EB病毒相关性胃癌组织中P53蛋白、P21WAF1蛋白的表达及意义.pdf

中 华 实验和 临床病 毒学杂志 2 0 0 6 年 3 月第 2 0 卷第 1 期C h in e s e J E x o C i n V im , M a re h 2 0 0 6 , V . 2 0 . N . . 1 · 论 著 · E B病毒相关性胃癌组织中P 5 3 蛋白、 P 2 1 W A F I 蛋白的表达及意义 钱军李德群钟飞李志祥鲁令传 【 摘要 目的了解 E B病毒相关性胃癌 ( E B V a G C ) 与非E B病毒相关性胃Im ( E B V a G C 在基因 表达卜的差异， 探讨 E B病毒可能的致胃痛机制。方法对1 5 5 例连续胃腺癌患者癌组织用原位杂交 ( I S H ) 技术检测E R病毒小R N A ( E B E R ) 的表达， 确定其中的E B V a G C 。用免疫组化染色检测所有组织 切片中P 5 3 , P 2 俨胡蛋白的表达。结果l 0 例 ( 6 . 4 5 %) 胃腺癌E B E R I S H结果阳性， 属E B V a G C ; 其中4 例 P 5 3 表达呈微弱盯性， 显著低于 E B V a G C组 5 8例 ( 4 0 %) P 5 3显著阳性, 3 0例 ( 2 1 %) P 5 3微弱阳 性 ; 7 例 ( 7 1 1 0 ) E B V . G C组织中m -, 蛋白染色阳性， 显著高于E B V a G C组 mi l e “ 蛋白阳性表达率 巨 “例 ( 3 8 % ) P 2 1 v “ r, 蛋白染色阳性 。结论E B V a G C有独特的癌变分子机制， P 5 3基因突变不起主要 作 用 。 【 主题词】 胃肿瘤: 1 1 ;r 疹病毒4 刑. 人: 蛋白. P 5 3 : 原位杂交: $ . f o , 41织化学 S ig n ifi c a n c e o f t h e e x p r e s s io n o f P 5 3 p r o te in a n d P 2 1 ' p r o t e in in th e g a s tr i c c a r c io m a . .a ss o c ia t e d 俪山E p s t e i n - B a r r v i m ( E B V ) i n f e c ti o n s Q I A N J u n ， L l D o-q -, Z H O N G F e i , L I Z h i- x ia n g, L U L i re c 4 - . = D e p e -m e e t of S u r g ic a l O n c o lo g y , A ffil ia te d H o sp i ta l f B e n g b u Med i c a l C o lle g e , B e a g b u 2 3 3 0 0 4 , C h in e ( A b s tr a ct O b j e c ti v e T o s tu d y th e d iff e r e n c e i n g e n e e x p r e s s i o n b e tw e e n th e E B V a s s o c i a te d g a s tr ic c a rc in o m a ( E B V a G C ) t is s u e s . T o e x p lo re th e m e c h a n is m o f g a s tr ic c a m i n a m a p a th u g e n e ， 1， i n it ia te d勿 E B V . Me t ho d s I n s it u h y b r id ix a ti o n w a s u s e d t o s tu d y th e freq u e n c i e s o f E R V s m a ll R N A e x p re s s io n in 1 5 5 c a s e s o f g a s t r ic c a 代 i n ol n a tis s u e s . T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f 1 5 3 p ro te in a n d P 2 1 “ ' p ro te in w e r e d e te c te d b y i m ru u n o h i s tu c h e n u s tr y, in a ll g a s t ri c c a rc i n o m a t is s u e s . R e s u lt s T h e -lu r e s s i o n o f E B V s m a ll R N A w a s p o s iti v e in 1 0 o u t o f 1 5 5 c a s e s ( 6 .4 5 %) . T h e e x p r e s s io n o f P 5 3 p ro t e in w a s w e a k l y p o s it iv e in 4 o f th e 1 0 c a s e s . T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f P 5 3 p ro t e i n i n E B V a G C w a s m u c h lo w e r th a n th a t in E B V n G C a n d w a s w e a k ly p o s it iv e in 3 0 o f 1 4 5 ， ， w i th E B V a G C ) . P 2 1 “ r ， e x p r e s s io n w a s d e te c te d 。 7 o f 1 0 c a s e s w it h E B V . G C , b u t in “o u t “1 4 5 c a s e s w i th E B V a G C , P 2 1 v “ r ' e x p re s s io n in E B V a G C w a s m u c h h ig h e r th a n th a t in E B V a G C . C o n c lu s io n T h e r e s e e m s e x is t i n g a s p e c ia l m e c h a n i s m o f p a th o g e n e s is in E B V a G C . 1, w h ic h P 5 3 g e n e m u ta ti o n m a y n o t p la y a n in sp n r ta m r o le . ( K e y w o r d s S to m a c h n e o p l a s m s ; H e r p e s v ir a s 4 , h u m a n ; P ro te i n s P 5 3 ; I n ， 。 。h y b r i d i z a t io n ; l m m u n u h is to c h e r ris t r y E B病毒 ( E B V) 是一种致瘤 D N A病毒， 属Y - 疤 疹病毒亚科， 几乎所有成年人都感染过E B 感染1 。 E B V和 许多淋巴及上皮源性肿瘤相关iz t 。近十年 来， E B V和胃癌的关系成为研究的热点D I 。己知约 1 0 %的普通胃腺癌“ 1 ' 8 0 %以上的胃淋巴 上皮样 癌 ' i , 3 5 %左右的残胃癌的发病和 E B V感染有 关 5 1 ， 故称这类胃癌为 E B病毒相关性 胃癌 ( E B V a G C ) 。全球每年新增近 9 0 万例胃癌患者， E B V a G C的绝对数字远远超过其他 E B V相关肿瘤的 作者单位 2 3 3 0 1H安 徽蚌 埠 . 蚌 埠 医学 院 附属 医 院肿 瘤外 科 ( 钱军 、 李德 群、 李志样 、 鲁令 传) : 广州 巾由踌 科大学 ( 钟 g ) 病例。 对E B V和 E B V a G C癌变机制的认识: 首先在所 有E B V a G C的癌细胞中都有 E B V的表达， 而在癌周 正常和高度增生的茹膜细胞中则检测不到 E B V的 表 达t a l ; 其次， E B V a G C中E B V以 附加体的 形式 存在 于感染细胞核内， 即线状双链 D N A形成游离环状分 子， 且 E B V末端重复序列的数目一致， 提示肿瘤系 单一感染E B V 的癌细 胞单克隆增生所致， 7 . 9 1 第三， 有证据表明与其他E B V 相关肿瘤相似， E B V a G C I陆 床诊断前患者血清存在高效价的抗病毒抗体， 提示 E B V a G C 发生之前存在 活动的E B V 感染I9 7 本研究用E B E R L S H方法确定 1 5 5 例连续胃腺 中华实验和临床病毒学杂志2 0 、年3 月第2 0 卷第t 期C h i n e s e 1 R x n C l S e n s e 探 针 :5 ' - T C T G T G G C A GG A C T GG T G G GC C C T - G A A C A T - 3 ' ) 进行杂交反应， 地高辛标记 与 检测试剂 盒检测杂交结果, S e n s e 探针用于检测杂交反应的特 异性。阳性标本应该是几乎所有癌细胞胞核染呈深 蓝色 。 1 . 2 . 2 P 5 3 蛋自表达的检测采用免疫组化抗原热 修复技术检测 P 5 3 蛋白表达， 抗原修复液为拘椽酸 缓冲液 ( p H 6 _ 0 ) ， 一抗为 D o - 7单克隆抗体， 阳性对 照为已知P 5 3蛋白阳性的乳腺癌组织切片， 阴性对 照用 P B S 代替一抗， 试剂购于北京中山生物技术有 限公司。参照文献确定 P 5 3蛋自染色结果判断标 准 io ， 选取切片中阳性表达最强的1 0 个视野， 根据 阳性细胞数量的多少， 分成一 + 级， 其中 一: ( ) ;+: 1 % 一2 5 %;+: 2 6% 一5 0 %;+ + +: 5 1 %一 7 5 %; 十+十+: 7 6 % 一1 0 0 % o根据阳性细 胞核的着色深浅及均匀度， 分成 I 一II度， 1度: 阳 性细胞核呈现不均匀的染色强度， 从深到浅不等; II 度: 阳性细胞核呈现强而均匀着色。将 P 5 3 基因过 表达定为显著阳 性 分级十+十一+ 或阳 性 ll度) ; 微弱阳性 ( 分级 +一+且阳性1 度) 。 1 . 2 . 3 P 2 俨A FI 蛋白表达的检侧 试剂: 鼠抗人 P 2 1 w F I 单克隆抗体及即用型 S P 超敏感免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开 发公司， 碘化丙吮为美国S ig m a 公司产品。 免疫组化染色检测 P 2 1 R A F I 蛋白表达的检测: 采 2结果 2 . 1 E B E R I S H原位杂交检测结果E B E R阳性细 胞浓染呈深蓝色， 且几乎所有癌细胞均呈阳性反应， 共 1 0例 ( 6 . 4 5 %) 胃腺癌标本呈 E B E R阳性， 属 E B V a G C 2 . 2 P 5 3蛋白表达检测结果1 0例 E B V a G C中 4 例 P 5 3 表达微弱阳性， 无一例显著阳性， 明显低于 E B V n G C 组 ( P 0 . 0 5 ) ， 后者 5 8 例 ( 4 0 %) P 5 3显著 阳性， 3 。 例 ( 2 1 %) 微弱阳性 2 . 3 P 2 1 “'蛋白表达的检测结果7例 ( 7 / 1 0 ) E B V a G C癌组织 中 P 2 1 w “ r ， 染色 阳性， 明 显高于 E B V n G C 组 ( P 0 . 0 5 ) ， 后者 5 5例 ( 3 8 %) P 2 1 w “ F 蛋 白阳性表达 ， 3 讨论 位于人染色体 1 7 P 1 3 . 1的P 5 3 基因是迄今研究 最为深人和广泛的抑癌基因之一， 具有重要的细胞 生物学功能 、现 已明确 P 5 3是细胞牛 长周期中的负 调节因子， 与细胞周期的调控、 D N A修复细胞分化、 细胞凋亡等重要的生物学功能有关P 5 3 基因分为 野生型和突变型两种， 其产物也分野生型和突变型 P 5 3 正常功能的发挥有赖于野生型 11 5 3蛋白和特异 D N A序列结合， 从而启动一系列 F游基因的转录， 其中包括 P 2 1 - “ . 。 P 2 俨 4rl蛋白可抑制多种 C y c l in - C D K复合物活 性， 最初在研究 C D K上游调节因子时被发现， 故称 C I P I ( C D K - i n t e r a c t in g p r o t e in l ) 义在研究 P 5 3基因下 游因子 时被发现， 称野生型P 5 3 激活片 段 ( W i l d - t y p e P 5 3 - a c t iv a te d fr a g m e n t 1 , W A F T ) 。表达水 平上， P 2 1 存 在P 5 3 依 赖性和非依赖性两种途径 ”。 P 2 1 的P 5 3 依赖途径是指当细胞 D N A损伤时， 野生 P 5 3 作为转 录因子启动P 2 1 的 表达， 抑制C y c l i n E - C D K 2 复合物 活性， 使R b 低磷醇化， 细胞不能进人S 期而停滞在 C 1 期; 同时， P 2 1 与增殖细胞核抗原 ( P C N A ) 结合使 D N A复制受阻， 上述两方面的作用使细胞生长停 中华 实验和 临床病毒 学杂志 2 0 0 6 年 S 月第 2 0 卷第 1 期C h in e s e J E m C lin V im , M - h 2 0 0 6 , V o l 2 0 ,N o . 1 滞 1 9 1 。 P 5 3 与P 2 1 这一 信号传导 通路功 能的 正常发 挥对控制细胞周期、 维持细胞遗传稳定性具有重要 作用。而这一 通路功能的失常， 在肿瘤发生中也很 常见。对胃 癌组 织的研 究表明: 3 5 %一 5 0 % 的G C 组 织中P 5 3 基因过表达， 5 0 以上的G C 组织中 P 2 1 表 达 异 常 减 弱 a7 E B V a G C是近十年来被人们认识的一个胃癌亚 型， 在临床病理上表现为男性为主， 发病年龄较小， 多为 L a u r e n分型中的肠型 胃癌， 肿瘤多位于胃近 端， 较少淋 巴结 转移和较高 的 5年生存 率、 ”。 E B V a G C癌变的机制和E B V在其中发挥的作用远未 搞清， 但最近的一系列研究表明 E B V a G C癌变的分 子机制明显不同于 E B V n G C ， 有独特的肿瘤相关蛋 白表达谱， 尤为引人注意的是胃癌中常见肿瘤抑制 基因P 5 3 突变或等位基因缺失并不常见于 E B V a G C 中 16 ， 这促使人们考虑与P 5 3 相关的 信号传导通路 在E B V a G C中是否存在功能的失常， 表现的形式如 何、 分子机制是什么?本研究采用免疫组化法检测 E B V a G C和 E B V n G C组织中P 5 3 , P 2 1 W h F, 蛋白的表达 情况， 并将两者进行了对比， 进而推侧其中的分子机 制。 P 5 3 野生型蛋白半衰期仅数分钟， 因此正常组 织免疫组化法检测P 5 3 表达应为 ( 一) ， ( 十) 则表明 P 5 3 突变或野生o f 蛋 白与病毒编码产物结合 在细 胞内异常积聚， 意味着 P 5 3负调节功能的丧失、P 2 1 少发生突变， 其在组织中的免疫组化阳性表明 P 2 1 基因仍然发挥抑癌作用， 阴性则表明功能丧失 本研究中， E B V a G C中无一例 P 5 3蛋白表达显 著阳性， 明显低于 E B V n G C组， 但有 6例 E B V a G C P 5 3微弱阳性。上述结果说明 E B V a G C组织中 P 5 3 蛋白过表达可能是由于非突变机制的作用， 最有可 能的是 P 5 3 蛋白和 E B V编码产物相结合， 造成其异 常积聚在细胞中， 而又达不到突变型 P 5 3 蛋白的的 浓 度。 这个推测和以 往研究相吻合， 如S z e k e ly 等f u r l 在体外研究中发现, E B V编码的 E B N A - 5可以和P 5 3 蛋白及 R b 蛋 白相结合， 从而造成这些肿瘤抑制蛋 白 功能减低。本研究还发现右 E B V a G C中， P 2 1 ( +) 率高于 E B V n G C组， 说明旧E B V a G C 组织中P 2 1 蛋白功能的受损小 于 E B V n G C组， 这可能是由于 E B V a G C中 P 5 3蛋白功能虽受损但仍能发挥上调 P 2 1 蛋白的作用， 也可能是 P 5 3非依赖机制的效果。 本研究明确了 E B V a G C有独特的癌变分子机 制， 其 P 5 3基因的功能虽受损， 但很可能不是因为 P 5 3 基因突变的结果而是由于E B V编码产物与P 5 3 蛋白结合造成的。而其下游基因同P 2 的功能强于 E B V n G C组， 也说明 P 5 3 -P 2 1 这一重要的信号传导 通路在 E B V a G C中至少部分地发挥着正常功能， 似 乎可解释为什么E B V a G C有较好的临床预后。 参考文献 1 R o iz m e n B . H a r p - ic i d a e - a b ri e f in t ro d e e ti n n . In : F ie ld , B N , K i n p e D M , e i n o m a . A m J P a th o 1 , 1 9 9 2 , 1 4 0 : 7 6 9 - 7 7 4 8 O l t G K ir c h n e ' TM :, B a r - H e r m s fin k 月 K . M o n n cl o wl E p tc in - B a rn v im s g e a n n in I m t la c k 叮E B V - r e la t e d p ro t e in e x p re ss io n in d il lc r e n l ly p n ( g a s t ri c c a rc im o m. H i st o p a t h n ln g y , 1 9 9 4 , 3 5 : 3 2 3 -3 2 9 9 L o v in e P H , S lm m n e n o a u n G , L e n n e t te E T , e t a l . E le v a te d a n tib o d y t ite r s to E p s te in -B a rn v i ru s p r io r to t h e d ia g n u e is m E ps ts i n - B -ir a s - a s s o c ia t e d g a s t ric a d s. a n - m o m . . l n t J C . . - 1 9 9 5 , 6 0 : 6 4 2 - 6 4 4 1 0 梁华 ， 罗兵 ， 王 云， 等胃癌和 相应庙旁组 织 中 E B病毒感 染的检 测青岛大学 医学院学 报, 2 0 0 3 , 3 9 :4 2 8 -4 3 0 I I 祝 峙 ， 朱 明华P 5 3 基 因网 络 的研 究进 展癌 症 , 2 0 0 3 , 2 2 : 5 4 7 - 5 51 12 Z c a g Y X , E i -0c ir y W S . R e g a l m io n a ( P 2 1 w “ “'叫 e x p r e s a ia u b y P 5 3 - in d e p e n d e n t p at h w a y. O n c o g s - 1 9 9 6 , 1 2 : 1 5 5 7 - 1 5 6 4 1 3 C a y ro l C K m h le h le r M, D u c o n a n - n B . p 2 1 b i n d in g to P C N A c a u s e s G I a n d G 2 211 c yc le - a l in P 5 3 - d e f s in e m c e l ls . O - g e n e , 1 9 9 8 , 16 : 3 1 1 - 3 2 0 1 4 T o e h iro 0 , Y o s h i h i k o M , A L . K ， e t a l . C o m b i n e d e v a l u a t io n o f e x p r s s io n s o f P 5 3 m id P 2 1 p ro te in s a s p m g n o s it c ( a t ta rs f a r p a tie n ts w i th g a s tr ic e u m io o n u . O n o o l o g y , 2 0 0 2 , 6 3 : 3 5 3 - 3 6 1 1 5 ) t a n S e e k , A Z u r B a u s e n , E K le i n K ra n c n b a rg , e t l . E B V - P os i tiv e g a s tr ic a d e n o c a rc in o . : a d is tin c t c b m e o p a th , lo g n : s .a ity w i th a lo w Fn x p ,e o c y o f 如n 户 n u d e in v o l v e m e n t . J C B n O n c o l , 2 0 0 4 , 2 2 :6 6 4 - 6 7 0 1 6 B a st i- P , V a n R - , E n , C a s p tm s , e t a l . D iff c ro n t p e m e rn o f a ll e li c 1 - i n e p a tc i n - b e r r v im s - p o s iti v e g a s tr ic - - w it h e m p h a s is o n t lrc P 5 3 t u m o r s n p p - or 1v th w a y . A m J P a th , I , 2 0 0 2 , 1 6 1 : 1 2 0 7 - 1 2 13 1 7 Se k e ly L , S e li v a n o v a G M a g n u s s o n K P ,e t a t . E B N A - 5 , a n E p ste in - B u rr v ,n - m m ls xl - le a r a n tig e n , b in d s m th e re 6 n a b l a s to to e a n d P 5 3 p ro te i n s - P ro c N a il A o a d S e t U S A , 1 9 9 3 . 9 0 ! 5 4 5 5 -5 4 5 9 ( 收稿 Id 期 2 0 0 -5 - 1 1 - 1 1 )