漆酶催化麻织物固定化溶菌酶及其抗菌性【推荐论文】 .doc

精品论文漆酶催化麻织物固定化溶菌酶及其抗菌性能董爱学1，王强1，范雪荣1，王平1，崔莉1，袁久刚1，章金芳25（1. 江南大学纺织服装学院，无锡 214122；2. 新天龙集团有限公司，上虞 312369） 摘要：用漆酶对木质素的催化作用将溶菌酶接枝到富含木质素的麻织物上，赋予其抗菌性。 通过考马斯亮蓝染色法证明了溶菌酶的接枝，对两种不同木质素含量的织物（棉/亚麻混纺 织物、黄麻织物）的接枝效果进行了比较，并应用扫描电镜（SEM）考察了接枝后麻纤维表10面形态，研究了溶菌酶固定化后麻织物的抗菌性能和耐洗稳定性。结果表明：麻织物经漆酶 催化可实现溶菌酶的固定化，麻纤维木质素含量越高，溶菌酶接枝越多，整理后棉/亚麻织 物和黄麻织物抑菌率分别达到 60.38%和 72.87%，且通过接枝法固定溶菌酶的麻织物较吸附固定法具有更好的耐水洗稳定性和抗菌效果。关键词：溶菌酶；固定化；漆酶；抗菌；麻织物15中图分类号：TS195Immobilization of Lysozyme Catalyzed by Laccase on BastFabrics and its Antibacterial PropertyDONG Aixue1, WANG Qiang1, FAN Xuerong1, WANG Ping1, CUI Li1, YUAN20Jiugang1, ZHANG Jinfang2(1. College of Textiles and Clothing, Jiangnan University, Wuxi 214122;2. Xin TianLong Group Co., Ltd., Shangyu, 312369)Abstract: Grafting of lysozyme catalyzed by laccase on bast fabrics was studied. The antibacterial properties of fabrics were obtained. The graft of lysozyme was proved by method of dyeing with25coomassie brilliant blue. The grafting effects of two kinds of fabrics with different lignin content(cotton/flax fabric and jute fabric) were compared. Scanning electron microscopy (SEM) presented the surface morphologies of grafted bast fibers. The washing stability and the antibacterial property of lysozyme immobilized bast fabrics were determined. The results showed that lysozyme can be immobilized on bast fabrics via the catalysis of laccase and the grafting level30was gradually increasing with the increase in lignin content of bast fabrics. The antibacterial ratios of cotton/flax fabric and jute fabric could reach 60.38% and 72.87% respectively. The fabrics lysozyme immobilized by grafting would obtain better washing stability and antibacterial property than that immobilized only by adsorption.Key words: lysozyme; immobilization; laccase; antibacterial; bast fabric350引言麻类纤维属于抗菌纤维，具有天然的抗菌性，其抗菌抑菌作用主要是通过其独特的纤维 孔腔结构和含有的天然抗菌化学成分实现1。然而天然麻纤维制成纺织品需经过多次生物、 化学加工，这些过程会对麻纤维的原始化学成分和微观结构产生很大影响，从而使最终的麻基金项目：基金项目：基金项目：国家自然科学基金项目(51173071)；江苏省自然科学基金项目（BK2011157）； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20110093110003）；江苏省"六大人才高峰"资助项目（2011-XCL-002）；新世纪优秀人才计划项目；教育部长江学者和创新团队发展计划（IRT1135）；江苏 高校优势学科建设工程资助项目（苏政办发 2011-137 号）。作者简介：董爱学（1988-），男，博士，主要从事纺织生物技术研究通信联系人：范雪荣（1951-），男，教授，主要从事纺织生物技术研究. E-mail: wxfxr163.com- 8 -40纺织品抗菌性能大大降低2。通过后整理的方法赋予麻纤维更高的抗菌性能已经开始被国内 外研究者关注。溶菌酶（Lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶，被广泛用作天然 生物抗菌剂，具有抗菌性强，安全无毒，热稳定性好，作用范围广等优点，在食品、医药、 生物工程等领域得到了广泛应用3-6。它能有效水解细菌细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸（NAM）45的 C1 和 N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的 C4 的 -1,4 糖苷键，通过水解使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最终导致细胞溶解死亡5。 基于溶菌酶的抗菌特性，将其固定于纺织品表面，可建立一种新型的纺织品抗菌方法，拓展生物酶在纺织品中的应用7。目前，溶菌酶一般都是通过化学交联剂，如戊二醛的交联 作用，其分子一端的醛基与麻纤维上的羟基反应，另一端醛基与酶分子上的氨基发生反应，50实现酶分子的化学交联固着。但化学交联法会使有害的化学交联剂残留在麻织物上，影响消 费者健康，化学交联剂也会影响溶菌酶的酶活。溶菌酶也能通过吸附作用吸附到麻织物上， 但通过吸附法吸附到麻织物上的溶菌酶与麻的结合力差，其抗菌效果不持久，不耐洗涤。本文利用麻纤维富含木质素及漆酶能催化氧化木质素上的酚羟基形成酚氧自由基的特 性，引发含有氨基的溶菌酶接枝到含有木质素的麻纤维表面，从而赋予麻纤维优良、持久的55抗菌性能。本文通过测试经考马斯亮蓝染色的麻织物的 K/S 值表征了溶菌酶的接枝，同时利 用扫描电子显微镜和抗菌性测试考察了漆酶接枝溶菌酶对麻纤维表面形态及其抗菌性能的 影响。1实验1.1 实验材料60织物：50%棉/亚麻混纺织物；100%黄麻织物。试剂：溶菌酶（工业品），酶活：12000 U/mg（广西庞博生物工程有限公司）；漆酶(工 业品)，酶活 12.71 U/g（中国诺维信生物技术有限公司）；考马斯亮蓝 G-250 等均为分析纯。 鱼粉蛋白胨、琼脂粉、牛肉浸膏为生化试剂。1.2 实验仪器65Premier 8400 型电脑测色配色系统（美国爱色丽股份有限公司）；SU1510 型扫描电子 显微镜；WHYF-2F 型全封闭水浴恒温振荡器（台湾瑞比公司）；MJ-160B-lI 霉菌培养箱（上 海跃进医疗器械厂）；HYG-A 全温摇瓶柜（太仓市实验设备厂）；SW-CJ-IBU 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。1.3 实验原理70麻纤维表面富含木质素（具体含量为：亚麻 18.6%-20.6%，黄麻 13.6%-20.4%）。木质 素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇和芥子醇）形成的一种复杂酚类化合 物，共有愈创木基、紫丁香基和羟苯基三种基本结构。图 1 漆酶催化作用下木质素接枝溶菌酶反应历程示意图75Fig.1 Schematic illustration of the reaction mechanism to graft lysozyme on lignin catalyzed by laccase国内外研究表明8-11，木质素是漆酶的合适底物，其分子结构中的酚羟基经漆酶催化氧化后，可形成酚氧自由基，进而转化为更稳定的半醌自由基，这些反应性较强的活性粒子可 引发具有供电子基团的外源分子如含有氨基的化合物接枝聚合，制得新颖功能材料。2010 年，Tukayi Kudanga 等人报道了通过漆酶的催化作用成功将长链烷基胺接枝到山毛榉木材80上，材料疏水性得到显著提高12。溶菌酶是一种蛋白质，含有游离氨基，可通过上述方法 结合到麻纤维表面的木质素上，赋予麻纤维抗菌性能。其接枝反应历程如图 1 所示。1.4 实验方法1.4.1考马斯亮蓝染液的制备取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 固体粉末溶于 50 mL 90%乙醇溶液中，加入 85%磷酸溶液85100 mL，最后用蒸馏水定容至 1000 mL。配好后摇匀，分装到棕色试剂瓶中避光保存。1.4.2溶菌酶的固定化称取织物 1 g 于 250 mL 锥形瓶中，加入醋酸缓冲液（pH 4.5）50 mL，漆酶 0.2 g，放入 水浴恒温振荡器中，50 下恒温震荡 12 h，然后加入 0.3 g 溶菌酶继续震荡 6 h，取出布样 水洗两次，晾干。901.4.3扫描电镜（SEM）分析采用 SU1510 扫描电镜观察接枝溶菌酶前后织物的表面结构形态变化，加速电压 5 kV。1.4.4染色及 K/S 值测定将布样放入 20 mL 考马斯亮蓝 G-250 溶液中，室温下染色 5 min 后取出，水洗两次，室 温晾干。95在电脑测色仪上测定考马斯亮蓝染色织物的颜色深度 K/S 值。每块织物需在不同部位保 持经纬方向一致的情况下测三次，取平均值。1001.4.5抗菌性能评价以革兰氏阳性菌代表金黄色葡萄球菌（ATCC6538，Staphylococcus aureus）为实验菌 种，参照 GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准，采用振荡烧瓶法对样品进行抗 菌性能测试。样品的抗菌性能通过抑菌率进行评价，计算公式如下。Xs =A - B A105110式中：XS 为抑菌率，%；A 为被测样品振荡前平均菌落数；B 为被测样品振荡后平均菌 落数。如果振荡后的平均菌落数大于振荡前的平均菌落数，抑菌率按 0 计算。整理织物抑菌效果的耐洗涤性测试，参照 GB/T 8629-2001纺织品试验用家庭洗涤和 干燥程序标准洗涤。2结果与讨论2.1 漆酶催化棉/亚麻混纺织物接枝溶菌酶为了证明在漆酶催化氧化下溶菌酶能够接枝到麻纤维木质素上，本文对比了不同工艺处 理的棉/亚麻样布经考马斯亮蓝染色后的 K/S 值，结果见图 2。2.52.01.5K/S1.00.50.0未处理漆酶溶酶菌漆酶+溶菌酶处理工艺115120图 2 不同处理工艺后棉/亚麻混纺织物的 K/S 值Fig.2 K/S values of cotton/flax blending samples via different treatments考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在 595nm 波长下有最大光 吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。固定溶菌酶后的织物，可被考马斯亮蓝 G-250 染色， 由 K/S 值表征染色织物的颜色深度。由图 2 可以看出，未经任何处理的样布的 K/S 值最小， 这是由于考马斯亮蓝染料少量吸附在麻纤维上导致的。经过漆酶催化和未经漆酶处理直接加 入溶菌酶的样布的 K/S 值稍微比未处理样布大，说明有一定量漆酶和溶菌酶吸附在麻织物表 面。经过漆酶催化后再加入溶菌酶的样布的 K/S 值要高于其它样布,这说明除吸附了少量的溶菌酶和漆酶外，还接枝了一部分溶菌酶。以上结果可以证明经漆酶的催化作用后，溶菌酶 能够接枝到麻纤维表面。精品论文1252.2 棉/亚麻混纺织物与黄麻织物接枝效果比较溶菌酶的接枝对象为麻纤维中的木质素，故织物表面木质素含量越高，接枝效果应越明 显。本文对棉/亚麻混纺织物和纯黄麻织物的接枝效果进行了比较，结果如图 3 所示。黄麻4 棉/亚麻3K/S210未处理接枝充分水洗 接枝未充分水洗布样130135图 3 棉/亚麻混纺织物与黄麻织物固定溶菌酶考马斯亮蓝染色后 K/S 值对比Fig.3 Contrast of Immobilized lysozyme contents of cotton/flax blending and jute fabrics via antibacterial finishing 由图 3 可知，在相同工艺条件下，黄麻织物表面的溶菌酶含量明显高于棉/亚麻混纺织 物，这进一步证明了溶菌酶的接枝位点与木质素有关。同时从图中可观察到，经过充分水洗 的麻织物其表面的溶菌酶含量降低的不多，如果溶菌酶主要是以吸附方式存在于麻织物表 面，则经过充分水洗后溶菌酶含量会明显减少，这间接证明了溶菌酶在麻纤维表面的结合方式是化学键结合而不是简单的物理吸附。2.3 织物表面形态表征对整理后织物分别进行电镜分析，结果如图 4 所示。(a)(b)(c)(d)(e)(f)140(a)未经处理的黄麻纤维；(b)未经处理的棉/亚麻纤维；(c)抗菌整理后黄麻纤维；(d)抗菌整理后棉/亚麻纤维；(e)抗菌整理后充分水洗的黄麻纤维；(f)抗菌整理后充分水洗的棉/亚麻纤维 图 4 不同处理条件后的麻纤维表面形态Fig.4 Surface morphology of bast fibers via different treatments145150155从图 4 可以看出，未处理麻纤维表面光滑，有沟壑状缝隙，边缘清晰，抗菌处理之后，麻纤维表面变得模糊，沟壑状缝隙消失，表面接有颗粒状物质，这是因为抗菌整理后纤维表 面接枝或吸附了大量溶菌酶覆盖在麻纤维表面所致。抗菌处理后经过充分水洗的麻纤维表面 溶菌酶数量相对减少，但是仍有大部分溶菌酶在上面。这是由于充分水洗后吸附在麻纤维表 面的溶菌酶被洗掉，但是剩下的溶菌酶是以化学键接枝在麻纤维表面上的，耐洗涤性能稳定。 对比可知，黄麻纤维表面的溶菌酶含量比棉/麻混纺纤维多很多，这是因为溶菌酶主要接枝 在木质素自由基上，而黄麻织物木质素含量比棉/亚麻混纺织物多。2.4 固定化溶菌酶织物的抗菌性能分别对溶菌酶吸附在麻织物表面、溶菌酶接枝在麻织物表面、溶菌酶吸附在麻织物表面 经充分水洗、溶菌酶接枝在麻织物表面经充分水洗的的棉/亚麻混纺织物与黄麻织物进行抗 菌性测试。2.4.1 棉/亚麻混纺织物抗菌性能从图 5 中金黄色葡萄球菌菌落生长情况可以看出，没有经过任何处理的织物金黄色葡萄 球菌菌落生长明显（见图 5a），而通过吸附作用结合溶菌酶的织物和通过漆酶催化作用固 定溶菌酶的织物都体现出较好的抗菌效果，表现为织物上菌落稀少（见图 5b，5c），抑菌 率分别达到 46.54%和 60.38%（见表 1），可见固定在织物上的溶菌酶赋予了织物较好的抑 菌效果。(a)(b)(c)(d）(e)160a. 未处理；b. 表面吸附溶菌酶；c. 表面接枝溶菌酶；d. 表面吸附溶菌酶后经充分水洗；e. 表面接枝溶菌 酶后经充分水洗165170图 5 棉/亚麻混纺织物抗菌效果Fig.5 The phenomenon of the antibacterial effect of cotton/flax blending fabric在经过五次洗涤后，通过吸附作用固定溶菌酶的织物菌数（图 5d）明显多于通过漆酶 催化固定溶菌酶的试样（图 5e），其抑菌率跌至 13.08%，而接枝固定溶菌酶试样仅有稍微 降低（56.15%）。这是因为溶菌酶通过漆酶的催化作用，与麻织物上的木质素形成了稳定 的共价键结合。而通过离子键以及分子间作用力固定化的溶菌酶经多次洗涤后脱落严重，因 此抑菌效果相对较差。综上所述，交联法固定溶菌酶的棉/亚麻纤维织物的抑菌率更高，抗 菌效果更持久。2.4.2黄麻织物抗菌性能由表 1 可知，吸附溶菌酶的黄麻织物抑菌率为 54.66%，交联法固定溶菌酶的黄麻织物精品论文抑菌率为 72.87%。经五次水洗后，吸附溶菌酶的黄麻织物抑菌率降为 20.83%，交联法接枝溶菌酶的黄麻织物抑菌率稍微下降至 65.59%。(a)(b)(c)175(d)(e)a. 未处理；b. 表面吸附溶菌酶；c. 表面接枝溶菌酶；d. 表面吸附溶菌酶后经充分水洗；e. 表面接枝溶菌酶后经充分水洗180图 6 黄麻织物抗菌效果Fig.6 The phenomenon of the antibacterial effect of jute表 1 溶菌酶固定后的棉/亚麻织物及黄麻织物的抑菌效果Table1 Antibacterial ability of cotton/ flax blending fabric and jute fabric after lysozyme was assembled抑菌率（%）棉/亚麻织物黄麻织物菌液-未处理6.548.91表面吸附溶菌酶46.5454.66表面接枝溶菌酶60.3872.87表面吸附溶菌酶后经充分水洗13.0820.83表面接枝溶菌酶后经充分水洗56.1565.59185190195由表 1 和图 5、图 6 对比可知，黄麻织物抗菌效果相对比棉/亚麻混纺织物好，这是因为麻纤维含有的孔状结构能够容纳溶菌酶分子，棉/亚麻混纺织物中麻纤维比例要比纯黄麻织 物少得多，更重要的是黄麻织物中木质素含量远高于棉/亚麻混纺织物，使得更多的溶菌酶 能够接枝在纤维表面，故而抗菌效果优于棉/亚麻混纺织物。3结论在漆酶催化作用下，溶菌酶能够接枝到麻纤维中的木质素上，使麻纤维抗菌性能得到改 善提高，且麻纤维木质素含量越高，溶菌酶在麻纤维上的接枝量越多。整理后棉/亚麻织物 和黄麻织物抑菌率分别达到60.38%和72.87%。漆酶催化接枝固定化溶菌酶的麻织物比吸附固定法具有更好的抗菌效果和耐水洗稳定 性，经 5 次洗涤后棉/亚麻织物和黄麻织物抑菌率分别保持在 56.15%和 65.59%，仍然能有效抑制金黄色葡萄球菌菌落生长。而吸附溶菌酶的棉/亚麻织物和黄麻织物，初始抑菌率分别为 46.54%和 54.66%， 经洗涤后分别降至 13.08%和 20.83%，已基本无抗菌效果。参考文献 (References)2002052102151 李丁奕，周永凯，张华. 麻类材料在抗菌纺织品的应用展望J. 防护装备技术研究，2009（4）：15-20. 2 史加强，王占伟. 亚麻纤维抗菌机理的探讨J. 黑龙江纺织，2001，12（4）：6-7.3 许红，徐奇友，刁新平. 绿色添加剂溶菌酶及其应用J. 饲料工业，2005，26（2）：10-13.4 马正智，胡国华，方国生. 我国溶菌酶的研究与应用进展J. 中国食品添加剂，2007（2）：177-182. 5 陈艳，江明锋，叶煜辉，刘勇涛，李生伟. 溶茵酶的研究进展J. 生物学杂志，2009，26（2）：64-66. 6 叶丹，连宾. 溶菌酶及其应用J. 贵州科学，2003，21（3）：67-70.7 WANG Q, FAN X R, HU Y J, YUAN J G, CUI L, WANG P. Antibacterial functionalization of wool fabric via immobilizing lysozymesJ. Bioprocess Biosyst Eng, 2009(32): 633-639.8 Kudanga T, Nugroho Prasetyo E, Sipilä J, Eberl A, Nyanhongo GS, Guebitz GM. Coupling of aromatic aminesonto syringylglycerol -guaiacylether using bacillus SF spore laccase: A model for functionalization of lignin-based materialsJ. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 61(3-4): 143-149.9 Mai C, Schormann W, Huttermann A, Kappl R, Huttermann J. The influence of laccase on the chemo-enzymatic synthesis of lignin graft-copolymersJ. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 30: 66-72.10 Lahtinen M, Kruus K, Heinonen P, Sipilä J. On the reactions of two fungal laccases differing in their redox potential with lignin model compounds: Products and their rate of formationJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(18): 8357-8365.11 Areskogh D, Li J, Gellerstedt G, Henriksson G. Investigation of the molecular weight increase of commercial lignosulfonates by laccase catalysisJ. Biomacromolecules, 2010(11): 904-910.12 Tukayi Kudanga, Endry Nugroho Prasetyo, Jussi Sipilä, Georg M.Guebitz, Gibson S.Nyanhongo. Reactivity of long chain alkylamines to lignin moieties: Implications on hydrophobicity of lignocellulose materialsJ. Journal of Biotechnology, 2010, (149): 81-87.