KTP激光心肌打孔联合血管内皮生长因子转染对犬心功能的影响.pdf

中华急诊医学杂志2 0 0 5 年8 月第 1 4 卷第 8 期 C h i n J E m e r g M e d , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l . 1 4 , N o . 8 6 4 3 · 基 础 研 究 · K T P 激光心肌打孔联合血管内皮生长因子 转染对犬心功能的影响 张家明杨光敏王祥曾秋棠朱向明卢晓芳朱长虹李正佳曹林生 摘要】目的探讨在 K T P 激光心肌打孔 ( T M L R )基础上联合血管内皮生长因子 ( V E G F )基因转染 治疗对急性心肌梗死犬心功能的影响。方法家犬 1 8 只，随机均分为单纯心肌梗死组 ( S M I 组) 、T M L R组 和T M L R 十 转 V E G F 基因组 ( T M L R + V E G F 组) 。结扎左前降支中段造成急性心肌梗死， T M L R组在梗死区以 K T ? 激光行T M L R , T M L R + V E G F 组在，T M L R 后于孔道边缘心肌内注射P A d T r a c k / V E G F ,6 5 裸质粒2 m g 。术后8 周，应用M型、二维及多普勒组织成像 ( D T I )技术检测左室局部和整体功能。结果反映左心室整体 收缩功能的指标，在 S M I 组、T M L R组和T M L R十 V E G F 组依次增大 ( P 0 . 0 5 ) .结论K T P 激光心肌打孔联合V E G F , 基因治疗，能增强 K T P 激光心肌打孔血运重建的疗效， 进一步改善梗死心肌局部功能和整体收缩功能，但对整体舒张功能无明显影响。 关键词I激光心肌打孔;血管内皮生长因子; 急性心肌梗死;心脏功能 E ff e c t s o f t r a n s m y o c a r d i a l K T P l a s e r r e v a s c u l a r i z a t i o n c o m b i n e d w i t h v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) L i n d o g s C h a n g h o n g g e n e t h e r a p y o n c a r d i a c f u n c t i oZ H A N G J i a m i n gY A N G G u a n g m i n ，W A N G X i a n g ，Z E N G Q i u t a n g X i a n g m i n g ，L U X i a o f a n g ，Z H U，L I Z h e n g J i a ，C A O L i n s h e n g .I n s t i t u t e o f H o s p i t a l ，T o n g j i M e d ic a l C o l l e g e ，H u a z h o n g U n i v e r s it y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ，W u h a n C a r d i o v a s c u l a r Di s e a s e 4 3 0 0 2 2 , C h i n a 2 刀U 之 I n i o n ( A b s t r a c t O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e f f e c t s o f t r a n s m y o c a r d i a l l a s e r r e v a s c u l a r i z a ti o n( T M L R ) w it h V E G F g e n e t h e r a p y o n c a r d i a c f u n c t i o n . Me t h o d s E i g h t e e n d o g s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o 3 g r o u p s : s i m p l e m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n - g r o u p ( S M I ) ， T M L R g r o u p a n d T M L R w i t h V E G F g e n e g r o u p ( T M L R + V E G F ) . A c u te m y o c a r d ia l i n f a r c t i o n m o d e l w a s e s t a b l i s h e d . T M L R w a s p e r f o r m e d o n i n f a r c t m y o c a r d i u m i n b o t h T M L R a n d T M L R+ V E G F g r o u p , t h e P A d T r a c k / V E G F , e s e x p r e s s i o n p l a s m i d ( 2 m g ) w a s i n j e c t e d i n t h e v i c i n i t y o f t h e m y o c a r d i a l h o l e m a d e b y K T ? l a s e r i n T M L R + V E G F g r o u p . N o t r e a t m e n t w a s g i v e n i n S M I g r o u p . T h e c a r d i a c r e g i o n a l a n d g l o b a l f u n c t i o n w e r e a s s e s s e d b y e c h o c a r d i o g r a p h y a f t e r e i g h t w e e k s o f tr e a t m e n t . R e s u lt s ( ! ) T h e c a r d ia c g l o b a l s y s t o l ic f u n c t i o n i n c r e a s e d i n S M I , T M L R a n d T M L R+ V E G F g r o u p s ; t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e re n c e b e t w e e n T M L R+ V E G F a n d T M L R g r o u p s a n d b e t w e e n T M L R+ V E G F a n d S M I g r o u p s ( P 0 . 0 5 ) .3T b e r e g io n a l s y s to l i c f u n c t io n i n c re a s e d , a n d n o s ig n if ic a n t d if f e r e n c e w a s o b s e r v e d a m o n g t h r e e g r o u p s( P 0 . 0 5 ) .C o n c l u s i o n T M L R c o m b i n e d w i t h t r a n s f e c t i o n o f V E G F , g e n e m i g h t i m p ro v e b o t h c a r d i a c r e g i o n a l a n d g l o b a l s y s t o l i c f u n c t i o n b u t d i d n o t i m p ro v e g l o b a l d i a s t o l i c f u n c t i o n , a n d i t w a s m o r e e f f e c t i v e t h a n T M L R a l o n e i n t h e t r e a t m e n t o f a c u t e m y o c a r d i a l i s c h e m i a . ( K e y w o r d s T r a n s m y o c a r d i a l l a s e r r e v a s c u l a r iz a t io n ; V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c to r ; M y o c a r d ia l in f a r c t io n ; C a r d i a c f u n c t i o n 激光心肌血运重建术通过促进血管生长因子的 表达和血管再生而改善血流灌流 ， 在一定程度上 可以缓解心绞痛症状、提高生活质量，成为近年来 基金项目:华中科技大学激光技术国家重点实验室资助项目 ( 2 0 0 0 1 7 ) 作者单位: 4 3 0 0 2 2 湖北省武汉，华中科技大学同济医学院协 和医院心内科 心血管病研究所 ( 张家明、杨光敏、王祥、曾秋棠、 曹林生) ， 超声影像科 ( 朱向明、卢晓芳) ;华中科技大学激光技术 与工程研究所 ( 朱长虹、李正佳) 治疗晚期缺血性心脏病的辅助方法，但对于改善缺 血心肌的功能仍有争议2 1 ， 疗效十分有限。研究表 明，给予外源性血管内皮生长因子 ( V E G F )治疗， 具有良好的促进缺血心肌血管再生、改善侧支循环 及心脏功能的效果 3 '0 1 , V E G F等生长因子在血运 重建中的价值日益受到重视。本研究采用犬急性心 肌梗死模型，在K T P 激光心肌打孔的基础上 s 结 合外源性V E G F ,6 5 基因转染， 探讨二者联合治疗对 左室局部和整体功能的影响。 中华急诊医学杂志2 0 0 5 年8 月第 1 4 卷第 8 期 C h i n J E m e r g M e d , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l . 1 4 , N o . 8 1 材料和方法 1 . 1 动物实验 1 . 1 . 1 重组质粒P A d T r a c k / V E G F ,e s 的制备培养含 有P A d T r a c k / V E G F ,6 ， 重组质粒 ( 广东省人民医院心 血管病研究所惠赠)的 H B , o ， 大肠杆菌，用碱变性 法破碎细菌，从中提取质粒，并用 L i d纯化法纯 化，最后以紫外分光光度计定量，测定所提取质粒 在 O D 2 6 0的吸光度值判断提取量。无水乙醇沉淀 质粒，1 2 0 0 r / m i n 离心， 7 0 %的乙醇洗一次，去除 乙醇后用无菌生理盐水溶解至浓度为2 . 5 ju g - 川 一 ， 一 2 0 保存备用。 1 . 1 . 2 动物模型的制作及 V E G F基因转染将 1 8 只家犬 ( 华中科技大学同济医学院协和医院动物实 验室提供)随机分为单纯心肌梗死组 ( S M I 组，n = 6 ) 、T M L R组 ( T M L R组，n二6 )和 T M L R+转 V E G F 基因组 ( T M L R + V E G F组，n = 6 ) 。犬急性 心肌梗死模型的建立和T M R L同文献 5 。静脉复 合麻醉后，气管插管，接呼吸机，心电监护。经左 胸第四肋间开胸，切开心包并悬吊，缝扎法结扎前 降支中段，制作急性心肌梗死模型。S M I 组直接关 胸;M L R + V E G F 组，结扎左前降支3 0 m i n 后在梗 死区行 T M R L ( K T P倍频 N D : Y A G激光，同文献 5 ) ，每次触发时间 1 0 0 m s ，孔道成功的标志是可 见鲜血涌出，出血用干纱布压迫止血，每个动物打 孔3 一 4 行，每行 3 一 4 孔，共 1 0 一1 2 个，孔间距 1 c m ，打孔完毕后在孔道边缘约 5 m m处注射质粒 2 0 0 0 1c g ， 浓度为2 . 5 ju t ， 体积8 0 0 p l ; T M L R组除 在孔道边缘约 5 m m处注射等体积的生理盐水代替 质粒外， 其余与T M L R + V E G F 组相同。 1 . 2 左室功能的检测 术后 8 周，在非麻醉状态下进行左室功能检 测。使用二维彩色多普勒超声诊断仪 ( 美国A c u s o n 公司产)S i m p s o n双平面法计算左室射血分数 ( E F ) 、搏出量 ( S V )和心输出量 ( C O ) 、计算室壁 运动指数 ( WM S I ) ，代表左室整体收缩功能。 W M S I 按 1 6 节段4 级记分法算，即每节段运动计分 之和与总节段数之比。评分标准:1 分 一正常，2 分 一 运动减弱，3 分 一 运动消失，4 分 一 反常运动。 分析左室短轴缩短率、乳头肌水平左室前间壁与前 壁的局部增厚率 ( T , %和T A %)和前壁运动幅度 ( M A ) 。测量二尖瓣口舒张早期和舒张晚期血流速 度 ( V e , V a )及其比值 ( E / A ) ，以评价动物左室 舒张功能。记录左室前壁心肌 ( L V A W)和二尖瓣 前、后瓣环 ( M V A C , M V P C )的运动频谱，测量心 肌前壁及瓣环的运动速度参数 ( s , e , a 及 e / a比 值) ，其中s 峰、e 峰和 a 峰分别为心肌收缩运动速 度、舒张早期运动速度和舒张晚期运动速度。检测 图像用磁带录像贮存，供嗣后分析。由不明动物分 组的2 名超声科医生测量相关数据，每个数据测量 3 次， 取其平均值。 ， . 3 统计学处理 采用S P S S 1 0 . 0 软件包进行数据处理， 所有数 据均以 ( x 1s )表示，多组均数间比较用 F检验， 若差异有显著意义， 则采用 4 检验进行两两比较， 以P 0 . 0 5 为差异有显著性。 2 结果 冠状动脉左前降支中段结扎后，其血管支配区 的心肌颜色立即变暗，同时梗死区心肌收缩运动幅 度减低。T M L R心肌打孔后，可见左心室内氧合血 经孔道涌出，孔道区心肌颜色和运动幅度与单纯梗 死组肉眼观无明显差异。术后 8 周，3 组各有 5只 犬完成实验。3 组动物左心室整体功能及梗死局部 功能的比较见表 1 至表3 0 表 1 3 组动物左心室整体收缩功能的比较 ( n = 5 , x 1s ) T a b le 1 C o m p a ri s o n o f g l o b a l s y s t o l i c f u n c t i o n a m o n g S M I g r o u p , T M L R g r o u p a n d T M L R+ V E G F g r o u p( n 二 5 ，x 1s ) E F S V C O F S WM S I ( %)( d)( Um i n )( %)( %) 湘组荀 .7 6 士 7 . 1 8 1 1. 2 3 士 1 .4 7 1 .3 8 士 。 . 价2 9 .8 6 士 2 . 1 2 1 3 8 .8 6 士 12 .2 4 T M IR 组5 1 .3 4 士 4 .3 0 1 2 .0 6 1 1 .8 0 1 .5 7 土 。 .刀3 2 .4 2 土 2 .7 6 1 2 5 .3 5 士 8 .4 7 苍 伽丑 十 V E G F 组纵 欲 士 5 .乃 # 16 .3 6 士 2 .2 8 “ * 1 .% 士 。 .邓 # 旅 朽 土 2 .5 2 “ * 10 3 .4 4 土 3 .36 “ 注:与S M I 组比较， P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 ;与T M L R组 比较， P 0 . 0 5 , * P 0 . 0 1 表2 3 组动物左心室整体舒张功能的比较 ( n 二 5 , 万 士 ) T a b le 2 C o m p a r i s o n o f g l o b a l d i a s t o l i c f u n c t i o n a m o n g S M I g r o u p , T M L R g r o u p a n d T M L R+ V E G F g r o u p( n = 5 ，x ts ) T D I / C D ( m / s )S MI 组T ML R组T ML R+V E G F组 MVAC S Ve Va E / A MVP S S Ve Va E/A 0. 1 5 6 1 0. 0 0 8 0. 1 2 6士0. 0 0 5 0. 1 2 1土0. 0 21 1 . 0 4 1士0. 1 5 4 0. 1 6 5土0 . 0 1 7 0. 1 3 7士0. 0 1 4 0 . 1 2 6土0 . 0 1 8 1 . 0 8 7 1 0. 0 4 3 0. 1 7 0土0. 0 1 4 0. 1 3 8士0. 0 0 9 0. 1 1 7士0. 0 2 9 1 . 1 7 9士0. 1 6 5 0. 1 4 0 1 0. 0 2 7 0. 1 2 4士0. 0 0 7 0. 1 2 6 1 0. 0 2 5 0. 9 8 3 1 0. 0 8 3 0. 1 5 2 1 0. 0 1 8 0. 1 2 9 10. 0 1 4 0. 1 1 8 1 0. 0 1 6 1. 0 2 8土0. 0 3 1 0. 1 6 3士0. 0 1 1 0. 1 3 7士0. 0 2 4 0. 1 1 3 1 0. 0 1 5 1. 2 5 2士0. 0 5 2 中华急诊医学杂志2 0 0 5 年8 月第 1 4 卷第 8 期 C h i n J E m e r g M e d , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l . 1 4 , N o . 8 6 4 5 表3 三组动物左心室局部心功能的比较 ( n 二 5 , x 1s ) T a b le 3 C o m p a r i s o n o f r e g i o n a l f u n c t i o n a m o n g S M I g r o u p , T M L R g r o u p a n d T M L R+ V E G F g r o u p( n = 5 ，x 1s ) L VAW 组别o T , %o T A % M A ( e m ) s ( m / s ) e ( m / s ) a ( m / s ) S M I 组 T ML R组 T ML R+V E G F组 4 1 . 3 5士2. 0 9 4 6. 9 3士3. 5 7 5 5 . 4 3 4士4 . 4 7 ' 4 3 . 3 5 1 3. 41 4 8 . 5 8士7. 7 3 5 6 . 0 7士8 . 1 4 8 “ 0. 2 8 1 0. 0 9 0 . 4 0 1 0 . 0 5 a 0 . 6 0 士 0 . 0 9 a * 0. 0 9 4士0. 0 1 8 0. 0 7 7 1 0. 0 2 5 0. 1 1 410. 0 3 1 0. 0 8 810. 01 5 0 . 1 4 9 1 0 . 0 2 1 a 0 0 . 0 9 4士 0 . 0 1 8 0. 0 7 4 = 0. 01 3 0. 0 7 9士0. 0 0 8 0. 0 6 7 4 1 0. 01 1 0. 9 6 5 4 10. 1 6 8 卜1 5 3士0. 1 2 2“ 1 . 4 6 5 1 0 . 1 6 2 注:与S M I 比较， P 0 . 0 5 , ' P 0 . 0 1 ;与T M L R组比较， 0 P 0 . 0 5 , * P 0 . 0 1 3 讨论 T M L R 在心肌壁上造成与心室腔相通的孔道， 通过非特异性炎症反应诱导缺血心肌生长因子的表 达并促进血管再生 而改善缺血心肌的血流灌流， 但对心功能的影响报道不一致 z 。采用K T P 激光 打孔血运重建的初步研究表明，对梗死局部心肌功 能有改善作用，但对心脏整体收缩和舒张功能无明 显作用 。 本研究探讨在K T P 激光T M L R 治疗基础 上， 结合 V E G F基因转染探讨是否能进一步改善 T M L R治疗缺血心肌的心功能。 本研 究 采 用 转 染 效 力 高、副 作 用 小 的 P A d T r a c k / V E G Fs 穿梭裸质粒6 1 ， 利用彩色多普勒 超声心动图和 D T I 技术以定量分析左室整体和局部 功能，结果显示，T M L R和T M L R + V E G F , ， 治疗8 周后，两组反映左室局部功能的指标和反映左室整 体收缩功能的指标均较单纯心肌梗死组改善，这与 H e i l m a n n 等7 在猪的心肌缺血模型上应用V E G F ,z , 和 T M L R联合治疗的实验结果一致，并且 T M L R与 转染V E G F ,6s 基因联合治疗比单纯应用 T M L R改善 左室功能的作用更显著，提示在 T M L R治疗的基础 上联合V E G F 基因治疗，能进一步改善缺血心肌的 心功能，疗效优于单纯 T M L R治疗。 本实验还观察到，在 S M I , T M L R和 T M L R十 V E G F 3 组中，二尖瓣口血流彩色多普勒频谱 E / A 比 值及二尖瓣环D T I 的运动参数有逐渐增大趋势， 但3 组间差异无显著性，提示两者联合治疗对急性 心肌梗死犬的左室舒张功能影响不显著。这可能与 本研究的实验动物数较少、血管再生治疗并没有彻 底消除心肌缺血等有关。 V E G F 是一种高度特异的血管内皮细胞促分裂 因子，具有强烈的促血管内皮细胞增值作用，是体 内血管再生必需的因子和重要的调控物质。近年 来，使用生长因子促进血管再生的治疗方法受到重 视，给予外源性 V E G F 基因治疗能较长时间持续表 达V E G F ，有效促进缺血心肌的血管再生，增加血 管密度，恢复血管内皮结构和功能，改善侧支血 流， 缓解心绞痛症状和改善心功能 3 ,4 。本研究的 初步结果显示，V E G F 基因转染能增强 K T P激光心 肌打孔血运重建的疗效，进一步改善急性心肌梗死 左室整体收缩功能和局部功能，其机制可能与 V E G F 促进血管再生及侧枝循环形成 s 、增加缺血 心肌的血流灌流 有关。 参 考 文 献 F u c h s S , B a f f o u r R , V o d o v o t z Y , e t a . L a s e r m y o c a r d i a l r e v a s c u l a r i z a t i o n m o d u l a t e s e x p r e s s i o n o f a n g i o g e n i c , n e u ro n a l , a n d i n fl a m m a t o ry c y t o k i n e s i n a p o r c i n e m o d e l o f c h r o n i c m y o c a r d i a l i s c h e n u a . J C a r d S u r g , 2 0 0 2 , 1 7 ( 5 ) : 4 1 3 - 4 2 4 . S a r i r i a n M, E i s e n b e r g M J . M y o c a r d i a l l a s e r r e v a s c u l a r i z a t i o n f o r t h e t r e a t m e n t o f e n d - s t a g e c o r o n a ry a rt e ry d i s e a s e . J A m C o l l C a r d i o l , 2 0 0 3 , 4 1 ( 2 ) :1 7 3 - 1 8 3 . C r o t t o g i n i A , M e c k e rt P C , V e r a J a n a v e l G , e t a l . A rt e r i o g e n e s i s i n d u c e d b y i n t r a m y o c a r d i a l v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r 1 6 5 g e n e t r a n s f e r i n c h ro n i c a l l y i s c h e m i c p i g s . H u m G e n e T h e r , 2 0 0 3 , 1 4 ( 1 4 ) :1 3 0 7 - 1 3 1 8 . H e i l m a n n C A , A t t m a n n T , T h i e m A , e t a l . G e n e t h e r a p y i n c a r d i a c s u r g e ry : i n t r a m y o c a r d i a l i n j e c t i o n o f n a k e d p l a s m i d D N A f o r c h ro n i c m y o c a r d i a l i s c h e m i a . E u r J C a r d i o t h o r a c S u r g , 2 0 0 3 , 2 4 ( 5 ) : 7 8 5 - 7 9 3 . 王祥，蒋桔泉，曾秋棠，等. K T P 激光血运重建术对急性心肌梗死 犬左室功能的影响. 中华急诊医学杂志， 2 0 0 3 , 1 2 ( 4 ) : 2 3 5 - 2 3 7 . Wa n g X , J i a n g J Q , Z e n g Q T , e t a l . E ff e c t s o f t r a n s m y c a r d i a l r e v a s c u l a r i z a t i o n w i t h K T P l a s e r o n c a r d i a c f u n c t i o n i n c a me a c u t e i n f r a c t e d m y o c a r d i u m . C h i n J E m e r g M e d , 2 0 0 3 , 1 2 ( 4 ) : 2 3 5 - 2 3 7 . H e T C , Z h o u S , d a C o s t a L T , e t a l . A s i m p l i f i e d s y s t e m f o r g e n e r a t i n g r e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s e s . P r o c N a t l A c a d S c i , 1 9 9 8 , 9 5 ( 5 ) :2 5 0 9 - 2 5 1 4 . H e i l m a n n C A , A t t m a n n T , v o n S a m s o n P , e t a l . T r a n s m y o c a r d i a l l a s e r r e v a s c u l a r i z a t i o n c o m b i n e d w i t h v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r 1 2 1( V E G F 1 2 1 )g e n e th e r a p y f o r c h r o n i c m y o c a r d i a l i s c h e m i a - d o t h e e ff e c t s re a l ly a d d u p ? E u r J C a r d i o t h o r a c S u r g , 2 0 0 3 , 2 3( 1 ) : 7 4 - 8 0 . N i k o l S , E n g e l m a n n M G , P e l i s e k J , e t a l .L Kc a l p e r i v a s c u l a r a p p l i c a t i o n o f l o w a m o u n t s o f a p l a s m i d e n c o d i n g f o r v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r( V E G F 1 6 5 )i s e ffi c i e n t f o r t h e r a p e u ti c a n g io g e n e s i s i n p i g s . A c t a P h y s i o l S c a n d , 2 0 0 2 , 1 7 6 ( 2 ) :1 5 1 - 1 5 9 . ( 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 6 - 0 2 ) ( 本 文 编 辑 : 沈 惠 云 )