P38和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1在内膜损伤后血管平滑肌细胞表型转化过程中的表达变化.pdf

文章编号 1007-3949 （2006） 14-02-0127-05 ·实验研究· p38 和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 在内膜损伤后 血管平滑肌细胞表型转化过程中的表达变化 张新平1，庞月华2，冯义伯1，付作林1，史春志1，谷翔1 （1.华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北省武汉市 430022； 2.乌鲁木齐市友谊医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830049） 关键词 病理学与病理生理学； p38 和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 与内膜增殖相关； 免疫组织化学染色； 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1； 内膜损伤； 血管平滑肌细胞； p38 摘要 目的观察动脉内膜损伤后血管平滑肌细胞表型转化和 p38 及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 表达的动 态变化。方法分别用免疫组织化学、 免疫印迹和逆转录聚合酶链反应方法检测假损伤组和损伤后不同时间点血 管壁中增殖细胞核抗原、 平滑肌肌动蛋白、 p38 蛋白和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 蛋白及其 mRNA 的表达。结 果假损伤组血管中膜平滑肌细胞及内皮细胞增殖细胞核抗原为阴性表达； 损伤后 5 14 天， 新生内膜阳性细胞 率逐渐增加， 28 天后开始逐渐减少， 且新生内膜阳性率均略高于中膜。假损伤组血管中膜平滑肌肌动蛋白表达 为阳性， 内皮为阴性； 中膜阳性面积于损伤后 1 天开始减少， 3 天最为明显， 5 天后开始逐渐增加， 且新生内膜阳性表 达略低于中膜。假损伤组血管中膜 p38 呈阴性或弱阳性着色； 损伤后 1 35 天呈持续高表达， 新生内膜阳性表达高 于中膜。p38 表达变化与增殖细胞核抗原表达变化呈正相关。假损伤组血管中膜丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 呈 弱阳性或阳性表达； 损伤后 1 天即开始下降， 14 28 天稍有回升， 至 35 天仍未回到假损伤组水平， 且新生内膜阳性 面积稍低于中膜。其表达变化与增殖细胞核抗原表达变化呈负相关。结论内膜损伤后血管平滑肌细胞增殖能 力与其表型转化密切相关， p38 和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 参与了损伤后血管平滑肌细胞表型转化的信号转 导及调节。 中图分类号 R363 文献标识码 A Changes of p38 and Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Phenotypic Mod- ulation of Vascular Smooth Muscle Cells After Intimal Injury ZHANG Xin-Ping1，PANG Yue-Hua2，FENG Yi-Bo1，FU Zhuo-Lin1，SHI Chun-Zhi1，and GU Xiang1 （1. Department of Cardiology，the Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，Chi- na；2. the Friendship Hospital，Urumqi City，Xinjiang 830049，China） KEY WORDS Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatases-1； Intimal Injury； Vascular Smooth Muscle Cell； p38； Neointima； Phenotypic Modulation ABSTRACTAimTo explore phenotypic modulation of vascular smooth muscle cells（VSMC）and change of p38，mito- gen-activated protein kinase phosphatase-1（MKP-1）expression after intimal injury.MethodsThe model of vascular restenosis established by intimal injury of rabbit carotid arteries was used.Immunohistochemistry，Western blot and reverse tran- scriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）were used to detect the changes of proliferation cell nuclear antigen（PCNA） ， smooth muscle-actin（SM-actin） ，p38 protein，and MKP-1 protein as well as its mRNA of sham-injured arteries and injured arteries at different time points.ResultsPCNA was negative in the medium and endothelium in sham-injured arteries. Positive cell rate of PCNA was gradually increased at 1 14 days in the medium and at 5 14 days in the neointima after injury， but it declined gradually after 28 days.Positive cell rate of PCNA in the neointima was slightly more than that in the medium at different time points.SM-actin was positive in the medium，negative in the endothelium in sham-injured arteries.SM-actin initially decreased in the medium at 1 day，it was minimal at 3 days after injury，but it increased gradually after 5 days.Positive expression of SM-actin in the neointima was slightly lower than that in the medium.p38 was negative or feeble positive in the medium in sham-injured arteries.p38 was continuously increased at 1 35 days after injury.Positive expression of p38 in the neointima was higher than that in the medium.There was positive relationship between change of p38 and that of PCNA in the vascular wall at different time points after injury.MKP-1 was feeble positive or positive in sham-injured arteries.MKP-1 ini- tially decreased at 1 day and increased graduallv from 14 28th day，but it was still lower than that in the sham-injured arteries on 35th day after injury.There was negative relationship between change of MKP-1 and that of PCNA in the vascular wall at dif- 收稿日期 2005-05-24修回日期 2005-12-12 作者简介 张新平，博士， 副主任医师，研究方向为冠心病介入诊治， E-mail 为 zhangxinping117202 sina.com。庞月华，主治医师，研究 方向为老年心血管病学。冯义伯，博士， 教授，博士研究生导师，研究方向为冠心病介入诊治。 721CN 43-1262/ R 中国动脉硬化杂志 2006 年第 14 卷第 2 期 ferent time points after injury.ConclusionThere was close relationship between phenotypic modulation and proliferation a- bility of VSMC. p38 and MKP-1 participated in phenotypic modulation of VSMC and its regulation after intimal injury. 血管平滑肌细胞 （vascular smooth muscle cell， VSMC） 分为分化型 （收缩型） 和去分化型 （合成型） 两 种表型。损伤后在生长因子作用下， VSMC 可由分化 型转变为去分化型， 从中膜向内膜下迁移并增殖， 合 成大量细胞外基质 （extracellular matrix， ECM） ， 这个过 程称为表型转化 1。平滑肌 肌动蛋白是分化型 VSMC 中特有的收缩蛋白， 其表达下调是 VSMC 表型 转化最重要的标志 2。增殖细胞核抗原 （proliferation cell nuclear antigen， PCNA） 是反映细胞增殖的重要生 物学指标， 目前将其作为去分化型 VSMC 的重要标 志 3。丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase， MAPK） 是胞外信号向核内传递， 引起细胞增 殖和肥大反应的共同通路与中心环节， p38 是 MAPK 超家族的新成员， 在细胞分化中起着至关重要的作 用 4。而丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 （mitogen-acti- vated protein kinase phosphatase， MKP） 作为一种双重底 物特异性蛋白磷酸酶， 能使 MAPK 上的苏氨酸 / 酪氨 酸去磷酸化使其失活， 因此对 MAPK 起着负性调节 作用 5。本文观察动脉损伤后不同时间点血管壁平 滑肌肌动蛋白、 PCNA 及 p38 和 MKP-1 蛋白及 mR- NA 的表达变化， 旨在探讨内膜损伤后 VSMC 表型转 化及 p38 和 MKP-1 在表型转化中的作用。 1材料与方法 1.1材料 经皮腔内血管成形术 （percutaneous transluminal coronary angioplasty， PTCA） 球囊导管 （2.5 × 14.0 mm） 德国贝朗公司； 高清晰度彩色医学图文分析系统 （HMIAS-2000） 日本 Olympus 公司； 凝胶图像分析仪 （Geldoc 2000） 美国 Bio-Rad 公司； PCNA、 平滑肌肌 动蛋白 鼠单克隆抗体、 p38 兔多克隆抗体和链霉素 亲合素生物素酶复合 物 （strept avidin-biotin-en- zyme complex， SABC） 免疫组织化学试剂盒购自武汉 博士德生物工程有限公司； MKP-1 兔多克隆抗体购 自 Santa Cruz 公司； MKP-1 及三磷酸甘油醛脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） 引 物由大连宝生物工程有限公司合成； 家兔购自华中 科技大学同济医学院实验动物中心。 1.2动脉内膜损伤模型建立及分组 将 48 只体重 2.3 2.8 kg 家兔随机分为假损伤 组和损伤后 1、 3、 5、 7、 14、 28 及 35 天组， 共 8 组， 每组 6 只。参照文献 6 ， 3%戊巴比妥钠 （30 mg/ kg） 腹腔 麻醉家兔后， 沿颈前正中线剪开皮肤， 游离左颈外动 脉和左颈总动脉 3 4 cm， 将颈外动脉远心端结扎， 用动脉夹将左颈总动脉近心端临时夹闭后， 在颈外 动脉结扎处近心端做 “V” 型切口， 插入球囊导管至颈 总动脉， 经压力泵向球囊注入肝素生理盐水 （8 atm） ， 慢速回拉球囊至颈内外动脉分叉处。回抽盐水后重 新送回导管， 反复 3 次， 结扎颈外动脉近心端， 松开 动脉夹， 恢复血流， 逐层缝合切口。术前静脉注射肝 素 0.1 u/ kg 抗凝。术后肌注青霉素预防感染。以结 扎左颈外动脉的家兔作为假手术组。 1.3标本制备 假手术组于 35 天处死， 损伤组分别于术后不同 时间点处死， 剪取靶血管段 3 cm， 取其远端 1 cm 血 管段置于 4 %甲醛溶液固定， 每份标本切成 2 段， 石 腊包埋， 间断均匀切片 （4µm） ， 进行免疫组织化学染 色。余标本迅速置 - 70 冰箱保存， 用于逆转录聚 合酶链反应 （reverse transcriptase-polymerase chain reac- tion， RT-PCR） 和 Western blot 检测。 1.4免疫组织化学染色 采用 SABC 法， 严格按照试剂盒说明进行 PCNA、 平滑肌肌动蛋白、 p38 和 MPK-1 免疫组织化学染 色， 阳性表达均为棕黄色或棕褐色， PCNA 主要定位 于胞核， 平滑肌肌动蛋白和 p38 定位于胞浆， MPK- 1 定位于胞浆和部分胞核。图文分析系统随机测量 每张切片中 3 个视野， 观察它们的表达变化并计算 PCNA 阳性细胞百分率， 取其均值。 1.5Western blot 检测 p38 蛋白 取各组血管标本 100 mg 分别剪碎， 加入裂解液， 碾磨成乳糜状， 离心后收集上清液， 考马斯兰法测定 蛋白含量。各取 50µg 蛋白， 进行 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳后， 硝酸纤维素膜转膜， 5% 脱脂奶粉室温下 封闭， 分别加入 p38 抗体 （1 :100 稀释） 和 GAPDH 抗 体 （1:200 稀释） ， 12 h 后冲洗， 加生物素标记的二抗 （羊抗兔 IgG） ， 用化学荧光剂压片显影， 凝胶图像处 理系统扫描显影密度。实验重复 3 次。 1.6逆转录聚合酶链反应检测丝裂原活化蛋白激 酶磷酸酶 1 mRNA 的表达 取各时间点血管标本， 剪碎后充分匀浆至组织 完全裂解。按试剂盒说明书提取总 RNA 后， 各样品 取 1 µg RNA， 进行 cDNA 合成及 PCR 扩增。MKP-1 （431 bp）上游 5 -GCTGTGCAGCAAACAGTCGA-3 ， 下 游 5 -CGATTAGTCCTCATAAGGTA-3 ；GAPDH（299 bp）上游 5 -GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3 ， 下游 5 - 821ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler，Vol 14，No 2 GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3 。 热 启 动 法 进 行 PCR， 94变性 l0 s， 57退火 30 s， 72延伸 40 s， 共 30 个循环。取 20µL 扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶 电泳， 溴化乙锭染色后于凝胶图像分析仪进行扫描 分析。实验重复 3 次。 1.7统计学处理 数据用 x ± s 表示， 采用 SPSS 12.0 统计软件， 组 间比较采用方差分析 （ANOVA） 和 t 检验。 P 0.05 为有显著性差异。 2结 果 2.1增殖细胞核抗原表达变化 假手术组动脉中膜及内皮细胞呈阴性着色； 损 伤后 1 天中膜近腔侧出现散在阳性细胞， 3 7 天开 始逐渐增多， 14 天达最多并向腔面集聚， 28 天后虽 开始减少， 但仍有较高表达； 损伤后 3 天管腔内表面 开始出现阳性细胞， 5 天新生内膜形成， 5 14 天新 生内膜中阳性细胞进行性增多， 新生内膜逐渐增厚， 28 35 天阳性细胞开始逐渐减少， 新生内膜进行性 增厚。各时间点新生内膜阳性细胞率均略高于中膜 （图 1 和表 1） 。 表 1. 不同时间点中膜和内膜增殖细胞核抗原阳性细胞百分 率（x ± s，n = 6） 分组中膜内膜 假手术组0- 1 天 5.16% ± 1.52% a - 3 天 30.47% ± 4.15% c 7.25% ± 1.71% a 5 天 39.29% ± 4.83%b40.31% ± 5.23% c 7 天 46.53% ± 5.67%b48.69% ± 5.35%b 14 天 58.21% ± 6.13% c 63.93% ± 6.84% c 28 天 43.76% ± 3.81% c 49.28% ± 5.46% c 35 天 27.19% ± 2.72% c 33.93% ± 3.88% c a 为 P 0.01，与假损伤组比较；b 为 P 0.05，c 为 P 0.01，与损 伤组上一时间点比较。 图 1. 损伤后不同时间点增殖细胞核抗原免疫组织化学染色A 为假手术组（ × 200） ， B 为损伤后 3 天（ × 400） ， C 为损伤后 7 天（ × 400） ， D 为损伤后 28 天（ × 200） 。 2.2平滑肌细胞肌动蛋白表达变化 假手术组血管中膜呈阳性表达， 内皮及外膜呈 阴性表达； 损伤后 1 天中膜近管腔侧阳性表达开始 减少， 3 天显著减少， 5 天后开始逐渐增加， 至 35 天 接近于假手术组水平； 损伤后 3 天管腔内表面 VSMC 呈阴性着色， 5 35 天新生内膜中均有阳性表达， 但 略弱于中膜 （图 2） 。 图 2. 损伤后不同时间点血管壁平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色（ × 200）A 为假手术组，B 为损伤后 3 天，C 为损伤后 5 天， D 为损伤后 14 天。 2.3p38 表达变化 假手术组血管中膜呈弱阳性或阴性表达； 损伤 后 1 天中膜阳性表达明显增加， 3 14 天持续增加， 28 天后开始减少， 但仍明显高于假手术组。p38 持 续高表达于 5 35 天的新生内膜形成中， 且强于中 膜表达。阳性着色主要出现在胞核较大的 VSMC 921CN 43-1262/ R 中国动脉硬化杂志 2006 年第 14 卷第 2 期 中， 而胞核较小的 VSMC 则较少和无阳性着色 （图 3） 。Western blot 检测假手术组血管壁中有少量 p38 蛋白表达， 损伤后 1 35 天持续升高， 以 3 14 天最 为明显， 28 天后虽开始逐渐减少， 但仍有较强表达 （表 2 和图 5） 。 2.4丝裂原蛋白激酶磷酸酶 1 表达变化 假手术组血管中膜呈弱阳性或阳性表达； 损伤 后 1 3 天中膜阳性表达进行性减少， 5 7 天降到最 低值， 同时新生内膜呈阴性或弱阳性着色。14 28 天中膜和新生内膜阳性表达略有增加， 35 天明显增 加。各时间点新生内膜阳性表达稍弱于中膜表达， 阳性着色主要分布在胞核较小的 VSMC 中， 而胞核 增大 的细胞 则 较 少 着 色 和无着色 （图 4） 。MKP-1 mRNA 水平在损伤后 1 天开始逐渐下降， 5 7 天达 最低水平， 14 28 天略有回升， 35 天仍未回到假手术 组水平 （表 2 和图 6） 。 表 2. p38 蛋白和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 mRNA 的表达 （x ± s） 分组p38 蛋白MKP-1 mRNA 假手术组0.256 ± 0.0131.206 ± 0.041 1 天 0.978 ± 0.028a1.114 ± 0.038a 3 天 1.134 ± 0.031c1.032 ± 0.034c 5 天 1.246 ± 0.033c0.938 ± 0.029c 7 天 1.250 ± 0.0390.941 ± 0.031 14 天 1.248 ± 0.0350.992 ± 0.032 28 天 0.964 ± 0.030c0.995 ± 0.033 35 天 0.955 ± 0.027a1.067 ± 0.035b a 为 P 0.01，与假损伤组比较；b 为 P 0.05，c 为 P 0.01，与损 伤组上一时间点比较。 图 3. 损伤后不同时间点血管壁 p38 免疫组织化学染色（ × 200）A 为假手术组，B 为损伤后 1 天，C 为损伤后 14 天，D 为损伤后 35 天（左下角为中膜） 。 图 4. 损伤后不同时间点丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 免疫组织化学染色（ × 200）A 为损伤后 1 天，B 为损伤后 5 天，C 为损伤 后 14 天，D 为损伤后 35 天（左下为中膜） 。 图 5. p38 蛋白表达的免疫印迹产物电泳图S 为假手术组， 1 7 分别为损伤后 1、 3、 5、 7、 14、 28 及 35 天。 3讨 论 血管平滑肌细胞 （VSMC） 是一种高度特化的细 胞， 具有可变性。在胚胎期或新生动物， VSMC 处于 合成型即去分化型， 细胞可以分裂、 增殖及迁移， 但 图 6. 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1 mRNA 的逆转录聚合酶 链反应产物电泳图S 为假手术组，1 7 分别为损伤后 1、 3、 5、 7、 14、 28 及 35 天，M 为 Marker。 收缩蛋白和肌纤维成分少， 收缩功能差。在成年动 物， 生理情况下 VSMC 处于收缩型即分化型， 收缩功 能好， 但不再增殖、 分化和迁移， 合成 ECM 的能力较 低， 对生长因子几乎无反应， 处于静止期。 031ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler，Vol 14，No 2 血管壁由不同种类的 VSMC 构成， 发生表型转 化后 由 不 同 功 能 的 特 殊 亚 群 细 胞 执 行 着 不 同 功 能 7。当血管壁特别是内膜损伤后， VSMC 迅速发生 以基因表达改变为特征的表型转化， 表现为分化型 标志基因表达下调， 肌纤维骤减， 粗面内质网、 核糖 体和高尔基体等细胞器增多， 合成和分泌功能增强， 重新获得增殖能力， 并可从中膜游走到内膜， 合成和 分泌大量 ECM， 形成新生内膜 8。因为没有一个标 志基因对鉴定 VSMC 表型转化是特异性的 7， 所以 使用平滑肌肌动蛋白 和 PCNA 作为分化和去分化 标志， 观察内膜损伤后 VSMC 表型转化。结果发现， 假手术组中膜平滑肌肌动蛋白呈阳性， PCNA 呈阴 性表达， 说明正常 VSMC 处于分化状态。损伤后 1 天 和 3 天， 中膜管腔侧出现散在 PCNA 阳性细胞并开始 增多， 胞核增大呈卵圆形； 而平滑肌肌动蛋白表达 开始减少并显著减少， 表明部分 VSMC 发生了表型 转化。5 14 天中膜及新生内膜中 PCNA 阳性细胞 进行性增多并向管腔侧集聚； 28 35 天虽开始逐渐 减少， 但仍有较高阳性率且新生内膜略高于中膜表 达。中膜平滑肌肌动蛋白阳性表达于损伤后 5 天 开始逐渐增加， 但新生内膜其阳性表达略弱于中膜 表达。逐渐增厚的新生内膜以大量 VSMC 为主， 同 时夹杂着丰富 ECM。提示内膜损伤诱发 VSMC 表型 转化后， 使其获得增殖、 迁移和合成 ECM 能力； 发生 表型转化的 VSMC 一部分可返回分化型， 一部分仍 处于去分化状态继续增殖， 并在此种状态下持续至 少 35 天； 迁移至血管内腔的 VSMC 是形成新生内膜 的主要成分， 并且可以继续增殖， 分泌大量 ECM， 使 新生内膜进行性增厚； 损伤早期 （1 14 天）以中膜 VSMC 增殖为主， 以后以新生内膜 VSMC 增殖为主。 Haisong 等 9研究认为持续激活 p38 在损伤后的 内膜增殖中起着重要作用。本研究结果发现 p38 阳 性细胞首先出现于中膜， 损伤后 1 天即明显增加， 3 14 天最为显著， 新生内膜表达高于中膜表达并持 续至少 35 天。p38 阳性表达主要分布在胞核大的去 分化型 VSMC 中， 而胞核较小的分化型 VSMC 则较少 或无表达。损伤后各时间点血管壁中 p38 蛋白持续 升高， 其表达变化与 PCNA 表达变化呈正相关 （r = 0. 76， P 0.01） ， 且早于平滑肌肌动蛋白表达减少。 说明 p38 表达增加与 VSMC 表型转化密切相关， 合成 型 VSMC 有很强的增殖能力及更高的 p38 水平。血 管损伤后持续高表达 p38 在 VSMC 表型转化中起着 重要作用。假手术组血管中膜 MKP-1 呈阳性表达， 其 mRNA 表达亦较高。损伤后迅速下降， 同时 VSMC 去分化、 增殖活跃； 至 35 天呈恢复趋势， 去分化返回 分化状态的 VSMC 亦逐渐增多。MKP-1 在分化型 VSMC 中均呈高表达， 在去分化 VSMC 中则低表达或 无表达。损伤后不同时间点 MKP-1 mRNA 与 PCNA 表达变化呈负相关 （r = - 0.78， P 0.01） ， 与平滑肌 肌动蛋白表达变化趋势基本一致。说明血管损伤 后 MKP-1 表达减少有助于 VSMC 表型转化。其可能 机制是： 内皮损伤蛋白激酶 C、 受体酪氨酸激酶激 活MKP 失活MAPK 激活VSMC 由收缩型转化 合成型增殖反应。 综上所述 VSMC 表型转化在血管再狭窄发病机 制中占有重要地位。p38 和 MKP-1 参与了损伤后 VSMC 表型转化的信号转导及其调节。因此， 抑制 p38 和增强 MKP-1 表达可能是抑制损伤后 VSMC 表 型转化的新靶点。 参考文献 1 Lavigne MC，Ramwell PW，Clarke P.Growth and phenotypic characterization of porcine coronary artery smooth muscle cells J .In Vitro Cell Dev Biol Anim， 1999，35（3） ：136-143 2 Regan CP，Adam PJ，Madsen CS，Owens GK.Molecular mechanisms of de- creased smooth muscle differentiation marker expression after vascular injury J . 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Sustained activation of p38MAPK mitogen-activated protein kinase contributes to the vascular response to injury J .Pharmacology and Experimental Therapeutics， 2002，301（1） ：15-20 （此文编辑文玉珊） 131CN 43-1262/ R 中国动脉硬化杂志 2006 年第 14 卷第 2 期