相干 X 射线衍射成像在生命科学研究中的【推荐论文】 .doc

精品论文相干 X 射线衍射成像在生命科学研究中的进展张剑，江怀东5（山东大学晶体材料国家重点实验室，济南 250100）摘要：相干 X 射线衍射成像是一种通过测量衍射信号, 利用相位恢复算法来获取样品结构图 像的无透镜成像技术。这种成像技术可以实现生物样品的二维或三维高分辨、高衬度成像。 由于该成像技术能够获得样品的密度信息，因此可以实现样品结构图像的定量分析。近年来 利用相干衍射成像技术已经实现了病毒、细菌、细胞、骨等生物样品的成像。随着低温冷冻10技术和 X 射线自由电子激光技术的发展和应用，该成像技术将得到快速的发展。本文就相 干衍射成像方法在生命科学中的应用做一综述。关键词：X 射线衍射成像；同步辐射；相位恢复；定量成像中图分类号：O5915Progress of coherent X-Ray diffraction imaging in biologyZHANG Jian, JIANG Huaidong(State Key Laboratory of Crystal Materials, Shandong University, JiNan 250100) Abstract: Coherent X-ray diffraction imaging (CDI) is a lensless imaging that uses diffraction patterns to recover images of specimens. By the imaging technology, 2D or 3D images of20biological specimens with high contrast and high resolution can be acquired withoutcrystallization, section or stain. CDI images can provide density information of specimens, by which the compositional mass, volume and density can be determined. So far, CDI has been used for determination of microstructure of biological specimens, such as viruses, bacteria, cells, bone particles and so on. Combining with cryogenic technology ofand X-ray free electron lasers, CDI25will keep fast developing. In the review, the applications and development of CDI are introduced and discussed.Keywords: X-ray diffraction imaging; synchrotron radiation; phase retrieval; quantitative imaging0引言30X 射线具有良好的穿透性，是生物学领域的一种重要成像工具1-4。在 X 射线的成像方 法中有衍射、吸收和相衬成像等。其中，利用 X 射线衍射测定晶体结构的方法已成为人们 认识物质微观结构的最重要途径之一，例如结晶的蛋白质可以用这种方法得到精确的结构， 而对于非晶样品衍射似乎无能为力。Sayre 和 Miao 在 1999 年首次实现了非周期结构的相干 X 射线衍射成像（coherent diffraction imaging, CDI）5,6，使得衍射分析物质结构的方法从晶35体领域跨入了非晶体领域。经过十几年的发展，相干 X 射线衍射在各个科学领域获得了深 入的发展，不仅实现了玻璃、聚合物、纳米晶体内部应力和缺陷、量子点等功能材料的成像， 而且实现了细胞、细胞器、生物复合物和病毒等生物样品的二维和三维结构成像7-29。随着X 射线自由电子激光的发展，最终将有可能利用自由电子激光产生的超短超强脉冲实现单个大蛋白质复合体成像的目标30-35。基金项目：国家自然科学基金(51002089)；山东省自然科学杰出青年基金(JQ201117)；新世纪优秀人才支持 计划基金(NCET-11-0304)；教育部高等学校博士点基金(20110131110016)作者简介：张剑，(1978-)，男，博士研究生，材料学。通信联系人：江怀东，（1975-），男，教授，凝聚态物理。E-mail: hdjiangsdu.edu.cn- 8 -40图 1、相干 X 射线衍射成像原理图相干 X 射线衍射成像的基本原理，如图 1 所示：当一束相干 X 射线照射样品时，CCD记录下样品的衍射信号，然后通过衍射信号恢复出样品的结构图像。相干 X 射线衍射成像45作为一种显微方法，它具有独特的优势。首先，X 射线的穿透能力强，可以实现厚度为几个 微米的生物样品的成像，而透射电镜样品厚度通常小于 500nm；第二，相干衍射成像的分辨 率主要决定于照射样品的光子能量和衍射信号强度，可以获得比基于波带片的 X 射线显微 成像更高的分辨率。第三，恢复的图像反映了样品的电子密度6，因此可以直接确定样品各 组成部分的大小、体积和质量等信息；最后，相干 X 射线衍射在图像恢复时，扣除了样品50周围环境的影响，可以实现样品的高衬度成像。目前，辐射损伤是限制相干 X 射线衍射成像的重要因素。冷冻技术和 X 射线自由电子 激光与相干衍射成像技术相结合为克服辐射损伤提供了可能性30-35。其中，冷冻技术通过对 生物样品迅速冷冻，使样品中的水变为无定形的冰，提高样品抗辐射损伤能力；X 射线自由 电子激光则利用超短和超强的脉冲在样品被损坏前记录样品的衍射信号。这两种方法为实现55生物结构和蛋白质复合体的三维高分辨成像提供了有效途径。本文就相干衍射成像在生物学 中的应用研究情况进行综述，以促进人们对该成像技术研究的关注。1二维相干 X 射线衍射成像1.1 大肠杆菌利用相干 X 射线衍射首次实现的生物样品是大肠杆菌21。为了验证成像方法的可靠性，60样品进行了染色处理，并对相干衍射成像和激光共聚焦成像进行了对比。大肠杆菌先用黄色 荧光蛋白标定，再用浓度为 1% 的 KMnO4 溶液固定样品。其中，绑定在多组氨酸上的锰离 子对 X 射线有强烈的散射作用，提高了衍射信号的强度，有利于图像恢复。图2、 大肠杆菌CDI图像和共聚焦图像2165图 2 是大肠杆菌相干衍射图像和共聚焦显微图像。其中，相干衍射成像的分辨率为 30nm,重建图像不仅很好的反映了大肠杆菌的外形，还反映了标定后大肠杆菌内部荧光蛋白的分布 情况。相干衍射图像中深色部分（高密度）表示锰离子即荧光蛋白的位置，几乎充满了整个 细胞；密度小的部分是缺乏荧光蛋白的位置，所占空间很小。这和共聚焦显微图像中绿色荧70光蛋白的分布是一致的，说明了相干衍射成像是一种可靠的显微成像技术。1.2 酵母菌图 3、酵母菌 CDI 图像和扫描电镜图像2375利用软 X 射线，Nelson 等人研究了酵母菌的相干衍射成像23。将酵母菌进行特定分子 标定，插入液态乙烷冷冻，冻干后用 750eV 的 X 射线进行相干衍射成像。图 3 是酵母菌的 相干衍射成像，亮度表示振幅，色彩表示相位，图像分辨率为 11-13nm 23。图 3（A）、（B） 是酵母菌在不同聚焦面的相干 X 射线衍射成像图；图 3（C）、（D）是酵母菌扫描电镜图 像。矩形框为对应部位的放大图，标出了胶体金颗粒标定的部位， 图 3（A）和（C）的焦80平面相对应， 显示了酵母菌前面金颗粒的分布；图 3（B）和（D）的焦平面对应，显示了 酵母菌背面的金颗粒的分布。1.3 病毒859095100105110图 4、病毒的 CDI 图像与电镜图像24相干 X 射线衍射成像实现了非染色病毒的高衬度和定量成像24。图 4（A）是通过相干 X 射线衍射成像得到的鼠科疱疹病毒的电子密度图像。病毒的大小为 200nm，电子密度最大 的黄色部分代表了病毒的衣壳，大小为 100nm，包裹了病毒的基因组，图像清晰的显示了衣 壳在病毒中分布的位置。图 4（B）是同一个病毒样品的扫描电镜的图像，只反映了病毒的 外部形态，和相干 X 射线衍射成像的形状相同。图 4（C）是鼠科疱疹病毒负染色透射电镜 图像，尽管冷冻透射电镜也可以确定病毒中衣壳的位置，但是样品制备及成像过程十分复杂， 且图像被低衬度和高噪音所困扰。与负染色透射电镜相比，相干衍射成像反映了病毒的基本 结构，并且由于相干衍射成像消除了背底和周围环境的影响，因此获得了更高的衬度。虽然 重建图像的分辨率只为 22nm，但是如果采用冷冻技术或者使用 X 射线自由电子激光将克服 辐射损伤，进一步提高分辨率。病毒的成像是相干 X 射线衍射成像实现生物大分子成像的 重要一步。1.4 鱼骨骨具有优良的机械性能，与其结构具有重要关系。骨的矿化是一个动态过程，通过模型 在纳米尺度上描述骨组织矿化的动态结构，在生物医学中有重要的意义。利用相干 X 射线 衍射成像研究不同矿化阶段的骨，揭示了骨中胶原纤维和矿化晶体组成的分级结构的形成过 程25。图 5、低度矿化和高度矿化鱼骨 CDI 图像25相干 X 射线衍射成像能够提供样品的密度分布，由于骨中矿化部分的密度高于胶原纤 维的密度，因此可以分析骨结构。通过对不同矿化阶段的骨进行成像和定量分析就可以了解 骨的矿化过程。相干 X 射线衍射成像研究了鲱鱼不同矿化阶段的骨，并获得了分辨率为 24nm 的结构图像。在没有矿化的胶原纤维中存在大量的孔洞，且孔洞沿轴向方向交错分布，相邻 孔洞之间距离的周期约为 67nm。在低矿化的骨中，如图 5（A）所示，矿化晶体主要存在于 胶原纤维内的空洞中。随着矿化的进一步发生，胶原纤维孔洞中的矿化晶体不断外延成核和 生长，矿化晶体越来越多，相互连接在一起形成窄带，形成了具有抗弯折结构的高度矿化的 骨，如图 5（B）所示。2三维相干 X 射线衍射成像1151201251301352.1 染色体由于电子的平均自由程很短，对于生物样品，有时单个细胞器的大小仍然超出透射电镜 能够承受的厚度；虽然可以使用荧光蛋白标定的方法来研究细胞器，但是真实的三维结构很 难获得，且在厚度方向分辨率较低。相干 X 射线衍射能够实现没有切片和染色的完整细胞 器的三维成像。染色体是实现基因传递和复制的重要细胞器，三维相干 X 射线衍射图像显 示了染色体的轴结构，这对进一步了解染色体结构有重要的意义26。图 6、染色体三维相干衍射图像26图 6（A）是利用相干 X 射线衍射方法获得的从有丝分裂的 HeLa 细胞提纯的染色体的 三维结构，重建图像的分辨率为 120nm，样品接受的辐射计量约为 2×1010Gray。图 6( B ) 和图 6（C）分别是由三维染色体的水平和垂直截面图。图像清晰的显示了染色体的轴结构， 在截面图中接近染色体中心部位图像密度最大，大约是其他部分密度的 1.5 倍，说明这些高 密度部分是染色体的轴，轴的宽度约为 200nm，据报道轴是由凝缩蛋白和拓扑异构酶 构 成的，它们是染色体组合过程的关键蛋白。染色体轴的位置代表了着丝点，是染色体的骨架， 它连接了两个染色单体。2.2 细胞图 7、酵母菌三维相干衍射图像27由于二维图像仅反映样品在某的角度上的投影，很难区分样品内部各组成部分相互的位 置关系，所以获得三维图像对于了解生物结构是必不可少的。X 射线良好的穿透性使它能够 实现细胞的三维成像。由于酵母菌孢子可以代表一个细胞的完整结构，并且有良好的抗辐射 性能，相干 X 射线衍射成像不仅重建了酵母菌的外部形态和内部结构，而且实现了图像的140145150155160165170175定量化27。相干 X 射线衍射成像能够获得样品的定量结构信息，如样品形态、各组成部分体积和 质量分布等。图 7（A）是酵母菌孢子内部结构的透视图，重建三维图像的分辨率为 50-60nm。 桔黄色表示细胞核，绿色表示内质网，白色表示液泡，蓝色表示线粒体，浅蓝色表示细胞核 外粒体，图 7（B）是放大的细胞核、内质网和线粒体，放大图中密度最高的部分为细胞核 中的染色质。图 7（C）是一个液泡的三维结构，放大图显示了液泡内密度的分布。图（D） 和（E）表示了沿虚线方向从线粒体到液泡的密度变化，线粒体中的最高密度约为 2.25g/cm3， 液泡中的最低密度为 0.25g/cm3。在酵母菌的三维重建图像中，细胞核的体积约为 0.28m3， 占细胞总体积的 5%，液泡体积约为 0.7m3，占细胞体积的 12%。3X 射线辐射损伤相干 X 射线衍射成像和其他显微方法一样，提高分辨率是一个重要目标，这种方法的 分辨率主要取决于两个方面：一是衍射极限的限制，提高分辨率须适当提高 X 射线光子的 能量；二是衍射图像的信噪比，要提高 X 射线的光通量。然而，这两种提高分辨率的方法 都会增加 X 射线对生物样品的辐射损伤，阻碍生物样品的高分辨成像。目前克服这种成像 缺陷的方法主要有两种30-35：一是低温冷冻相干衍射成像，利用快速冷冻技术使生物样品中 的水形成玻璃态的冰，保持样品在冷冻瞬间的生命状态，提高生物样品的抗辐射能力；另一 种方法是采用超短和超强的 X 射线自由电子激光脉冲，收集单次照射的样品未遭到破坏时 的衍射信号，该方法即解决了消除辐射损伤问题，又可以消除冷冻的影响。3.1 冷冻相干 X 射线衍射成像相干 X 射线衍射三维成像若要实现 10nm 的分辨率，在分子水平上认识细胞的三维结构 以及各个细胞器的相互联系，则样品接受的 X 射线的辐射剂量必须达 108Gray 以上30。然 而含水的生物样品在这个辐射剂量下，很快就被破坏了。冷冻是提高生物样品抗辐射的基本 方法，但是如果使用一般冷冻的方法，容易在细胞内出现晶体的冰，样品的衍射信号就被晶 体冰的衍射信号干扰，所以迅速低温冷冻固定样品才能得到其结构信息。在整个相干衍射的 实验过程中，将样品放置在低温的环境中，使水保持玻璃态的冰，防止样品在高辐射下的电 离，这样细胞的瞬间状态就被固定下来31。3.2 X 射线自由电子激光用于相干衍射成像X 射线自由电子激光具有亮度高、脉冲短和相干性好的特点，特别适合研究小尺度物质 的成像。如果一个脉冲延续的时间比生物蛋白质大分子被 X 射线离子化的时间还要短，那 么在样品被破坏前就可以得到它的衍射信号32 。 例如，利用喷雾技术使相同的生物蛋白质 大分子形成一束窄的样品束流，当单个分子同步经过 X 射线脉冲时，记录下一个分子的衍 射图像，同时该分子被高能量的光子汽化，这样通过上万张衍射图像可以恢复出生物蛋白质 大分子的三维图像33。 虽然实现非结晶的生物大分子复合体的成像尚需时日，但是目前利 用自由电子激光已经实现了病毒的成像34和膜蛋白纳米晶的成像35，为相干 X 射线成像的 发展奠定了基础。4结论与展望相干 X 射线衍射成像技术突破了生物样品结构分析对结晶的依赖，可以实现完整细胞 或细胞器的三维成像，而不需要对样品切片或荧光染色。该成像方法无需透镜，可以获得比精品论文180185X 射线吸收和相衬成像更高的分辨率。因此相干 X 射线衍射成像技术适用于生物材料的成像研究，对于实现单细胞等生物样品的高分辨、原位、定量成像有广阔的应用前景。 尽管相干 X 射线衍射成像在研究生物微观结构方面具有诸多优势，但目前在实现成像的过程中还存在许多技术和科学难点，仍面临着空间分辨率的进一步提高，样品辐射损伤，以及高精度的三维图像重建方法的优化等问题。随着低温冷冻技术, X 射线自由电子激光的 发展与应用, 将为提高图像分辨率，对样品进行原位观察提供了有效途径，并为解决辐射损 伤问题提供了可能，相干 X 射线衍射显微成像技术将会迎来快速的发展与广泛的应用。参考文献 (References)1901952002052102152202252302351 Sayre D, Kirz J, Feder R, et al. Potential operating region for ultrasoft x-ray microscopy of biological materials. Science, 1977, 196(4296):1339-1340.2 Larabell CA, Le Gros MA. X-ray tomography generates 3-D reconstruction of the yeast, Saccharomyces cerevisiae, at 60-nm resolution. Mol. Biol. Cell 15(3):957-962.3 Paunesku T, Vogt S, Maser J, et al. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J CellBiochem, 2006, 99(6):1489-1502.4 Fahrni CJ. Biological applications of x-ray fluorescence microscopy: Exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Curr Opin Chem Biol, 2007, 11(2):121-127.5 Miao J，Charalambous P, Kirz J, et al. Extending the methodology of X-ray crystallography to allow imagingof micrometer-sized noncrystalline specimens. Nature,1999,400(5):342-44.6 Miao J, Ohsuna T, Terasaki O, et al. Atomic resolution three-dimensional electron diffraction microscopy. Phys Rev Lett, 2002, 89(15):155502.7 Miao J，Amonette J，Nishino Y, et al. Direct determination of the absolute electron density of nanostructuredand disordered materials at sub-10-nm resolution. Phys Rev B, 2003, 68(1):012201.8 Robinson IK, Vartanyants IA, Williams GJ, et al. Reconstruction of the shapes of gold nanocrystals using coherent X-ray diffraction. Phys Rev Lett, 2001, 87(19):195505.9 Miao J, Ishikawa T, Johnson B, et al. High resolution 3D X-ray diffraction microscopy. Phys Rev Lett, 2002,89(8):088303.10 Williams GJ, Pfeifer MA, Vartanyants IA, et al. Three-dimensional imaging of microstructure in Aunanocrystals. Phys Rev Lett, 2003, 90(17):175501.11 Marchesini S, He H, Chapman, HN, et al. X-ray image reconstruction from a diffraction pattern alone. PhysRev B, 2003, 68(14):140101.12 Nugent KA, Peele AG, Chapman HN, et al. Unique phase recovery for nonperiodic objects. Phys Rev Lett,2003, 91(20):203902.13 Pfeifer MA, Williams GJ, Vartanyants IA, et al. Three-dimensional mapping of a deformation field inside a nanocrystal. Nature, 2006, 442(6):63-66.14 Chapman HN, Barty AB, Marchesini S, et al. High-resolution ab initio three-dimensional X-ray diffraction microscopy. J Opt Soc Am A, 2006, 23(5):1179-1200.15 Williams GJ, Quiney HM, Dhal BB, et al. Fresnel coherent diffractive imaging. Phys Rev Lett, 2006,97(2):025506.16 Miao J, Chen CC, Song C, et al. Three-dimensional GaN-Ga2O3 core shell structure revealed by X-ray diffraction microscopy. Phys Rev Lett, 2006, 97(21):215503.17 Abbey B, Nugent KA, Williams GJ, et al. Keyhole coherent diffractive imaging. Nat Phys, 2008,4(9):394-398.18 Rodenburg J, Hurst A, Cullis A, et al. Hard-x-ray lensless imaging of extended objects. Phys Rev Lett, 2007,98(3):034801.19 Thibault P, Dierolf M, Menzel A, et al. High-resolution scanning X-ray diffraction microscopy. Science, 2008,321(5887):379-382.20 Giewekemeyer K, Thibault P，Kalbfleisch S, et al. Quantitative biological imaging by ptychographic x-raydiffraction microscopy. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 107(2):529-534.21 Miao J, Hodgson KO, Ishikawa T, et al. Imaging whole Escherichia coli bacteria by using single particleX-ray diffraction. Proc Natl Acad Sci, 2003, USA 100(1):110-112.22 Shapiro D, Thibault P, Beetz T, et al. Biological imaging by soft X-ray diffraction microscopy. Proc. NatlAcad Sci, 2005, USA 102(43):15343-15346.23 Nelson J, Huang X, Steinbrener J, et al. High-resolution x-ray diffraction microscopy of specifically labeledyeast cells. Proc Natl Acad Sci, 2010, USA 107(16):7235-7239.24 Song C, Jiang H, Mancuso A, et al. Quantitative imaging of single, unstained viruses with coherent X-rays. Phys Rev Lett, 2008, 101(15):158101.25 Jiang H, Ramunno-Johnson D, Song C, et al. Nanoscale imaging of mineral crystals inside biological composite materials using X-ray diffraction microscopy. Phys Rev Lett, 2008, 100(3):038103.26 Nishino Y, Takahashi Y, Imamoto N, et al. Three-dimensional visualization of a human chromosome using240245250255coherent X-ray diffraction. Phys Rev Lett, 2009, 102(1):018101.27 Jiang H, Song C, Chen CC, et al. Quantitative 3D imaging of whole, unstained cells by using X-ray diffraction microscopy. Proc Natl Acad Sci, 2010, USA 107(25): 11234-11239.28 Miao J, Förster F, Levi O, et al. Equally sloped tomography with oversampling reconstruction. Phys Rev B,2005, 72(5):052103.29 Lee E, Fahimian BP, Iancu CV, et al. Radiation dose reduction and image enhancement in biological imagingthrough equally sloped tomography. J Struct Biol, 2008, 164(2):221-227.30 Huang X, Nelson J, Kirz J, et al. Soft X-ray diffraction microscopy of a frozen hydrated yeast cell. Phys RevLett, 2009, 103(19):198101.31 Lima E，Wiegart L, Perot P, et al. Cryogenic X-Ray Diffraction Microscopy for Biological Samples. Phys RevLett, 2009, 103(19):198102.32 Neutze R, Wouts R, Spoel D, et al. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature,2000, 406(17):752-757.33 Miao J, Hodgson KO, Sayre D, et al. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proc Natl Acad Sci, 2001, USA 98(12): 6641-6645.34 Seibert M，Ekeberg T, Maia FR, et al. Single mimivirus particles intercepted and imaged with an X-ray laser.Nature, 2011, 470(3):78-81.35 Chapman HN, Fromme P, Barty P, et al. Femtosecond X-ray protein nano crystallography. Nature, 2011,470(3):73-77.