NRF2KEAP1抗氧化系统研究进展.pdf

*基金项目：国家自然科学基金 （30270348） 作者单位：第三军医大学劳动卫生学教研室， 重庆 400038 作者简介：钟敏 （1964 - ） ， 女， 广东新会人， 教授， 博士， 主要从事电 磁辐射生物效应与防护研究。 文章编号：1001-0580 （2006） 03-0360-03中图分类号：R 394 文献标识码：A 【综述】 Nrf2 - Keap1 抗氧化系统研究进展* 钟敏 Nrf2 （NF - E2 - related factor2） 是细胞调节抗氧化应激反 应的重 要 转 录 因 子， 生 理 状 态 下 它 与 胞 浆 蛋 白 伴 侣 分 子 Keap1 （Kelch - like ECHassociated protein1） 结合使活性处于相 对抑制状态。氧化应激源作用下， Nrf2 与 Keap1 解偶连后转 移入核， 与抗氧化反应元件 ARE （antioxidant response element） 上 GCTGAGTCA 位点结合， 启动 ARE 调控的第 II 相解毒酶及 抗氧化酶基因表达， 增加细胞对氧化应激的抗性。Nrf2 缺失 或激活障碍， 可加重氧化应激源的细胞毒性， 导致细胞功能障 碍、 凋亡甚至死亡。本文对 Nrf2 - Keap 1 解偶连机制和 Nrf2 功能的最新研究进展做一综述。 1Nrf2、 Keap 1 基本结构和功能 1.1Nrf2 基本结构和功能Nrf2/ ECH （NF - E2 - related fac- tor2 或 Chicken erythroid - derived CNC - homology factor） 属 于 CNC （cap - n - collar） 转录因子家族成员。Nrf2 含有 6 个不 同的功能区， 分别被命名为 Nehl 到 Neh6 （Nrf2 - ECH homolo- gy） 1。Nehl 区中有一个亮氨酸拉练结构 bZIP leucime zipper （bZIP） ， bZIP 与 小 Maf 蛋 白 （small Maf proteins， 包 括 MafG、 MafK、 MafF） 形成异二聚体是 Nrf2 识别抗氧化反应元件 ARE （antioxidant response element） 上 DNA 基序 （GCTGAGTCA） 并与之 结合、 启动目标基因转录的重要前提。Neh2 区是 Nrf2 与胞浆 蛋白 Keap1 结合区， Neh2 上的 ETGE 基序在这一过程中有重 要作用， ETGE 缺失或突变会解除 Nrf2 - Keap1 相互作用 2。 Nehl 与 Neh2 之间为 2 个激活区 Neh4 和 Neh5。Neh4 和 Neh5 与共激活因子 CREB 结合蛋白 CBP cyclic AMP - response ele- memb； binding protein （CREB） binding protein 结合会促使 CBP 协 同参与对 Nrf2 目标基因转录活性的激活 3。 Nrf2 是包括 p45、 Nrf1、 Nrf2、 Nrf3 在内的 CNC 转录因子家 族成员中活力最强的转录调节因子， 主要在代谢性和解毒组 织中表达， 如肝脏、 肾， 还有其它持续暴露在环境中的组织如 皮肽、 肺、 消化管等。Nrf2 作为转录因子与抗氧化反应元件 ARE 作用， 调控 ARE 依赖的第 II 相解毒酶基因和抗氧化基因 的转录 活 性， 包括谷光甘肽 S 转移酶 （GSTs） ， 过氧化氢 酶 （CAT） 、 超氧化物歧化酶 （SOD） 、 血红素氧合酶 （HO1） 等。目前 认为 Nrf2 是调控细胞对抗外来异物和氧化损伤的关键转录 因子， Nrf2 缺失或激活障碍， 会引起细胞对应激源的敏感性增 高， 与化学促癌的发生、 炎症修复进程延长、 细胞调亡等病变 过程密切相关 4。 1.2Keap1 基本结构和功能该蛋白因与果蝇肌动蛋白结合 蛋白 Kelch （Drosophila actin - boinding protein Kelch） 有相似性而 得名 Keapl （Kelch - like ECH - associated protein 1） 5。它是一 个与胞浆肌动蛋白结合的含 624 个氨基酸的多肽， 包含 5 个 区。DGR 区 （double glycine repeat， DGR） 含有 6 个双甘氨酸重 复序列， 是 Keap1 与 Nrf2 的 Neh2 区结合位点， 也是 Keap1 与胞 浆内肌动蛋白结合区位 6。BTB/ POZ 区的作用是介导 Keap1 二聚体化并与 Nrf2 - Keap1 结合力有关， BTB/ POZ 区 Ser - 104 突变影响 Keap1 二聚化， 可干扰 Keap1 锚定 Nrf2 的功能 7。 Keap1 与亲电化合物及氧化剂的反应发生在插入区 IVR， 这与 IVR 区富含半胱氨酸有关。同时 IVR 区参与泛素化连接酶形 成， 所以与 Nrf2 稳定性有关。生理状态下， Nrf2 与 Keap1 偶连 并与胞浆肌动蛋白结合被锚定在胞浆， 当受到亲电试剂或氧 化剂作用， Nrf2 与 Keap1 解偶连并转移入核， 与 Maf 蛋白结合 成异二聚体后识别并与 ARE 结合， 启动第 II 相解毒酶和抗氧 化应激蛋白基因的转录， 提高细胞抗氧化应激能力。 2Nrf2 - Keap1 系统激活机制 Nrf2 - Keap 的激活机制目前虽然尚未完全阐明， 但以下 方面的机制已得到认同。 2.1Nrf2 与 Keap1 解偶连Nrf2 与 Keap1 解离是 Nrf2 完成对 目标基因转录调控的第一步， 这一过程由 Keap1 的 IVR 区感 应氧化应激源而启动。Keap1 的 IVR 区中含有 25 个半胱氨 酸， 这种富含半胱氨酸的结构使它可能作为 Nrf2Keap1 ARE 调控系统中首先对亲电剂或氧化剂起反应的传感蛋白。 用亲电试剂作为探针对巯基基团进行烷基化， 确定出 Keap1 上 IVR 区 C257， 273， 288， 297 是亲电化合物直接作用的位点。 亲电剂对一个或多个半胱氨酸巯基的修饰可能引起 Keap1 或 Keap1 的 DGR 区 （与 Nrf2 结合区） 构象改变， 进而导致与之结 合的 Nrf2 释放 8。Zhang9等进一步发现 C273 和 C288 两个 半胱氨酸位点还与 Keap1 对 Nrf2 泛素化作用有关， 关系着 Nrf2 稳定性。 除了 IVR 区上的半胱氨酸残基， Nrf2 的 Neh2 区也对亲电 试剂、 氧化剂高度敏感 10。当编码 C 端 bZip 区的外显子 V 被 LacZ 基因取代， 突变小鼠表达含 Nrf2N 端 （Neh2） 及完整- 半 乳糖苷酶的 Nrf2 - LacZ 融合蛋白。只有在用亲电试剂处理突 变小鼠时可检测到 LacZ 活 性， 提 示 N 端 尤 其 是 Neh2 区 是 Nrf2 感应氧化应激源的作用区。亲电试剂、 氧化剂对 Neh2 的 作用可影响 Nrf2 - Keap1 之间的结合， 因此 Neh2 也参与 Nrf2 与 Keap1 的解偶连。 2.2Keap1 介导的蛋白酶对 Nrf2 的降解作用减弱Nrf2 的抑 制状态除了与 Keap1 偶连， 还与 Keap1 介导的蛋白酶对 Nrf2 的降解作用有关。HepG2 细胞用蛋白酶抑制剂 lactacystin 处 理， 可检 测 到 ARE 依 赖 的 编 码谷 氨 酰 半 胱 氨 酸 合 成 酶 （GLCLC） 的 mRNA 和 Nrf2 蛋 白 水 平 上 调， 提 示 蛋 白 酶 参 与 Nrf2 稳定性和活性调节。Kobayashi 11等发现 Keap1 通过 IVR 区与 Cul3 作用并作为 E3 泛素化连接酶的适配器， 成为 E3 泛 素化连接酶复合物的一部分， 甚至它本身就是泛素化连接酶 在起作用。生理状态下， Keap1 与 Nrf2 结合并将其锚定在胞 浆， 同时作为泛素化连接酶促进 Nrf2 泛素化和在蛋白酶作用 063中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3 下降解， 使 Nrf2 处于非游离及不断降解的非活性状态。Keap1 上两个半胱氨酸位点 C273 和 C288 被认为是完成这一作用的 分子基础， 因为其中任何一个位点突变为丝氨酸， 泛素化作用 都会消除。在氧化剂或亲电试剂作用下， C273、 C288 被修饰， Keap1 构象改变， 与 Nrf2 的偶连及对 Nrf2 的泛素化作用消除 / 减弱， 因此可检测到细胞裂解液中 Nrf2 含量增加、 Nrf2 的半衰 期明显延长的激活现象。 2.3Nrf2 磷酸化磷酸化是蛋白翻译后修饰的主要机制。 氧化应激时蛋白酶对 Nrf2 降解作用减弱与 Nrf2 磷酸化有关。 磷酸酶抑制剂 okadaic 酸 （可引起细胞过度磷酸化作用） 处理 对 Nrf2 的聚集及 ARE 控制的报告基因转录活性的正向调节 作用证实了这一机制。 泛素化依赖蛋白酶作用的蛋白降解需要由 E3 泛素化连 接酶完成对靶分子 degrons 结构 （由短的特殊氨基酸序列和 / 或一个特别的构象组成） 的识别与作用过程。Nrf2 的 degron 结构是 Neh2 区的丝氨酸残基。生理状态下 Neh2 与 E3 泛素 化连接酶复合物 Keap1 结合并成为蛋白酶作用目标而处于降 解状态， 氧化应激时， degrons 区因磷酸化使构象改变， 减弱了 蛋白酶对 Nrf2 的识别， 使 Nrf2 稳定性、 含量增加， 激活其转录 活性。这种机制与 P53 稳定性的机制相似。生理状态下， P53 与 Mdm2 蛋白E3 连接酶结合， 并成为泛素化依赖的降解作 用的目标蛋白。在应对刺激信号如电离辐射或 UV 线引起的 脱氧核糖核酸损伤时， P53 在 Ser - 20 位被激活的 ATM/ ATR 酶磷酸化这可削弱 P53 与 Mdm2 的作用， 使 P53 降解减少， 稳定性增高。已明确 Nrf2 能被 PKC 家族中的众多成员磷酸 化， PKC 磷酸化作用位点在 Nrf2 的 Ser - 40 12。 2.4Nrf2 解离后机制解离后的 Nrf2 要与其它蛋白结合才 能最终完成对靶基因转录的调控。其一是 Nrf2 上两个活性 区 Neh4、 Neh5 与 CBP 结合后 CBP 对 Nrf2 转录活性起共激活 效应； 其二是 Nrf2 与 Maf 蛋白作用。Maf 是 Nrf2 形成异二聚 体的伴侣分子， Nrf2 的 Nehl 区与 Maf 蛋白 （包括 MafG、 MafK、 MafF） 结合是 Nrf2 识别、 结合 ARE 上 DNA 序列的分子基础。 因为 ARE 与 Maf 的识别元件 MARE （Maf recognition elements） 非 常相似， ARE 序列的一半与 MARE 核心序列 （TGAGTCA） 一致， 另一半是 MARE 侧翼的序列 GC， 推测 ARE 上的 GC 正是被 Maf 识别的位点 13。 3Nrf2 - Keap1 系统其他作用研究进展 内源性 Nrf2 参与炎症反应与创伤修复 14。15d - PGJ 2由 花生四烯酸在 COX - 2 （环氧合酶 - 2） 作用下经过 PGH2 （前列 腺素 H2） 合成， 15d - PGJ2可与 Keap1 形成共价加合物， 与 Nrf2 - Keap1 结合形成竞争性， 因而被认为是激话 Nrf2 的重要内 源性信号分子。角叉素 （一种炎症诱导剂） 作用后浸润的胸膜 巨噬细胞中， 无论在炎症反应前期或后期均可测到 COX - 2、 15d - PGJ2高表达， 提示炎症反应过程可能有 Nrf2 参与。实验 进一步印证到 Nrf2 缺失、 COX - 2 抑制剂处理均导致炎症过 程延迟， 而加入 15d - PGJ2会终止这种效应。Braun 的实验也 发现 15， 创伤后上皮细胞 Nrf2 有高表达， Nrf2 缺失则炎性因 子 IL - 1、 TNF持续增高， 创伤上皮修复期延长。由此作者 提出了 Nrf2 作为促进炎症恢复介质和参与创伤修复的新概 念。 Morito 研究了 Nrf2 与细胞凋亡的关系 16。在用 TNF处 理诱导细胞凋亡的模型中， Nrf2 缺失的胸腺细胞很快死亡并 且 Nrf2 缺失小鼠表现出严重的肝炎。作者认为 Nrf2 通过调 节细胞氧化平衡降低细胞对凋亡信号的敏感性， 因此， Nrf2 的 正常诱导是细胞的保护性反应。 氧化作用引起异常蛋白聚集通常被认为是神经退行性疾 病和其他氧化性细胞损伤的关键原因。Kwak 等通过微阵列 研究发现 17， 编码蛋白酶亚单位的基因是 Nrf2 - Keap1 通路 的靶基因。研究者在 D3T （一种十字花科蔬菜来源的抗氧化 剂） 处理的肝脏匀浆中检测到蛋白酶活性增加 （Nrf2 缺失小鼠 无此现象） 进一步印证了 Nrf2 参与蛋白酶亚单位基因调控的 假设。这一结果也提示， Nrf2 通过调控蛋白酶亚单位基因表 达以增加蛋白酶活性并进一步对氧化应激引起的异常蛋白进 行降解， 可以看作是细胞抵御氧化应激的另一种防御方式。 4小结 Nrf2 - Keap1 系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激 的机制中有重要地位。Nrf2 缺失和激活障碍与包括化合物致 癌、 药物性肝损伤、 炎症修复延迟、 细胞凋亡等病变过程相关。 目前认同的 Nrf2 激活机制包括 Nrf2 与 Keap1 的解偶连、 蛋白 酶对 Nrf2 的降解减弱、 Nrf2 磷酸化等。随着对 Nrf2 - Keap1 在 细胞应激保护、 损伤修复等诸多方面作用认识的深入及作用 机制的了解， Nrf2 - Keap1 将为抗肿瘤、 抗炎症治疗提供新的 思路。 参考文献 1 Moi P， Chan K， Asunis I， et al. Isolation of NF - E2 - related factor 2 （Nrf2） ， a NF - E2 - like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF - E2/ AP1 repeat of the beta-globin locus control region Proc J . Natl Acad Sci USA， 1994， 91 （21） ： 9926 - 9930. 2 McMahon M， Thomas N， ltoh K， et al.Redox-regulated turnover of Nrf2 is determined by at least two spearate protein domains， the redox-sensi- tive Neh2 degron and the redox-insensitive Neh6 degron J . Biol Chem， 2004， 279 （30） ： 31556 - 31567. 3 Katoh Y， ltoh K， Yoshida E， et al. Two domains of Nrf2 cooperatively bind CBP， a CREB binding protein， and synergistically activate tran- sription J .Genes Cells， 2001； 6 （10） ： 857 - 868. 4 Kobayashi A， Ohta T， Yamamoto M， Unique function of the Nrf2-keap1 pathway in the inducible expression of antioxidant and detoxifying en- zynmes J .Methods Enzymol， 2004， 378： 273 - 286. 5 Kobayashi M， ltoh K， Suzuki T， et al.ldentification of the interactive in- terface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system J . Genes Cells， 2002， 7 （8） ： 807 - 820. 6 kang Ml， Kobayashi A， Wakabayashi N， et al. Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes J . Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101 （7） ： 2046 - 2051. 7 Zipper LM， Mulcahy RT.The Keap1 BTB/ POZ dimerization function is required to sequester Nrf2 in cytoplasm J . Biol Chem， 2002， 277 （39） ： 36544 - 36552. 8 Dinkova Kostova AT， Holtzclaw WD， Cole RN， et al. Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensors regulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens and oxidants J .Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99 （18） ： 11908 - 11913. 9 Zhang DD， Hannink M， Distinct cysteine residues in Keap1 are re- quired for Keap1-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress J .Mol Cell Bi- ol， 2003， 23 （22） ： 8137 - 5151. 10 Ltoh K， Wakabayashi N， Katoh Y， et al. keap1 regulates both cytoplas- mic-nuclear shuttling and degradation of Nrf2 in response to elec- trophiles J .Genes Cells， 2003， 8 （4） ： 379 - 391. 11 Kobayashi A， Okawa Ml， Okawa H， et al.Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3-based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2 J .Mol Cell Biol， 2004， 24 （16） ： 7130 - 7139. 12 Huang HC， Nguyen T， Pickett CB.Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by 163中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3 protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated tran- scription J .Biol Chem， 2002， 277 （45） ： 42769 - 42774. 13 Motohashi H， O Connor T， Katsuoka F， et al. Integration and diversity of the regulatory network composed of Maf and CNC families of tran- scription factors J .Gene ， 2002， 294 （1 - 2） ： 1 - 12. 14 Ltoh K， Mochizki M， Lshii Y， et al. Transcription factor Nrf2 regulates inflammation by mediating the effect of 15 - deoxy -12， 14 - prostaglandin J2 J .Mol Cell Biol， 2004， 24 （1） ： 36 - 45. 15 Braun S， Hanselmann C， Gassmann MG， et al.Nrf2 transcription factor， a novel target of keratinocyte growth factor action which regulated gene expression and inflammation in the healing skin wound J . Mol Cell Biol， 2002， 22 （15） ： 5492 - 5505. 16 Morito N， Yoh K， Ltoh K， et al. Nrf2 regulates the sensitivity of death receptor signals by affecting intracellular glutathione levels J . Onco- gene， 2003， 22 （58） ： 9275 - 9281. 17 Kwak MK， Wakabayashi N， Greenlaw JL， et al. Antioxidants enhance mammalian proteasome expression through the Keap1-Nrf2 signaling pathway J .Mol Cell Biol， 2003， 23 （23） ： 8786 - 8794. 收稿日期：2005-06-21 （宋艳萍编校） 作者单位：1.沈阳市皇姑区疾病预防控制中心， 110033；2. 沈阳市 和平区疾病预防控制中心；3. 沈阳市铁西区疾病预防 控制中心；4.沈阳市大东区疾病预防控制中心；5. 沈阳 市疾病预防控制中心 作者简介：王苏燕 （1955 - ） ， 女， 北京顺义人， 主管医师， 大专， 主要 从事计划免疫和传染病监测、 控制工作。 文章编号：1001-0580 （2006） 03-0362-01中图分类号：R 186 + .3文献标识码：B 【调查研究与分析】 831 名儿童乙型肝炎疫苗免疫接种效果分析 王苏燕1， 马焱霞1， 徐春娟1， 刘晓丹2， 吕楠3， 陈天关4， 周秀萍5， 朱丽君5 为了解沈阳城区乙型肝炎 （HB） 疫苗接种率水平及疫苗 接种后免疫效果， 2004 年， 我们对城区 831 名儿童乙肝疫苗接 种情况进行了免疫效果监测。结果报告如下。 对象与方法 （1） 对象在沈阳市和平、 皇姑、 铁西、 大东 4 个区 66 个接种门诊， 监测 9 个月 10 岁的儿童， 按 9 12 个 月龄， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 10 岁， 共分 10 个组， 每组随机抽取 50 名以上儿童， 共计 831 名。 （2） 监测方法： 2004 年 6 9 月采 用统一标准， 查看儿童预防接种证记录， 调查每个儿童的接触 史、 家族 史 等， 填 写 人 群 免 疫 监 测 情 况 一 览 表。同 时 采 血 4ml， 分离血清后 - 20 的冰箱内保存， 由沈阳市疾病预防控 制中心统一检测。 （3） 检测方法及标准： 采用酶联免疫吸咐试 验 （ELISA） 检测 HBsAg 和抗 - HBs， 乙肝病毒核心抗体 （抗 - HBc） ， 抗 - HBe， 试剂均购自珠海丽珠试剂有限公司， S 国药准 字 10910152。HBsAg 抗 - HBs 以 S/ N2.1 为阳性。抗 - HBc 以抑制率50%为阳性。HBsAg S/ N10 判为阳性。 结果 （1） 乙肝疫苗接种情况： 831 名儿童接种乙肝疫 苗基础免疫、 全程接种率为 99.0%， 首针及时接种率 98.1%， 全程及时接种率 94.6%； 未及时接种率 5.4%； 其中因病占未 接种人数 55.6%， 早产等占未接种人数的 44.6%。男性儿童 337 名， 女性儿童 494 名， 男性儿童全程接种率、 首先针及时接 种率、 全程及时接种率分别为 99.1%， 99.4%， 97.6%， 女性儿 童分别为 99.0%， 97.2%， 95.5%。4 10 岁儿童加强免疫乙 肝疫苗接种率为 39.8%， 其中加强 3 针次接种人数占 44.0%， 加强 1 针次接种人数占 56.0%， 接种率最高 8 岁组为 55.7%， 最低 7 岁组为 20.7%， 8 岁与 7 岁加强接种率差异有统计学意 义 （x 2 = 18.6， P 0.05） 。 （2） 乙肝疫苗接种后抗体水平监测 情况： 见表 1。 9 12 月龄与 1， 2， 3 岁组抗 - HBs 阳性率差异有统计学 意义 （x 2 = 6.13， 20.5， 22.38， P 均 0.05） 。 （3） HBV 感染情况： 831 名 儿 童 中， HBsAg 阳 性 率 为 1.08%； HBeAg 阳 性 率 为 0.72%； 抗 - HBc 阳 性 率 为 19.86%， HBV 总 感 染 阳 性 率 为 19.86%； HBV 感染家族史占总乙型肝炎病毒 （HBV） 感染人数 的 55.22%。 表 1 831 名儿童接种乙肝疫苗抗 - HBs 年龄别阳性率 年龄 （岁）监测人数 所有抗 - HBs （ + ） 人数% 抗 - HBs （ + ） 抗 - HBc （ - ） 与 HBsAg 人数% 9 12 月龄 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 合计 534177.43973.6 865361.64350.0 834048.22833.7 893842.72933.6 1045552.95149.0 894752.83236.0 745371.63952.7 874248.32124.1 795367.14557.0 874147.13439.1 83146355.7236143.44 讨论本次调查 9 个月 3 岁儿童基础免疫阳性率在 33.6% 73.6%， 较国内文献报告低 1。831 名儿童接种乙肝 疫苗无应答和低应答者占 22.62%， 这部分儿童可能与低水平 HBV 感染、 疫苗免疫原性、 儿童个体差异、 监测时检测试剂质 量、 方法可靠性有关。831 名儿童 HBsAg 携带率为 1.08%， 接 近卫生部规定的3 岁儿童 HBsAg 携带率城市 1%、 农村 3%的 目 标， 说 明 我 市 城 区 首 针 乙 肝 疫 苗 及 时 接 种 率 在 98.1%。通过家庭生活密切接触被感染儿童占总感染人数的 55.22%， 有明显的家庭聚集现象， 这部分儿童在全程接种后 1 2 岁期间加强免疫可有效避免初免失败及提高免疫抗体的 平均滴度。 参考文献 1 颜天强， 王继杰.新生儿乙型肝炎疫苗免疫接种对儿童乙型肝炎病 毒感染流行率的影响 J .中国计划免疫杂志， 2002， 8 （2） ： 65 - 68. 收稿日期：2005-09-29 （宋艳萍编校） 263中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3