BCRABL酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达.pdf

书书书 ·研究原著·文章编号： 1000-2790 （2006） 15-1361-04 Bcr-Abl 酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达 王淑红1， 梁英民2， 邢佩霓3， 刘海妮1， 王耀春4， 杨 曦4， 蒋珊珊2， 李军林4， 李军锋4 （1西安交通大学第一医院肿瘤 内科， 陕西 西安 710061，第四军医大学： 2 唐都医院血液科， 陕西 西安 710038， 4 基础部医学遗传学和发育生物学教研室， 陕西 西安 710033， 3 陕西省人民医院血液科， 陕西 西安 710068 = ） 收稿日期： 2006-01-06； 接受日期： 2006-02-21 基金项目： 国家自然科学基金 （30370598） 通讯作者： 梁英民. Tel：（ （029） 84777843 Email： liangym fmmu. edu. cn 作者简介： 王淑红. 硕士生 （导师邢佩霓） . Tel：（ （029） 85274334 Email： wsh2003126. com Production， expression and purifica- tion of Bcr-Abl tyrosine kinase domain and its mutants WANG Shu-Hong1，LIANG Ying-Min2，XING Pei-Ni3，LIU Hai- Ni1，WANG Yao-Chun4，YANG Xi4，JIANG Shan-Shan2，LI Jun- Lin4，LI Jun-Feng4 1Department of Oncology，First Hospital，Xian Jiaotong University， Xian 710061，China， 2Department of Hematology，Tangdu Hos- pital，Fourth Military Medical University，Xian 710038，China， 3Department of Hematology，Peoples Hospital of Shaanxi Pro- vince，Xian 710068，China， 4Department of Medical Genetics & Developmental Biology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University，Xian 710033，China 【Abstract】AIM：To prepare the Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain and its mutants，which will lay a foundation for the study on the resistance to imatinib. METHODS：PCR was used to amplify the sequence of Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain from plasmid pGD210.Its main mutants （ T315I， Y253F， E255K，E255V）were got by recombinant PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET-32a after sequencing，and the recombinant plasmid was expressed in E. coli strain BL21 induced by IPTG. The fusion protein was purified from the cell lysates by Ni-NTA affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE. RESULTS：The sequence of Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain was successfully cloned，and was identical to that in Gen- Bank. Point-mutants were got by recombinant PCR and then the recombinant plasmid was expressed in BL-21. CONCLUSION： The fragments of Bcr-Abl kinase domain and its mutants can be expressed in inclusion bodies，accounting for over 70% of total bacterial proteins. And the fusion protein can be purified to over 95% using Ni-NTA affinity chromatography. It will facilitate the research of chronic myeloid leukemia treatment. 【Keywords】 protein-tyrosine kinase；mutation；recombinant， genetic；PCR；fusion expression；protein purifica- tion 【摘 要】目的：制备 Bcr-Abl 激酶域及其突变体-His 的重组 蛋白. 方法： 用 PCR 方法从含有 Bcr-Abl 全长的质粒 pGD210 中扩增出 Bcr-Abl 激酶域片段， 再通过重组 PCR 技术获得激 酶域的几个主要突变体 （T315I， Y253F， E255K， E255V） ， 测序 正确后将其克隆到原核表达载体 pET-32a 中， 构建表达激酶 域片段和 His 标签融合表达的载体， IPTG 诱导表达， 得到的融 合蛋白用镍 - 次氮基三乙酸 （Ni-NTA） 琼脂糖进行亲和层析 纯化. 结果： 成功得到了 Bcr-Abl 激酶域及其突变体序列， 经 序列分析证实后将重组质粒转入 BL-21 进行表达. 结论：通 过重组 PCR 技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合 蛋白表达在包涵体， 占菌体总蛋白的 70%以上. 经 Ni-NTA 镍 珠纯化后， 纯度在 95%以上. 【关键词】蛋白质酪氨酸激酶； 突变； 重组， 遗传； 聚合酶链反 应； 融合表达； 蛋白纯化 【中图号】R392. 11 【文献标识码】A 0 引言 STI571 （格列卫） 是一种特异性 Bcr-Abl 酪氨酸 蛋白激酶抑制剂， 可以竞争性结合 Bcr-Abl 融合蛋白 激酶上的 ATP 结合位点， 是近年慢性粒细胞白血病 （CML） 靶向治疗研究的一项重大进展 1. 临床研究 结果证明对 CML 的疗效显著优于干扰素， 然而像其 他药物一样， 耐药性的产生很快又成为影响 STI571 疗效的一个新的障碍， 而对耐药患者的研究观察中发 现， 引起耐药的主要原因是白血病细胞中 Bcr-Abl 酪 氨酸激酶域重新激活， 并证明了这种重新激活和酪氨 酸激酶域活性中心的基因点突变直接相关 2 -3. 我 们成功克隆并且表达得到了 Bcr-Abl 激酶域及其突 变体蛋白， 为进一步研究 STI571 耐药打下良好的 基础. 1 材料和方法 1. 1 材料 pGD-210 （第四军医大学唐都医院血液 科） ； 原核表达载体 pET-32a， 菌株 XL-10 与 BL-21 由 第四军医大学遗传与发育分子生物学教研室提供； 1631 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （15） http： / / journal. fmmu. edu. cn pMD18 - T （以下简称 T 载体）（TaKaRa 公司） . 引物 由 TaKaRa 公司合成. dNTP， rTaq 聚合酶、 T 载体、 连 接酶、 限制性内切酶、 DNA 酶 （TaKaRa 公司） ； 质粒提 取试剂盒 （上海华舜生物工程有限公司） ； 胰蛋白胨、 酵母粉、 IPTG， DNA 酶、 脱氧胆酸钠 （DOC） 、 溶菌酶、 尿素， 咪唑 （鼎国生物制剂公司进口分装） . 镍 - 次氮 基三乙酸 （Ni-NTA） 琼脂糖 （Qiagen 公司） ； BCA 蛋白 定量试剂盒 （Pierce 公司） . 1. 2 方法 1.2. 1 Bcr-Abl 野生型激酶域片段的扩增、 克隆和鉴 定 以含有 Bcr-Abl 全长的 pGD-210 质粒为模板， 用 PCR 方法扩增激酶域， 引物设计参考文献 3 ， 并用 NTIvector8. 0 软件进行比对， 引物为 AK1：5'-CG- CAACAAGCCCACTGTCT-3'；AK2：5'-TCCACT- TCGTCTGAGATACTGGATT-3'， PCR 条件为： 95 预 变性 5 min， 94变性 1 min， 56复性 1 min， 72延 伸 1 min， 30 个循环， 72末次循环 7 min， 将 PCR 产 物插入 T 载体， 转化 XL-10 大肠杆菌感受态细胞， 提 取质粒并进行酶切鉴定， 所获正确克隆送上海基康公 司测序， 测序正确且正向插入的克隆命名为 Bcr- Abl - TAK. 1. 2. 2 突变体的扩增、 克隆和鉴定 利用重组 PCR 技术获得突变体激酶域. 设计含突变点在内的引物 T315TIUp：5'-CAATGATGATATAGAACGGGG-3'； T315IDown：5'-CATTGAGTTCATGACCTACGG-3'，与 扩增野生型激酶域的引物 AK1， AK2 一起分别扩增 突变体的上、 下游片段， 目的片段回收后取等量混合， 95变性 5 min， 72延伸 2 min， 再以延伸产物为模 板， AK1， AK2 为引物进行次级 PCR 扩增， 95 预变 性5 min， 94变性1 min， 58复性1 min， 72延伸1 min， 30 个循环， 72末次循环 7 min. 同样将 PCR 产 物插入 T 载体， 测序正确且正向插入的克隆命名为 T-T315I. 用同样的方法获得其他几个突变体， 引物 分别 为 Y253FUp：5'-CGTACACCTCCCCGAACTGG- 3'；Y253FDown：5'-TCGGGGAGGTGTACGAGGG-3'； E255KUp： 5'-CGTACACCTTCCCGTACTGG-3'； E- 255KDown：5'-ACGGGAAGGTGTACGAGGG-3'； E255VUp： 5'-CGTACACCACCCCGTACTGG-3'； E- 255VDown：5'-ACGGGGTGGTGTACGAGGG-3'. 分别 命名为 T-Y253F， T-E255K， T-E255V. 1. 2. 3 表达克隆的建立、 鉴定 将克隆 Bcr-Abl- TAK， T-T315I， T-Y253F， T-E255K， T-E255V 分别经限 制性内切酶 EoR酶切、 补平， 再经 Hind酶切， 回 收目的片段. 原核表达载体 pET-32a 经 EoRV， Hind 双酶切后和目的片段相连， 转化， 提取质粒酶切 鉴定. 1. 2. 4 融合蛋白的表达、 鉴定 将酶切鉴定正确的 克隆转化 BL-21 大肠杆菌感受态细胞， 在氨苄青霉素 抗性阳性的 LB 培养基中， 37， 250 r/ min 振荡培养 过夜， 按 1% 转接至 2 mL LB 中， 相同条件振荡培养 约 2. 5 h （A600 nm约为 0. 6） 后加入终浓度 0. 4 mmol/ L 的 IPTG， 诱导培养 3 h， 12 879 g/ min 离心， 收集菌 体， 50 µL 去离子水重悬， 加入等量 2 × loading buffer 混匀， 100煮沸 10 min， 离心取上清进行 SDS-PAGE 电泳. 将表达的克隆测序正确后分别命名为 AK- 32a， T315I-32a， Y253F-32a， E255K-32a， E255V-32a. 1. 2. 5 目的蛋白表达形式分析 诱导表达目的蛋 白， 低温离心收集菌体， PBS 重悬， 每克菌加入800 µg 的溶菌酶溶液， 冰浴 20 min， 4， 12 879 g/ min 离心， 上清为细菌外周质部分. 沉淀用 PBS 重悬， 每克菌加 入 4 mg 脱氧胆酸钠 （DOC） ， 37 搅拌 20 min， 加入 20 µg DNA 酶， 室温放置约 30 min， 100 W 超声裂解 50 次， 低温高速离心， 上清为细菌胞质部分， 沉淀为 包涵体部分. 将所得样品分别进行 SDS-PAGE 电泳， 观察融合蛋白的表达状态. 改变表达条件， 试图获得 可溶性表达. 1. 2. 6 融合蛋白的纯化、 复性 用 8 mol/ L 尿素溶 解包涵体， 4 过夜. 将包涵体溶解液装入 Ni-NTA Resin 亲和层析柱， 用浓度依次递增的咪唑缓冲液 （8 mol/ L 尿素， 0. 1 mol/ L NaH2PO4，0. 01 mol/ L Tris- HCl， 咪唑的浓度依次为 100， 200， 300， 500 mmol/ L） 洗脱带有多聚组氨酸标签的靶蛋白， 分管收集. 蛋白 纯化后通过逐步稀释和透析缓慢降低尿素浓度， 用 300 g/ L PEG2000 浓缩蛋白， Bradford 法进行蛋白 定量. 2 结果 2. 1 野生型激酶域基因片段的扩增及测序 从质粒 pGD-210 中扩增 Bcr-Abl 激酶域基因片段， 得到大小 为 863 bp 的 DNA 片段 （图 1） ， 插入到 T 载体用 Smal 进行酶切鉴定， 正向插入则会得到约 400 bp 和260 bp 的片段 （图 2） ， 测序结果用 NTIVector8. 0 进行比 对， 结果表明所扩增的片段和 GenBank 公布的 Bcr- Abl 激酶域的碱基序列完全相符. 2. 2 突变型激酶域基因片段的扩增和鉴定 重组 PCR 扩增激酶域突变体上下游片段如图 3， 获得的突 变体激酶域 T315I， Y253F， E255K， E255V 如图 1， 酶 切鉴定结果如图2. 测序结果显示除设计的突变点外 无其他突变. 2631 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （15） http： / / journal. fmmu. edu. cn M：DNA marker； 1： T-AK； 2： T-T315I；3： T-Y253F；4： T-E255K； 5： T- E255V. 图 1 Bcr-Abl 激酶域及突变体的扩增产物 M： DNA marker； 1： T-AK； 2： T-T315I；3： T-Y253F； 4： T-E255K；5： T- E255V. 图 2 pMD-18T 重组质粒酶切鉴定结果 M：DNA marker； U：上游片段；D：下游片段 1： T-T315I；2： T-Y253F； 3： T-E255K； 4： T-E255V. 图 3 重组 PCR 扩增激酶域突变体上下游片段 2.3 表达载体的构建 重组质粒用 Xhol， Bgl双 酶切鉴定， 琼脂糖凝胶电泳在约 500 bp 处显示条带， 和预期片段大小一致 （图 4） . M：DNA marker； 1： AK-32a； 2： T315I-32a；3： Y253F-32a； 4： E255K-32a； 5： E255V-32a. 图 4 pET-32a 重组质粒酶切鉴定结果 2. 4 重组蛋白的表达形式分析 SDS-PAGE 电泳结 果显示工程菌表达了50 ku 左右的蛋白. 利用因特网 （mascot. proteomics. com. cn） 计算目的蛋白 33 ku， 载 体 pET-32a 的 His 标签为 21 ku， 两者融合表达 54 ku 大小的蛋白， 和电泳显示的结果一致 （图 5） ， 融合蛋 白几乎完全以包涵体的形式表达 （图 6） ， 占菌体总蛋 白的70%以上. 改变诱导剂的浓度、 诱导时间及诱导 温度， 融合蛋白依旧表达在包涵体. M：marker；1： AK-32a； 2： T315I-32a；3： Y253F-32a； 4： E255K-32a； 5： E255V-32a. 图 5 pET-32a 重组质粒的表达 1： 菌体总蛋白； 2： 细胞周质蛋白； 3： 包涵体蛋白； 4： 细胞质蛋白. 图 6 His 融合蛋白表达分析 2. 5 融合蛋白的纯化、 复性 融合蛋白在 200 mmol/ L 咪唑中洗脱 （图 7） ，SDS-PAGE 并进行凝胶 M：marker； 1 5：纯化的融合蛋白. 图 7 His 融合蛋白的纯化 3631 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （15） http： / / journal. fmmu. edu. cn 薄层扫描， 蛋白纯度在 95% 以上. 蛋白浓度定量为 450 650 mg/ L. 3 讨论 Bcr-Abl 融合蛋白的形成是 CML 发生的关键， 是 由于融合蛋白酪氨酸激酶活性的异常升高， 激活了下 游的信号转导通路而造成造血干细胞增殖和凋亡的 紊乱. 许多学者从激酶活性、 信号转导等各个层面入 手， 试图从分子生物学角度解决 CML 的治疗问 题 4 -5. 激酶域是 Bcr-Abl 酪氨酸蛋白激酶的活性中 心， 包括 A 环和 P 环， ATP 和 P 环结合后， Bcr-Abl 酪 氨酸蛋白激酶活化， A 环旁移， 激酶域第 381 位的天 冬氨酸和 Mg2 +结合， A 环的 C 端和下游底物结合使 其磷酸化， 从而发生一系列生物化学反应 6. 所以干 扰 ATP 和 P 环结合， 抑制 Bcr-Abl 激酶域活化， 从理 论上是寻求治疗 CML 的有效途径， 而 STI571 的应用 也在实践中证明了这一点 7. 然而突变后的激酶域 可以改变空间构象阻止和药物的结合， 而使其酪氨酸 激酶活性保持不变 8 -9， 就此， 我们设想如果可以构 建 Bcr-Abl 酪氨酸蛋白激酶的激酶域及其突变体， 则 可以为进一步研究 CML 治疗提供新的研究思路和 途径. 已经检测到的 Bcr-Abl 酪氨酸激酶域的点突变 有 20 余种 10， 我们选择了导致格列卫耐药的发生机 率较高的 4 种突变体进行了克隆. 目的蛋白以包涵 体的形式表达， 而包涵体必须在变性条件下才可以溶 解， 用 Ni-NTA 镍珠纯化蛋白时我们发现其和镍珠结 合的能力明显下降， 增加了纯化的难度， 原因可能是 因为变性后的蛋白失去了空间构象， 影响了 His 和镍 珠的结合， 我们也曾试图用盐酸胍来溶解蛋白， 使 His 暴露的更充分， 但由于溶解在盐酸胍中的蛋白样 品无法直接进行 SDS-PAGE 电泳， 而透析后蛋白的损 失太多也无法观察到理想的电泳结果. 同时我们比 较了用逐渐降低 pH 值和使用不同浓度咪唑洗脱的 纯化方法， 通过电泳和定量结果发现两种方法之间没 有明显差异， 所以选择了用尿素溶解蛋白、 不同浓度 咪唑洗脱的方法. 虽然包涵体蛋白的纯化有一定的 难度， 但是与分泌性蛋白比较， 其优点是得到的蛋白 纯度较高. 我们成功表达并且纯化了 Bcr-Abl 激酶域 及其突变体蛋白， 为进一步深入研究激酶域突变耐药 提供了物质基础. 【参考文献】 1Druker BJ，Talpaz M， Resta DJ，et al. Efficacy and safety of a spe- cific inhibitor of the bcr-abl tyrosine kinase in chronic myeloid leuke- mia J . N Engl J Med， 2001， 344 （14） ： 1031 -1037. 2Cowan-Jacob SW，Guez V，Fendrich G，et al. Imatinib（STI571） resistance in chronic myelogenous leukemia：molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment J . Mini Rev Med Chem， 2004， 4 （3） ： 285 -299. 3Branford S，Rudzki Z，Walsh S，et al. High frequency of point mu- tations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib（STI571）resist- ance J . Blood， 2002， 99 （9） ： 3472 -3475. 4Krause DS，Van Etten RA. Adoptive immunotherapy of BCR-ABL- induced chronic myeloid leukemia-like myeloproliferative disease in a murine model J . Blood， 2004， 104（13） ： 4236 -4244. 5Rowley PT，Keng PC， Kosciolek BA. The effect of bcr-abl antisense oligonucleotide on DNA synthesis and apoptosis in K562 chronic my- eloid leukemia cells J . Leuk Res， 1996， 20 （6） ： 473 -480. 6Schindler T， Bommann W， Pellicena P， et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase J .Science， 2000， 289 （5486） ： 1938 -1942. 7Cohen MH，Williams G，Johnson JR，et al. Approval summary for imatinib mesylate capsules in the treatment of chronic myelogenous leukemia J . Clin Cancer Res， 2002， 8 （5） ： 935 -942. 8Hochhaus A， Kreil S， Corbin AS， et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib（STI571）therapy J . Leuke- mia， 2002， 16 （11） ： 2190 -2196. 9Branford S，Rudzki Z，Walsh S，et al. High frequency of point mu- tations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib（STI571）resist- ance J . Blood， 2002， 99 （9） ： 3472 -3475. 10Deininger M，Buchdunger E，Druker BJ. The development of ima- tinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia J . Blood， 2005， 105 （7） ： 2640 -2653. 编辑 王 睿 4631 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （15） http： / / journal. fmmu. edu. cn