基因型PshAI 酶切片段为270bp和229bp；CA 基因型酶切后片段长度为499bp、270bp、229bp(图1 )。15572G/- 位点扩增片段大小441bp，GG 基因型BseDI 酶切片段长度为344bp和97bp；G/- 基因型酶切后片段为44lbp、344bp 和97bp(图2 )。随机测序验证酶切结果完全正确（图1 和图2 ）。3.2 TGF3 基因多态性与nsCL/P的关系nsCL/P 组与对照组的基因型频率和等位基因频率如表 1 所示。641C/A 和 15572G/- 基 因型在两组人群中的分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律。641C/A 和 15572G/- 两位点的 基因型分布和等位基因频率在 nsCL/P 组和对照组之间无统计学差异。3.3 TGF3 基因单倍型与nsCL/P的关系单倍型分析显示 TGF3 基因 641C/A 和 15572G/- 的单核苷酸多态性存在连锁不平衡（|D'|= 0.898），基因单倍型分布频率在两组人群中无显著性差异（表 2）。123456789M501bp489bp404bp353bp242bp190bp121、8%聚丙稀酰胺凝胶电泳显示酶切结果：M 为 DNA 标准分子量；1, 2, 3, 4, 5 泳道为 CA 基因型；6, 7,8, 9 泳道为 CC 基因型。2、随机测序各基因型结果示意。 图 1 TGF3 基因 641C/A 多态性结果121、8 %聚丙稀酰胺凝胶电泳显示酶切结果：M 为 DNA 标准分子量；1, 2, 3 泳道为 GG 基因型；4, 5, 6 泳道为 G/-基因型。2、随机测序各基因型结果示意。 图 2 TGF3 基因 15572G/-多态性结果精品论文http:/www.paper.edu.cn表 1 nsCL/P 组与对照组 TGFB3 基因多态性分布频率的比较组别人数TGF3 641C/ATGF3 15572G/-基因型2P等位基因2P基因型2P等位基因2PCCACAACAGGG/-/-G-nsCL/P 组212205700.970.32441770.960.3271842800.560.452396280.530.46741824对照组221217404384197240表 2 nsCL/P 组与对照组 TGF3 基因单倍型分布频率的比较组别人数TGF3 641C/A 和 15572G/-单倍型(2n)C-GORPC-delORPA-GORPA-delORP(95% CI)(95% CI)(95% CI)(95% CI)nsCL/P 组4243961.00-211.050.87001.001.000*72.460.181*确切概率法。(Ref)(0.57-1.96)(0.99-1.01)(0.63-9.57)对照组4424172113- 5 -4讨论面部胚胎发育包括神经嵴细胞的发育和迁移，鳃弓的形成，几个面突的出现、运动和相 互融合等几个连续的过程，这些过程受到体内多种细胞因子及信息分子的调节, 如 EGF, TGF, cAMP, PGE2 等。这些物质通过自分泌和旁分泌的形式，局部调节靶细胞的增殖分化和 促进细胞外基质的生物合成。若最后任意两个面突不能正常融合就会造成面裂，包括唇腭裂。 TGF3 作为转化生长因子家族成员之一，参与上述过程的调节作用5。此外，TGF3 基因 在小鼠胚胎头面部发育时期有表达6，而且该基因的敲除小鼠和小鸡表现唇腭裂畸形7,8。因 此，TGF3 是 nsCL/P 的热门候选基因之一9。针对 TGF3 基因与唇腭裂的关系，国内外学者做了较多研究。Lidral 等10对菲律宾人nsCL/P 的易感基因进行研究，发现在 TGF3 基因的 3非编码区的 CA 重复片段不同，出现 了 3 种等位基因（166bp、168bp、170bp），前两种等位基因比较常见，统计分析未发现各 等位基因与唇腭裂发生关联。Tanabe 等11 对日本人群研究只检测出 2 种等位基因（166bp、168bp），且未发现 TGF3 各等位基因与 nsCL/P 的发生有关联。焦晓辉等12在中国人群中 检测出全部 3 种等位基因，且统计发现 TGF3 的基因频率在 nsCL/P 组与对照组的比较中 有统计学意义。Mitchell13对丹麦人的 nsCL/P 研究，TGF3 CA 重复序列、X5.1 为多态标 志物，结果发现 TGF3 CA 多态性与单纯性腭裂相关联，而 TGF3 X5.1 与 nsCL/P 无关联。 李志萍等14对中国人群的研究也未发现 TGF3 基因 X5.1 多态性与 nsCL/P 有关。Kim 等15 于 2003 年首次报道发现 TGF3 的一处单核苷酸多态性位点-IVS5+104A>G （内含子 5 处104 位碱基 A 变为 G），碱基突变后成为内切酶 SfaNI 酶切位点，且 Kim 等15的研究表明 TGF3 基因 SfaNI 多态性与韩国人群 nsCL/P 有关联。然而，刘宁等16对中国人群的研究却 未发现 TGF3 基因 SfaNI 位点多态性与 nsCL/P 的发生有关。对相同位点的研究未能得到完 全一致的研究结果可能正反映了 nsCL/P 病因的复杂性。大量的环境因素和遗传因素与 nsCL/P 的发病有关，不同种族、不同地域的人群可能存在病因学上的差异。此外，因为不 同的研究设计、不同的样本量大小使统计效能不同，进而也可能导致研究结果的差异。本研究观察了贵州、广西两地区 212 例 nsCL/P 患者及 221 例对照的 TGF3 基因 641C/A 和 15572G/- 位点的多态性，结果发现此两位点的基因型分布、等位基因频率以及各单倍 型在 nsCL/P 组和对照组之间均无统计学差异，提示 TGF3 基因 641C/A 和 15572G/- 可能 与中国人群 nsCL/P 的发生无关联。大量的研究表明，nsCL/P 是一种多基因遗传病，且 nsCL/P 的易感基因位点具有异质性。我们仅对 TGF3 基因 641C/A 和 15572G/- 两位点的 基因多态性与 nsCL/P 的关系进行了初步研究，样本量较小，要阐明 TGF3 基因多态性与 nsCL/P 的关系，尚需扩大样本量，对 TGF3 基因其余的多态位点及其相互作用作进一步 的研究。另外，本研究中所选用的研究对象只是涉及贵州和广西两地区，并不能完全代表 中国人群。因此，很有必要在更大的地域范围内继续开展相应的研究。参考文献1 Forrester MB, Merz RD. 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TGF-2 knockout mice have multiple developmental defects that are nonoverlapping with other TGF knockout phenotypesJ. Development, 1997,124(13):2659-2670.8 Sun D, Vanderburg C R, Odierna G S, et al. TGFbeta3 promotes transformation of chicken palate medial edge epithelium to mesenchyme in vitroJ. Development, 1998,125(1):95-105.9 Vieira A R, Avila J R, Daack-Hirsch S, et al. Medical sequencing of candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palateJ. PLoS Genet, 2005,1(6):e64.10 Lidral AC, Murray JC, Buetow KH, et al. Studies of the candidate genes TGFB2, MSX1, TGFA, and TGFB3in the etiology of cleft lip and palate in the Philippines J. Cleft Palate Craniofac J, 1997,34(1):1-6.11 Tanabe A,Taketani S,Endo Ichikawa Y, et al . Analysis of the candidate genes responsible fornon-syndromic cleft lip and palate in Japanese people J. Clinical Science, 2000,99 (2):105-111.12 焦晓辉,王丽,徐旭光. 中国人群非综合征性唇腭裂与 TGF3 多态性的关系J. 哈尔滨医科大学学报,2003,37(5):415-418.13 Mitchell L E, Murray J C, O'Brien S, et al. 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And the specificity of this techniquewas confirmed by direct sequencing of the PCR products.Results:The genotype and allele frequencies of TGF3 641C/A and 15572G/- were no statistical significance between nsCL/P and controls (P >0.05). All haplotypes were also no statistical significance between two groups in haplotype analysis (P >0.05).Conclusion: There is no association between TGF3 641C/A and 15572G/- polymorphisms with the development of nsCL/P in the Chinese population.Keywords: Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate,Transforming growth factor beta 3, Gene polymorphism,Genetic susceptibility作者简介：林健燕，女，1976 年生，博士研究生，主要研究方向是出生缺陷的分子流行病 学研究。