41BBL介导的逆向信号对人外周血T细胞体外活化的调节作用.pdf

. 基 础 免疫 学 . 4 - 1 B B L 介导的逆向信号对人外周血T 细胞 体外活化的调节作用 居颂文 居颂光 仇红霞 王凤鸣 王明元 胡玉敏刘彤刘高勤张学光 【 摘要 】 目的 探讨表达于活化T 细胞上的4 - I B B L 分子对T 细胞的调节作用及可能机制。方 法鼠 抗人4 - 1 B B L 单克隆抗体1 F 1 加人C D 3 单抗联合C D 2 8 单抗激发的T 细胞培养体系。细胞计数 分析T 细胞的增殖; P U A n n e x i n V双染法分析T 细胞的凋亡; E I I S A法测定培养上清中细胞因子的分 泌水平; 流式细胞仪分析T 细胞的表型。结果 单抗 1 F 1 能够有效地抑制活化T 细胞的体外增殖并 诱导其凋亡， 同时单抗1 F 1 还可抑制活化T 细胞分泌I I r 2 和I F N - y 及上调T 细胞表面C D 9 5 和P D - 1 分 子的表达。 结论在T 细胞活化过程中， 活化T 细胞表达的4 - I B B L 分子通过逆向信号抑制其细胞因 子的分泌和上调负性调控分子， 进而抑制T 细胞的过度活化和下调T 细胞介导的免疫应答。 【 关键词 4 - 1 B B L ; 逆向 信号; 共刺激分子; T 细胞活化 T h e r e v e r s e s i g n a l m e d i a ti o n o f r e g u l a t e s a c ti v a t i o n o f h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d T c e ll 勿 4 - I B B L i n v i t a J U S o n g - u ie n , J U S o n g - g u - n g , 必U H o n g - x ia , W A N G F e n g - m i n g , W A N G M i n g - y u a n ， H U Y u - n u n , L I U T o n g , L I U G a o- g m, Z H A N G X n e - g u a n g . M e d ic a l B io t e c h n o lo g y I n s t i t u t e of S o o c h o w U n i v e r s i t y , S u z h o u 2 1 5 0 0 7 , C h i n a C o r r e s p o n d in g a u th o r : Z H A N G X u e - g u a n g , E n w il : s m b x u e g z p u b l ic . s z . c n 【 A b s t r a c t 】O b j e c ti v e T o a n a ly z e t h e r o l e o f 4 1 B B L , e x p re s s e d i n t h e re g u la t io n o f h u m a n p e ri p h e r a l b lo o d T c e ll a c ti v a t io n . M e t h o d s A p o p to ti c T c e l ls w e re e v a lu a t e d 坊p r o p i d i u m io d id e u p t a k e a n d A n n e x in V b in d i n g . C y to k in e c o n c e n t r a t io n s in s u p e r n a t a n t s w e re d e t e r m i n e d 场E L L S A . P h e n o ty p ic a n a ly s e s w e re p e r fo r m e d w i t h d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e c h n i q u e s i n a F A C S . R e s u l t s M c A b 1 F 1 i n h i b i t e d T c e ll p r o l i f e r a t i o n a n d i n - d u c e d T c e ll s a p o p t o s i s . I n a d d i t io n , M c A b 1 F 1 s u p p re s s e d t h e s e c re t io n o f II r 2 a n d I F N - y , a n d u p re 酗a t e d t h e e x p re s s io n o f C D 9 5 a n d P D - 1 . C o n c l u s io n 4 1 B B L re v e r s e s ig n a l p re v e n t T c e ll a c t iv a ti o n a n d d o w n r e g u l a t e i m - m u n e re s p o n s e s m e d i a t e d 场T c e ll v i a i n h i b i t i n g s e c re t i o n o f c y t o ld n e s a n d u p re g u l a t i n g n e g a ti v e c o s t i m u l a t o ry m o l - e c u l e . 【 K e y w o r d s 】4 - 1 B B L ; R e v e rs e s ig n a l ; C o s t im u l a t o ry m o l e c u le ; T c e ll a c ti v a t io n 4 - 1 B B L ( 4 - 1 B B L ig a n d ) 分子为共刺激分子T N F 家族的重要成员， 表达于活化的B细胞、 单核细胞、 树突状细胞等， 其受体4 - 1 B B 可诱导性表达于活化 早期的T 细胞表面“ ) a 4 - 1 B B L / 4 - 1 B B 结合产生共刺 激信号， 能协同C D 2 8 信号进一步促进T 细胞的活 化、 增殖和功能的 介导(2 ) 。 新近的 研究表明: 4 - 1 B B L 还 表 达于 活 化的T 细胞 表面。 S c h w a rz 等(3 ) 报道， 利 用4 - 1 B B 转基因细胞或4 - 1 B B - F c 融合蛋白刺激活化 T 细胞表面的4 - 1 B B L 分子， 能够抑制其增殖， 但是 具体的机制目 前尚未阐明。本实验利用本单位研制 的抗人4 - 1 B B L 功能性单抗1 F 1 14 ) 对活化T 细胞表达 4 - 1 B B L 分子的生物学功能及其调节机制作了进一 步的探讨。 材料和方法 基金项目: 国家自然基金青年科学基金项目( 3 0 4 0 0 3 9 4 ) ; 江苏省 教育厅博士生创新计划( 5 0 3 2 0 0 2 5 ) 作者单位: 2 1 5 0 0 7 苏州大学医学生物技术研究所， 苏州大学附属 第一人民医院临床免疫实验室 通 讯作者: 张学光， E m a i l : s m b x u e g z p u b li c l . s z . c n ， 电话: 0 5 1 2 - 6 5 1 2 5 0 1 1 材料: 胎牛血清( F C S ) 购自 美国H y c lo n e 公司; R P M I 1 6 4 ( ) 培养基购自 美国G I B C O公司; 淋巴细胞 分离液购自中国上海试剂二厂; 包被羊抗鼠二抗的 免疫磁珠、 激发型C D 3 单抗、 a n t i - P D - 1 - P E 直标单抗、 a n t i- C D 9 5 - P E 直标单抗及A n n e x in V 试剂盒( 内含P I 染液) 购自 法国I m tn u n o t e c h 公司; a n t i - 4 - 1 B B L - P E 直 标 单抗购自 美国P h a r n ti n g e n 公司; 4 - 1 B B L 单抗1 F 1 及激发型C D 2 8 单抗1 0 ”为本单位研制(， 气I L - 2 和 I F N - y E L I S A试剂盒购自 美国R 2 4 孔培养 板购自 丹麦N u n c 公司; 酶标仪购自 美国B i o - R a d 公 司; 流式细胞仪购自 美国C o u l t e r 公司。 外周血T淋巴细胞的制备: 取3 个健康志愿者 全血， 采用F i c o ll 淋巴细胞分离法， 获得外周血单个 中 华 微 生 物 学 和 免疫 学杂 志2 0 0 6 年2 月 第2 6 卷 第2 期 C h in J M ic ro b io l I rn m u n o l , F e b r u a r y 2 0 0 6 , V o l 2 6 , N o . 2 核细胞， 继而采用免疫磁珠结合的抗人C D 1 9 , C D 5 6 和C D 1 4 单抗阴性选择法( 按说明书进行操作) ， 去 除C D 1 9 , C D 5 6 和C D 1 4 阳性细胞， 富集T 细胞。 T 细胞体外活化前后4 - 1 B B L 表达的改变: 激发 型C D 3 单抗( 用p H 7 . 4 的P B S 调整至抗体浓度为 1 澎m l ) 包被2 4 孔板， 每孔加3 0 0 1, 1 , 4 过夜， 吸去 上清， P B S 洗涤2 次。 对照组包被小鼠I g G 1 同型对 照抗体。用含 1 0 % F C S 的B P M I 1 6 4 0 培养基将T细 胞调整为3 x 1 0 5 个/ r n l ， 接种于该 2 4 孔板， C D 2 8 单 抗1 0 ”按 终 浓 度1 p g / m l 加人实 验组， 总培养体积 为1 m l/ 孔， 同时设小鼠I g G I 对照组。3 7 T, 5 % C O Z 培养3 d ， 收集活化 T 细胞及静止T 细胞， 采用 a n t i - 4 - 1 B B L - P E 标记细胞， F R C S 分析4 - 1 B B L 分子在活化 T 细胞及静止 T细胞上的表达。 T细胞活化的体外抑制实验: 激发型 C D 3 单抗 和4 - 1 B B L 单抗1 F 1 混合( 用p H 7 . 4 的P B S 调整至抗 体浓度均为1 p g / r n l ) ， 按3 0 0 川 / 孔， 共同 包被2 4 孔 板， 4 过夜后弃包被液， P B S 洗 2 次。对照组包被 C D 3 单抗和小鼠I g G 1 。用含1 0 % F C S 的R P M I 1 6 4 0 将T 细胞浓度调整为 3 x 1 0 5 个/ m l ， 接种于该 2 4 孔 板， C D 2 8 单抗I O F 3 按终浓度1 留m l 加人实验组及 对照组， 总培养体积为 I m l / 孔。3 7 t, 5 % C O , 培 养， 分别在 1 , 2 和3d 收集细胞， 进行细胞计数， 同 时收集上清， E L I S A法测定上清中M - 2 和I F N - y 的 含 量。 收 集 第3 天的 细 胞标记a n t i - C D 9 5 - P E 和a n t i- P D - 1 - P E , F A C S 分析表型及 P I / A n n e x i n V双染法( 按 说明书进行操作) 分析T 细胞的凋亡。 统计学方法: 所获得的数据采用S P S S 1 0 . 0 统计 软件分析。P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 4 . 4 - 1 B B L逆向信号上调 C D 9 5和 P D - 1 的表 达: 激发型 C D 3 单抗联合 C D 2 8 单抗刺激T细胞组 中加人单抗 1 F 1 ， 培养至第 3 天时， 用 a n t i - C D 9 5 - P E 和a n t i - P D - 1 - P E 标记及F A C S 分析表型显示， T 细胞 上调表达 C D 9 5 和P D - 1 ( 表5 ) 。 表5 单抗 1 F 1 上调 Mc A b C D 3 + 1 0 0 活化的 T细胞 C D 9 5 和P D - 1 的表达( MR, n = 3 ) T a b l e 5 . Mc A b 1 F 1 n p r e g u l a t e d山 e e x p r e s s i o n o f C D 9 5 a n d P D - i o n t h e T c e l l s a c t iv a t e d b y M c A b C D 3 + 1 0 F 3 ( MF I , n二 3 ) M c A b C D 3 +1 0 F 3 + I 酮1 Mc A b C D 3+I O F 3+I F l 3 1 . 0士2. 6 3 7 . 8 土3 A* 1 . 6士0. 2 2. 6t0_ 2* M F I : m e a n fl u o r e s c e n c e in t e n s i t i e s . Compared w i t h c o n tr o l ( M c A b C D 3 +I O M+ I g G I ) ，P 0 . 0 5 讨论 4 - 1 B B L 分子为共刺激分子 T N F 家族的重要成 员， 表达于活化的 B细胞、 单核细胞、 树突状细胞 等， 其受体4 - 1 B B可诱导性表达于早期的活化 T 细 胞。 4 - 1 B B L J 4 - 1 B B 介导的 共刺激信号可以 诱导T 细 胞的活化、 增殖及抗凋亡作用， 同时还可维持T 细胞 的长期生存。新近的研究表明， 4 - I B B L 和4 - i B B 结 合后除了 通过受体4 - 1 B B 传递正向信号外， 还可通 过配体传递逆向信号， 产生一系列生物学效应。例 如， L a n g s te l。 等 (6 ) 报 道， 采 用4 - I B B - F e 融 合 蛋白 刺激 单核细胞， 通过膜4 - I B B L 传递的逆向信号能诱导单 核细胞的活化、 扩增， 促进细胞因子的分泌， 并能增 强其功能。4 - 1 B B L 同样可表达于活化的T细胞表 面， 而且可以传递逆向信号。S c h w a r z 等(3 ) 报道， 利 用4 - 1 B B 转基因细胞或4 - 1 B B - F c 融合蛋白 刺激活化 T 细胞表面的4 - I B B L 分子， 能够抑制其增殖， 但是 4 - 1 B B L 逆向 信号抑制活化T 细胞增殖的具体机制， 及在免疫应答调节中的生物学意义目 前尚未阐明。 本研究采用激发型C D 3 单抗联合 C D 2 8 单抗活化T 细胞， 诱导T 细胞表达膜4 - 1 B B L 分子， 在T 细胞的 活化过程中， 采用抗人4 - 1 B B L 单抗I F l 激发4 - 1 B B L 逆向信号， 观察T 细胞增殖和凋亡等生物学效应， 探 讨了上述效应的生物学机制。本研究证实了在T 细 胞的活化过程中， 4 - 1 B B L 介导的逆向信号可明显抑 制T 细胞增殖， 且可使T 细胞发生大量凋亡。实验 结果显示， 4 - 1 B B L 逆向信号抑制T 细胞增殖的效应 在两天后差异具有统计学意义。我们推测， 由于4 - 1 B B L 逆向 信号的抑制效应在T 细胞活化之后起作 用， 而两天前的T 细胞可能还未充分活化或只有部 分活化， 因此， 两天前的抑制效应不明显， 但是当T 细胞的活化程度随着时间的延长而增加， 4 - l B B L 逆 向 信号的抑制效应也随之增强。进而本研究发现， 在T 细胞的活化过程中， 单抗 1 F 1 激发的4 - 1 B B L 逆 向信号可使T 细胞培养上清中I L - 2 和I F N - y 分泌水 平显著下降， 而T 细胞膜 C D 9 5 和P D - 1 分子明显上 调的表达。I L - 2 是T 细胞活化、 增殖和维持长期生 存的重要细胞因子， I F N - y 分泌水平也是反映T 细 胞活化水平的重要指标。降低这些T 细胞因子的产 生可能是4 - 1 B B L 逆向信号促进T 细胞凋亡， 抑制T 细胞活化、 增殖和长期生存的部分原因。活化T 细 胞共表达C D 9 5 和P D - 1 等重要的负性调控分子7 -9 ) ， 通过上调 C D 9 5 和P D - 1 分子的表达可能是4 - 1 B B L 逆向信号发挥负性调控效应的另一个重要的途径。 而除了 上述分子参与了4 - 1 B B L 逆向信号对T 细胞 活化的调控， 其他分子机制是否参与其中， 尚需进一 步研究。另一方面， 由于4 - 1 B B L 及其受体4 - 1 B B 共 表达于活化的T细胞表面， T细胞之间或 T细胞自 身可能通过4 - 1 B B L 和4 - 1 B B的相互作用形成环路， 从而介导4 - 1 B B 信号促进T 细胞的活化， 因此， 单抗 1F1 有可能干扰4 - 1 B B L 和4 - 1 B B 相互作用或其环路 的形成， 从而成为单抗 1 F 1 抑制T细胞增殖的一个 因素。这种现象在T 细胞功能调节中的作用还有待 于进一步的探讨。 1 0 4中华微生物学和免疫学杂志2 0 0 6 年2 月第2 6 卷第2 期 综上所述， 共刺激分子 T N F / T N F 受体家族成员 4 - 1 B B L / 4 - 1 B B 是 T细胞活化的重要分子基础。4 - 1 B B L /4 - 1 B B 为T 细胞活化过程提供重要的协同信 号， 而T 细胞表面诱导性表达的4 - 1 B B L 可通过逆向 信号为活化T 细胞提供重要的负性调控信号， 从而 参与免疫应答的精确调控。 参考文献 A l d e r s o n M R , S m it h C A , T o u g h T W, e t a l . M o l e c u l a r a n d b i o lo g ic a l c h a r a c t e r i z a t io n o f h u m a n 4 - 1 B B a n d it s li g a n d . E u r J I m m u n o l , 1 9 9 4 , 2 4 ( 9 ) : 2 2 1 9 - 2 2 2 7 . M e l e ro I , B a c h N , H e l l s t r o m K E , e t a l . A m p l if i c a t i o n o f t u m o r i m m u n it y 场g e n e t r a n s f e r o f t h e c o- s t i m u l a t o ry 4 - 1 B B l i g a n d : s y n e r g y w i th t h e C D 2 8 c o- s t i m u l a t o ry p a t h w a y . E u r J I m m u n o l , 1 9 9 8 , 2 8 ( 3 ) :1 1 1 6 - 9 1 1 2 1 . S c h w a r z H , B l a n c o F J , v o n K e m p i s J , e t a l . I L A , a m e m b e r o f t h e h u - m a n n e r v e g r o w th f a c to r / t u m o r n e c ro s i s f a c t o r r e c e p t o r f a m i ly , r e g u l a t e s T - l y m p h o c y te p ro l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l . B l o o d , 1 9 9 6 , 8 7 ( 7 ) : 2 8 3 9 - 2 8 4 5 . J u S W, J u S G , W a n g F M, e t a l . A f u n c t i o n a l a n t i - H u m a n 4 - 1 B B li g a n d m o n o c l o n a l a n t ib o d y t h a t g r e a t l y e n h a n c e s t re m e n d o u s p ro l i f e r a t i o n o f m o n o c y t e s 师re v e r s e s i g n a li n g o f 4 - 1 B B L . H y b r i d H y b r i d o m i c s , 2 0 0 3 , 2 2 ( 5 ) : 3 3 3 - 3 3 8 . 居颂文， 刘琳， 居颂光， 等. 鼠抗人 C D 2 8 功能性单克隆抗体的 研制及其生物学特性的鉴定. 上海免疫学杂志， 2 0 0 3 , 2 3 : 3 1 8 - 3 2 0. L a n g s t e i n J , M i c h e l J , S c h w a rz H . C D 1 3 7 I n d u c e s p ro l i f e r a t i o n a n d e n - d o m i t o s i s i n n a n o c y t e s . B l o o d , 1 9 9 9 , 9 4 ( 9 ) : 3 1 6 1 - 3 1 6 8 . I s h id a Y , A g a t a Y , S h i b a h a r a K , e t a l . I n d u c e d e x p r e s s io n o f P D - 1 ， a n o v e l m e m b e r o f t h e i m m u n o g l o b u l i n g e n e s u p e r f a m i l y , u p o n p ro g r a m m e d c e l l d e a t h . E M B O J , 1 9 9 2 , 1 1 ( 1 1 ) : 3 8 8 7 - 3 8 9 5 . F re e m a n G J , L o n g A L I w a i Y , e t a l . E n g a g e m e n t o f t h e P D - 1 im m u - n o in h i b i t o ry r e c e p t o r b y a n o v e l B 7 f a m il y m e m b e r l e a d s t o n e g a t i v e r e g u - l a t i o n o f l y m p h o c y te a c t i v a t i o n . J E x p M e d , 2 0 0 0 , 1 9 2 ( 7 ) : 1 0 2 7 - 1 0 3 4 . J u S T , P a n k a D J , C u i H , e t a l . F a s ( C D 9 5 ) F a s L in t e r a c t i o n s r e q u ir e d f o r p ro g r a m m e d c e ll d e a t h a f t e r T - c e ll a c t iv a t i o n . N a t u re, 1 9 9 5 , 3 7 3 ( 6 5 1 3 ) : 4 4 4 4 4 8 . ( 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 8 - 2 ,6 ) + 第四届北京生命科学领域联合年会通知 自2 0 0 3 年以来， 北京生命科学 领域联合年会已 成功举办了 三届。会议围绕国内外的生命科学领域的最新进展和北京地 区生命科学的工作动态， 已累 计邀请了四十余位国内 外著名专家到会演讲， 吸引了近三千名生命科学领域的科技人员 参与交 流， 目 前已 成为北京地区生命科学领域的重要学术活动。 为了 更好地促进生命科学领域跨学科的合作与交流， 在北京市自 然科学基金委员 会和北京市科学技术协会的支持下， 北 京生理科学会、 北京生物化学与分子生物学会、 北京免疫学 会、 北京遗传学会、 北京神经科学学 会、 北京实验动物学学会、 北京 环境诱变剂学会、 北京微生物学 会、 北京生物工程学 会、 中华医学会北京消化分会、 北京中关村生物工程和新医药企业协会等 机构共同 发起召开第四届北京生命科学领域联合年会。 会议主题: “ 生 命科学与人类健康” ， 会议定于2 0 0 6 年2 月2 5日 在北京首都医 科大学学术报告厅召开。 会议演讲嘉宾: 程书钧( 中国医学科学院 研究员， 中国工程院院士) ， 报告题目: 肿瘤研究的新挑战; 饶子和( 中 科院生物物 理所所长， 中国科学院院士) ， 报告题目: 病毒与抗病毒药 物研究; 赵春华( 中国 协和医 科大学教授， 长江学者) ， 报告题目: 成体 干细胞可塑性机制及其临床应用研究; 周蛟( 农业部禽流感防控专家组组长， 北京农科院畜牧兽医 研究所研究员) ， 报告题目: 禽流感的国内 外进展; 谭华荣( 中 科院 微生物研究所副所长) ， 报告题目: 微生物次生代谢的分子遗传学; 徐建国( 中国疾病预 防 控制中 心传染病预防 研究所所长) ， 报告题目 : 猪链球菌研究 进展; 纪立农( 北京大学 人民医院内分泌科主任) ， 报告题目: 糖 尿病治疗研究进展; 蒋澄宇( 中国协和医科大学特聘教授) ， 报告题目: S A R S 研究进展; 王宾( 中国农业大学教授) ， 报告题目: 诱 导抗原专一性免疫抑制现象的 发现和应用; 王克威( 北京大学神经科学 研究所教授、 长江学者) ， 报告题目 : 钾离子通道研究进 展; 张愚( 宣武医院细胞治疗中心主任、 教授) ， 报告题目 : 神经干细胞研究进展; 郑德先( 中国协和医 科大学教授) ， 报告题目: 细 胞凋亡的信号传递与基因治疗; 柯美云( 北京协和医院消化内科主任医师、 教授) ， 报告题 目: 胃 肠功能性疾病与精神心理障 碍。 本次会议不收费， 参会人员 将可获得继续教育学分。热切希望京区及国内 外有关人士参加这一学术盛会! 并欢迎参加 论文交流! 会议秘书处: 联系 人: 赵吉利、 王小辉、 余涛; 通讯地址: 北京海淀区学院 路3 8 号北大医学部会议中心一层南侧， 1 0 0 0 8 3 ; 电 话: 0 1 0 - 8 2 8 0 2 4 8 8 ; 传真: 0 1 0 - 8 2 8 0 2 5 1 5 ; 电 子邮 件: z h a o j ili n e w li f e . o r g . c n ; 网 址: 新生 命网 站: h t tp : / / w w w . n e w l if e . o r g . c n