T2毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响.pdf

第2 7 卷第2 期 2 0 0 6 年 4 月 西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) J o u r n a l o f X i ' a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y ( Me d i c a l S c i e n c e s ) Vo l . 2 7 No . 2 Ap r . 2 0 0 6 T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响 杨占田 ， 陈静宏 ， 楚雍烈“ ， 曹峻岭 ， 王治伦 ， 师钟丽 ， 郭雄 ( 西安交通大学医学院: 1 . 环境与疾病相关基因教育部重点实验室; 2 .病原微生物教研室， 陕西西安7 1 0 0 6 1 ) 摘要: a的探讨 T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮( N O ) 的影响。方法胎儿软骨细胞体外培养， 用 MT T法检测 软骨细胞存活率; 用 G r i e s s 重氮化法测定软骨细胞培养上清液中N O含量; 用We s t e r n b l o t 检测软骨细胞一氧化氮合 酶O N O S ) 的表达。t o 果 T - 2 毒素在质量浓度在1 -2 0 0 0 p g / 1 . 的范围内， 软骨细胞存活率对其呈较典型的浓度依 赖关系和时间依赖关系， 而且随着作用时间的延长， 浓度依赖关系更为明显; T - 2 毒素刺激软骨细胞分泌 N O和表达 i N O S 蛋白。t o 8 4 T - 2 毒素引起的软骨细胞损伤和生长抑制与T - 2 毒素刺激软骨细胞表达 i N O S 蛋白和分泌 N O增 多有关。 关键词: T - 2 毒素; 软骨细胞; 一氧化氮; 一氧化氮合酶 中图分类号: R 3 9 4 . 2文献标识码: A文章编号: 1 6 7 1 - 8 2 5 9 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 5 0 - 0 3 E f f e c t s o f T - 2 t o x i n o n n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n i n c h o n d r o c y t e s Y a n g Z h a n t i a n ' ， C h e n J i n g h o n g ' ， C h u Y o n g l i e 2 ， C a o J u n l i n g ' ， Wa n g Z h i l u n ' ， S h i Z h o n g l i ' ， G u o X i o n g ' ( 1 . K e y L a b o r a t o r y o f E n v i r o n me n t a n d G e n e s R e l a t e d t o D i s e a s e s o f Mi n i s t r y o f E d u c a t i o n ; 2 . D e p a r t me n t o f Mi c r o b i o l o g y , Me d i c a l S c h o o l o f X i ' a n J i a o t o n g Un i v e r s i t y ， X i ' a n 7 1 0 0 6 1 ， C h i n a ) A B S T R A C T : O b j e c t iv e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f T - 2 t o x i n o n n i t r i c o x i d e ( N O ) p r o d u c t i o n a n d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e O N O S ) e x p r e s s i o n i n c h o n d r o c y t e s . M e t h o d s H u m a n c h o n d r o c y t e s c u l t u r e d i n v i t r o w e r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f T - 2 t o x i n i n d i f f e r e n t t i m e ( 1 一5 d a y ) . C e l l v i a b i l i t y o f t h e t r e a t e d c e l l s w a s m e a s u r e d b y MT T a s s a y ; T h e l e v e l s o f N O i n c u l t u r e me d i a w e r e d e t e c t e d b y c o l o r i me t r i c m e t h o d o f G r i e s s a s s a y ; i N O S p r o t e i n w a s m e a s u r e d b y We s t e r n b l o t . R e s u l t s D o s e - d e p e n d e n t a n d t i m e d e p e n d e n t e f f e c t s o f T - 2 t o x i n w e r e f o u n d o n T - 2 t o x i n t r e a t e d c h o n d r o c y t e s w i t h i n a c e r t a i n r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n ( 1 一2 0 0 0 ,u g / L ) a n d a p e r i o d s o f t i m e ( 1 一5 d a y ) ; T h e l e v e l s o f N O i n T - 2 t o x i n t r e a t e d c u l t u r e m e d i a w e r e h i g h e r t h a n t h a t o f n o r m a l c o n t r o l g r o u p ; O v e r - e x p r e s s i o n o f i N O S w a s d e t e c t e d i n T - 2 t o x i n t r e a t e d c e l l s . C o n c lu s i o n T - 2 t o x i n c a n e n h a n c e N O p r o d u c t i o n a n d u p - r e g u l a t e e x p r e s s i o n o f i N O S . N O p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n T - 2 t o x i n i n d u c e d g r o w t h i n h i b i t o r y a n d t o x i c e f f e c t s . K E Y WO R D S : T - 2 t o x i n ; c h o n d r o c y t e s ; n i t r i c o x i d e ; n i t r i c o x id e s y n t h a s e T - 2 毒素的病因学意义是目前大骨节病研究领 域的热点。大量研究发现 T - 2 毒素可致软骨细胞损 伤 r 。本研究采用胎儿软骨细胞体外培养， 观察 T - 2 毒素对软骨细胞分泌一氧化氮( n i t r i c o x i d e , N O ) 及 其诱导型一氧化氮合酶( n i t r i c o x i d e s y n t h a s e , i N O S ) 的影响， 旨在探讨 T - 2 毒素致软骨细胞损伤的 分子机理。 1 材料与方法 1 . 1 试剂与仪器D ME M培养基( G I B C O) , 胰蛋 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 7 - 0 4修回日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 2 0 墓金项目: 教育部科技重点项目( 重点0 3 1 5 2 ) . 通讯作者: 陈静宏. E - m a i l ; j i x i a n g 4 6 )1 6 3 . c o m 作者简介: 杨占田( 1 9 6 1 - ) ， 男( 汉族) ， 主管技师. 白酶、 透明质酸酶和1 1 型胶原酶( S i g m a ) , i N O S 单克 隆抗体 ( 博 士德生物工程公 司) 、 四甲基偶氮哇 ( MT T ) 、 二甲基亚矾( D MS O ) , N - 1 蔡乙二胺盐酸盐 和磺胺( 华美生物工程公司) ， T - 2毒素由中国军事 医学科学院毒物药物研究所杨进生教授赠送， 7 5 2 型 紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ， E l x 8 0 0 型通用酶标仪( 基因公司) 。 1 . 2 软骨细胞培养及分组中孕引产胎儿的软骨细 胞原代培养方法同文献 2 。第一代软骨细胞培养 4 8 h 后随机分为对照组、 T - 2 毒素处理组， 将不同质 量浓度 T - 2毒素( 1 , 5 , 1 0 , 2 0 , 5 0 , 1 0 0 , 1 0 0 0 , 2 0 0 0 , 4 0 0 0 , 8 0 0 0 t .g / L ) 溶于D M E M完全培养基中( 含 1 5 0 m L / L F C S ， 青霉素 1 0 0 U / M L ， 链霉素 1 0 0 U / M L ) o 2 期杨占田， 陈静宏， 楚雍烈， 等. T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响 门nn 09八凡 月二 根据 T - 2毒素对软骨细胞的作用， 再选择 1 , 1 0 , 2 0 ji g / L T - 2 毒素处理组作进一步的检测。 1 . 3 观察指标 1 . 3 . 1 MT T法检测细胞存活率第一代软骨细胞 悬液2 0 0 p L ( 含5 X 1 0 3 的软骨细胞) 接种于9 6 孔组 织培养板， 贴壁生长4 8 h 后， 加人含不同浓度 T - 2 毒 素的培养液， 每组设 6 个平行孔， 分别培养 1 -5 d ， 然 后加人2 0 Ii L M T T ( 5 g / L ) ， 继续培养4 h 后， 弃去培 养液， 加人二甲 基亚矾1 5 0 tA L ， 用力振荡5 m i n 使甲 腊结晶溶解完全， 最后置于酶标仪 4 9 0 n m处测定A 值。细胞存活率用下列公式计算: 7 0 60 00 、魂咔 3 0 2 0 岁云1q.1钾月一nll。口 s 1 0 2 0 5 0】 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 8 0 0 0 C o n c e n t r a t i o n o f T - 2 t o x i n ( t i g / L ) 细 胞 存 活 率 一 爵 肇 墨 丢 义 1 0 0 0 o 1 . 3 . 2 N O浓度测定鉴于 N O的性质极不稳定， 在体内、 体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐， 因此 测定样品中的亚硝酸盐和硝酸盐可作为衡量 N O合 成的指标。本实验采用 G r i e s s 重氮化法。取细胞培 养上清0 . 5 m l , ， 加人0 . 5 m L G r i e s s 试剂( 1 0 g / L 磺 胺和1 g / L蔡乙二胺盐酸盐等量混合) ， 混匀室温放 置 1 0 mi n ， 于紫外分光光度计 5 4 0 n m处测定 A值， 以亚硝酸钠为标准， 计算 N O浓度。 1 . 3 . 3 I N O S的检侧采用 We s t e r n b l o t i n g 分析。 各组 T - 2 毒素作用于软骨细胞 5 d ， 收集各组软骨细 胞， 常规提取蛋白质， 进行 S D S - P A G E后， 电转移至 硝酸纤维 ( N C ) 膜上， 按文献 3 进行免疫印迹 ( We s t e r n b l o t t i n g ) 检测， 凝胶成像系统测定积分吸 光度值。 1 . 4 统计分析结果以均数士标准差( x 士: ) 表示， 采用S P S S 1 0 . 0 软件包统计分析， 各组间比较采用方 差分析， P O . 0 5 为差异有显著性。 图1 不同浓度T - 2 毒素在不同作用时间对软骨细胞存活 率的影响 F i g . 1 E f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n T - 2 t o x i n o n t h e c e l l u - l a r v i a b i l i t y o f c h o n d r o c y t e s e s t i m a t e d b y MT T r e d u c t io n 表 1 成 N O Ta b l e 不同质f浓度T - 2 毒素在不同作用时间对软骨细胞合 的影响 1 Ef f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n p r o d u c t i o n u s i n g G r i e s s a s s a y n =6 . T- 2 x士 s t o x i n o n NO G r o u p C o n t r o l T- 2 t o x i n 1 U g / 1 . 1 0 p g / L 2 0 K g / 1 . . P 0 . 0 5 ， 4 8 h 9 . 4 7 士0 产m o l / L ) 1 4 4 h 1 1 . 3 4 士0 . 9 3 1 1 . 3 5 士1 . 4 7 “ 1 1 . 0 1 士0 . 3 7 1 1 . 4 4 士0 . 2 1 “ 1 2 . 4 4 士0 . 7 9 “ 1 4 . 1 6 士0 . 7 1 “ 1 5 . 9 3 士0 . 8 2. v s . c o n t r o l 2 结果 2 . 1 T - 2 毒素对软骨细胞存活率的影响随着 T - 2 毒素质量浓度的增加， 细胞存活率明显下降， 细胞生 长抑制也越来越明显， 呈浓度依赖关系; 随着作用时 间的延长， T - 2毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐加 强， 呈时间依赖关系。各组T - 2 毒素作用于软骨细胞 5 d 时抑制作用已达到近饱和( 图 1 ) 0 2 . 2 T - 2 毒素对软骨细胞 N O浓度的影响不同质 量浓度的T - 2 毒素均能明显增加培养上清液中 N O 的浓度( P 0 . 0 5 ) ， 并呈浓度依赖关系( 表 1 ) o 2 . 3 T - 2 毒素对软骨细胞表达 i N O S蛋白的影响 T - 2 毒素能增强 i N O S表达 ( P 0 . 0 5 ) ， 在实验所选 范围内， 浓度越高， i N O S表达越强， 刺激作用越明显 ( 图 2和表 2 ) 0 图2 T - 2 毒素诱导软骨细胞表达 i N O S蛋白的 We s t e r n b l o t t i n g电泳结果 F i g . 2 We s t e r n b l o t t i n g a n a l y s i s o f T - 2 t o x i n - i n d u c e d e x - p r e s s i o n o f i N O S p r o t e i n 表 2 T - 2 毒素诱导软骨细胞表达 iN O S 蛋白的积分吸光度值 T a b l e 2 I n t e g r a l o p t i c a l d e n s i t y a n a l y s i s o f T - 2 t o x i n - i n d u c e d e x p r e s s i o n o f i N O S p r o t e i n G r o u p C o n t r o l T - 2 t o x i n 1 ,u g / L 1 0 p g / L i NOSAc t i n 6 9 . 1 6 士5 . 4 33 3 3 . 6 6 士 1 7 . 7 ( n =3 , x 士s ) i N O S / A c t i n 0 . 2 0 7 士0 . 0 2 : 2 3 士3 5 6 士6 1 9 士9 . 7 1 . S 艺: : 0 2 士1 0 6 9 士1 4 7 0 士2 0 2 7 9 士0 2 9 9 士0 3 3 0 士0 . 0 3 “ . 01 P 0 . 0 5 , v s . c o n t r o l 3 讨论 镰刀菌广泛存在于自然界中 4 1 o T - 2 毒素是由 西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )第 2 7 卷 镰刀菌产生的单端抱烯族毒素( T s ) 中最毒的一种， 是食物中常见的污染性霉菌毒素。国内外研究表明， 饮食中污染 T - 2 毒素可以对机体造成多种病理损害， 如血液毒性1 5 1 、 免疫毒性E 6 1 以及对软骨的损伤 等。 本研究用 MT T法检测了 T - 2 毒素对软骨细胞的损 伤和生长抑制作用， 发现软骨细胞经不同质量浓度 T - 2 毒素作用后， 随着 T - 2 毒素质量浓度的增加， 细 胞存活率明显下降， 细胞生长抑制越来越明显， 呈浓 度依赖关系。随着 T - 2毒素与软骨细胞作用时间的 延长， T - 2毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐加强， 呈时间依赖关系。 N O是一种高反应性、 细胞毒性的自由基， 受许 多因子调节， 其在许多疾病中对组织造成损伤已得到 了证实L 7 1 。关节软骨细胞和滑膜成纤维细胞是产生 N O的潜能细胞。近年研究发现， N O参与软骨破坏 的病理过程。在体内， N O是由一氧化氮合酶( N O S ) 催化L 一 精氨酸产生。N O S 按表达方式分为自发型 ( 包括神经型和内皮型) 和诱导型( i N O S ) 两种。自发 型仅产生少量 N O， 而诱导型在细胞因子如白细胞介 素一 1 ( I L - 1 ) 、 肿瘤坏死因子( T N F ) 和细菌脂多糖 ( L P S ) 刺激下即可产生大量 N o E 8 1 o 本实验结果表明， 不同质量浓度的T - 2 毒素均可 增强 i N O S表达， 并引起软骨细胞 N O分泌明显增 加， 呈浓度依赖关系。表明T - 2 毒素引起的损伤与软 骨细胞产生 N O有关， N O是 T - 2 毒素引起的软骨细 胞损伤的诱导者之一。 本室已有研究表明， T - 2 毒素能明显提高培养上 清液中 I L - 2和 T N F的质量浓度( 结果另文发表) ， 我们由此可以推测， T - 2 毒素引起软骨细胞大量分泌 I L - 2 和T N F ， 二者单独或协同进一步刺激软骨细胞 i N O S 表达， 并分泌大量N O， 引起软骨细胞损伤。 N O参与各种疾病的组织损伤， 如抑制细胞增 殖、 诱导各种细胞凋亡。L e e 等1 9 1 研究表明一氧化氮 合酶抑制剂 N 一 硝基一 L 一 精氨酸( L - N A M E ) 可使外源 性 N O分泌减少， 培养软骨细胞的凋亡程度随之减 轻。 H a s h i m o t o 等 10 1 用N O诱导软骨细胞凋亡并分 离出凋亡小体。推测 N O可能通过两种方式诱导软 骨细胞损伤。一是高浓度的 N O能抑制多种与线粒 体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶， 从而抑制线 粒体呼吸， 造成组织细胞损伤; 二是 N O与超氧化阴 离子 ( O Z ) 反应， 生成氧化亚硝基阴离子( O N O O - ) , 在酸性条件下( 如病理条件下)迅速分解为 0 2-和 N O - “ 自由基， 这两种自由基具有很强的细胞毒性， 可造成组织细胞损伤。 近来研究发现， 大骨节病病区儿童血清 N O质量 浓度高于非病区儿童 川， T - 2 毒素作为大骨节病热点 可疑病因， 它对软骨细胞合成N O究竟产生了何种影 响， 我们的初步研究结果表明T - 2 毒素可以诱导软骨 细胞合成 N O增多， T - 2 毒素引起的软骨细胞损伤与 软骨细胞合成 N O增多有关， 二者结果有一定的一致 性。当然， 由于本实验是体外实验， 并不能为大骨节 病和骨关节病提供确切病因学证据， 只能是发病机理 的一个探讨。 参考文献 : 1 赵志军， 李强. T - 2毒素致大骨节病软骨细胞损伤的研究进展 J . 中国地方病防治杂志， 2 0 0 5 , 2 0 ( 1 ) : 2 3 - 2 5 . 2 曹峻岭， 熊泳民， 张矢远. T - 2 毒素对培养软骨细胞生长代谢的影 响 J . 中国地方病学杂志， 1 9 9 4 , 1 3 ( 5 ) : 2 6 8 - 2 7 0 . 3 B o q u a n J I N . C e l l u l a r a n d m o l e c u l a r i m m u n o l o g y M . B e j i n g S c i e n t i f i c a l P u b l i s h i n g C o m p a n y , 2 0 0 1 : 1 3 3 - 1 3 9 . 4 F u n g F , C l a r k R E H e a l t h e f f e c t s o f m y c o t o x i n : a t o x i c o l o g i c a l o v e r v i e w J . C l i n T o x i c o l , 2 0 0 4 , 4 2 ( 2 ) : 2 1 7 - 2 3 4 . 5 P a r e n t - M a s s i n D . H a e m a t o t o x i c i t y o f t r i c h o t h e c e n e s J . T o x i - c o l L e t t , 2 0 0 4 , 1 5 3 ( 1 ) : 7 5 - 8 1 . 6 T i e f e n b a c h B , H e n n i g h a u s e n G, Me r k o r d J . T r i c h o t h e c e n e T - 2 T o x i n ( T - 2 ) i n d u c e s t o x i c e f f e c t s o n t h e d e v e l o p i n g i m m u n e s y s - t e m i n r a t s J . T o x i c o l L e t t , 1 9 9 5 ， 7 8 : 7 9 . 7 Ma n a c u C A, Ma r t e l- P e l l e t i e r J , R o y - B e a u d r y M, e t a l . E n d o - t h e l i n - 1 i n o s t e o a r t h r i t i c c h o n d r o c y t e s t r i g g e r s n i t r i c o x i d e p r o - d u c t i o n a n d u p r e g u l a t e s c o l l a g e n a s e p r o d u c t i o n J . A r t h r i t i s Re s T h e r , 2 0 0 5 , 7 ( 2 ) : R3 2 4 - R3 3 2 . 8 V u o l t e e n a h o K, Mo i l a n e n T , H a m a l a i n e n M, e t a l . R e g u l a t i o n o f n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n i n o s t e o a r t h r i t i c a n d r h e u m a t o i d c a r t i - l a g e . R o l e o f e n d o g e n o u s I L - 1 i n h i b i t o r s J . S c a n d J R h e u m a - t o l , 2 0 0 3 , 3 2 ( 1 ) : 1 9 - 2 4 . 9 L e e MS , T u Y K, C h a o C C K, e t a l .I n h i b i t i o n o f n i t r i c o x i d e c a n a m e l i o r a t e a p o p t o s i s a n d m o d u l a t e m a t r i x p r o t e i n g e n e e x - p r e s s i o n i n b a c t e r i a i n f e c t e d c h o n d r o c y t e s i n v i t r o J . J O r t h o - p a e d i c R e s , 2 0 0 5 , 2 3 ( 2 ) : 4 4 0 - 4 4 5 1 0 H a s h i m o t o S , O c h s R L , R o s e n F , e t a l . C h o n d d r o c y t e - d e r i v e d a p o p t o s i s b o d i e s a n d c a l c i f i c a t i o n o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e J . P r o c Na t l Ac a d S c i US A, 1 9 9 8 , 9 5 ( 6 ) ; 3 0 9 4 - 3 0 9 9 . 1 1 张宝弟， 郭雄，白广禄， 等. 大骨节病患者血清N O , N O S , F a s , A P O - 1 检测分析 J . 中国地方病学杂志， 2 0 0 4 , 2 3 ( 2 ) : 1 7 2 - 1 7 4 . ( 编辑邱芬)