[农业标准]-NYT546-2002.pdf

I C S 1 1 . 2 2 0 B4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 猪萎缩性鼻炎诊断技术 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a t r o p h i c r h i n i t i s o f sw i ne 2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布 2 0 0 2 一 1 2 一 0 1 实施 中 华 人 民共 和 国农 业 部 发 布 3 71 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 前言 猪萎缩性异炎是猪的重要疫病， 无法治疗和终生危害， 是集约养猪业的大敌， 世界动物卫生组织 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h ( 英) , O f f i c e I n t e n t i o n a l d e s E p i z o o t i c ( 法) , O I E 和我国将之列 为B类或二类动物疫病。 O I E 诊断试验和疫苗标准手册 ( 2 0 0 0 ) ( M a n u a l o f S t a n d a r d s f o r D i a g n o s t i c T e s t s a n d V a c c i n e s , 2 0 0 0 ) 第 2 . 6 . 1 章规定了诊断该病的技术框架( 未规定技术细节) 。本标准与该章异同在于: 本标准采用了该章规定的主要技术， 但未完全采用某些推荐技术( 如酶联免疫吸附试验 ( E L I S A ) 和禽幼红细胞( E B L ) 细胞覆层琼脂法等) ， 并充分反映了本国的多年研究成果和 经验; - 一本标准依据 诊断试验和疫苗标准手册 的技术框架， 规定了具体的操作程序。 本标准的附录B 、 附录C为规范性附录， 附录A为资料性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由 全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人: 彭发泉、 杨旭夫、 苑士祥。 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 猪萎缩性真炎诊断技术 1 范围 本标准规定了猪传染性萎缩性鼻炎的诊断技术。 本标准适用于猪传染性萎缩性鼻炎的诊断、 检疫和对无特定病原( S P F ) 猪的监控。 2 诊断方法 2 . 1 临床检查 2 . 1 . 1 对仔猪群应检查下列症状: 有一定数目 的仔猪流鼻汁、 流泪， 经常喷嚏、 鼻塞或咳嗽， 但无热， 个 别鼻汁混有血液。一些仔猪发育迟滞， 犬齿部位的上唇侧方肿胀。 2 . 1 . 2 对育成猪群和成猪群应检查: a ) 鼻塞， 不能长时间将鼻端留在粉料中采食; 妞血， 饲槽沿染有血液; b ) 两侧内眼角下方颊部形成“ 泪斑” ; c ) 鼻部和颜面有如下变形: 1 ) 上额短缩， 前齿咬合不齐( 评定标准: 下中切齿在上中切齿之后为阴性， 反之为阳性) ; 2 ) 鼻端向一侧弯曲 或鼻部向 一侧歪斜; 3 ) 鼻背部横皱摺逐渐增加; 4 ) 眼上缘水平上的鼻梁变平变宽。 d ) 伴有生长欠佳。 2 . 1 . 3 检疫猪群发现有上列症候群， 可以临床上初步诊断猪群有支气管败血波氏杆菌 工 相菌的传染或 与产毒素性多杀巴氏杆菌的混合感染， 特别是2 . 1 . 2 0具有本病临床指征意义， 需进行检菌、 血清学试 验及病理解剖检查， 予以确诊。 2 . 2 病理检查 2 . 2 . 1 尸体外观检查 主要检查有无鼻部和颜面变形及发育迟顿， 记录其状态和程度。对上顺短缩可以作定性， 下中切齿 在上中切齿之后判为“ 一” ， 反之判定为“ +” ; 测量上与下中切齿的离开程度， 如一3 m m或+1 2 m m分 别判定为正常或阳性。 2 . 2 . 2 异部横断检查 2 . 2 . 21 检查鼻腔是在鼻部作1 -3 个横断， 检查横断面。鼻部的标准横断面在上顺第二前臼齿的前 缘. 此处鼻甲骨卷曲发育最充分。 先除去术部皮肉， 然后用锐利的细齿手锯或钢锯以垂直方向横断鼻部。 可再向前( 通过上额犬齿) 或向后作第 2 和第 3 新的横断， 其距离大猪为 1 . 5 c m-2 c m, 哺乳仔猪约 0 . 5 c m, 2 . 2 . 2 . 2 为便于检查断面， 先用脱脂棉轻轻除去锯屑。如果拍照， 应将鼻道内的凝血块等除去， 使断面 构造清晰完整， 必要时可用吸水纸吸除液体。 2 . 2 - 2 . 3 首先检查鼻道内的分泌物的性状和数量及枯膜的变化( 水肿、 发炎、 出血、 腐烂等) 。 22 . 2 . 4 主要检查鼻甲骨、 鼻中隔和鼻腔周围骨的对称性、 完整性、 形态和质地( 变形、 骨质软化或疏 松、 萎缩以至消失) 以及两侧鼻腔的容积。如果需要， 可以测量鼻中隔的倾斜或弯曲程度， 鼻腔纵径及两 侧鼻腔的最大横径。 除肉眼检查外， 应对鼻甲骨进行触诊， 以确定卷曲及其基础部的骨板的质地( 正常骨 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 板坚硬， 萎缩者软化以至消失) 。 鼻甲骨萎缩主要发生于下鼻甲骨， 特别是腹卷曲。 鼻腔标准横断面的萎 缩性鼻炎分级标准见附录A 2 . 2 . 3 肺部检查 少数病仔猪伴有波氏杆菌性支气管肺炎。 肺炎区主要散在于肺前叶及后叶的腹面部分， 特别是肺门 部附近， 也可能散在于肺的背面部分。病变呈斑块状或条状发生。急性死亡病例均为红色肺炎灶。 2 . 2 A判定 具有鼻甲骨萎缩病变的病猪不论有或无临床鼻部弯曲等颜面变形症状， 均判定为萎缩性鼻炎病猪。 2 . 3 细菌检查 由猪鼻腔采取鼻粘液 同时进行支气管败血波氏杆菌 I 相菌及产毒素性多杀巴氏杆菌的分离。 猪群 检疫以4 - - 1 6 周龄特别是4 -8 周龄猪的检菌率最高。 2 . 3 . 1 异粘液的采取 2 . 31 . 1 由两侧鼻腔采取鼻粘液， 可用一根棉头拭子同时采取两侧鼻粘液、 或每侧鼻粘液分别用一根 棉头拭子采取 2 . 3 . 1 . 2 拭子的长度和粗细视猪的大小而定， 应光滑可弯曲， 由竹皮等材料削成， 前部钝圆， 缠包脱脂 棉， 装人容器， 高压灭菌 2 . 3 门. 3 小猪可仰卧保定， 大猪用鼻拧子保定。 用拧去多余酒精的酒精棉先将鼻孔内缘清拭， 然后清拭 鼻孔周围 2 . 3 . 1 . 4 拭子插人鼻孔后， 先通过前庭弯曲部， 然后直达鼻道中部， 旋转拭子将鼻分泌物取出， 将拭子 插人灭菌空试管中( 不要贴壁推进) ， 用试管棉塞将拭子杆上端固定 2 . 3 . 1 . 5 夏天不能立即涂抹培养基时， 应将拭子试管立即放人冰箱或冰瓶内。 鼻粘液应在当天( 最好在 儿小时内) 涂抹培养基， 拭子仍保存于4 'C 冰箱以备复检。 2 . 3 - 1 - 6 采取鼻汁时病猪往往喷嚏， 术者应注意手的消毒， 防止材料交叉污染。 2 . 31 . 7 解剖猪时， 应同时采取鼻腔后部( 至筛板前壁) 和气管的分泌物及肺组织进行培养。鼻锯开术 部及鼻锯应火焰消毒， 由鼻断端插人拭子直达筛板， 采取两侧鼻腔后部的分泌物。由声门插人拭子达气 管下部， 在气管壁旋转拭子取出气管上下部的分泌物。在肺门部采取肺组织， 如有肺炎并在病变部采取 组织块; 也可以用拭子插人肺断面采取肺汁和破碎组织。 2 . 3 . 2 分离培养 2 - 3 . 2 门培养基制备 血红 _ 素峡喃锉酮改良麦康凯琼脂( H F MA ) ， 新霉素洁霉素血液马丁琼脂( N I . H MA ) , 绵羊血改良鲍 姜氏琼脂， 三糖铁脉半固体高层培养基， 配制方法见附录B e 2 . 3 . 2 . 2 操作 所有病料都直接涂抹在已干燥的分离平板上 分离支气管败血波氏杆菌使用血红素峡喃哇酮改良 麦康凯琼脂( H F M八) 平板( 见第 B . 1 章) ， 分离多杀巴氏杆菌使用新霉素洁霉素血液马丁琼脂C NI . H - M A ) 平板( 见第B . 2 章) 。 应尽量将棉拭子的 全部分泌物浓厚涂抹于平板表面， 将组织块的各断面同 样 浓厚涂抹。重要的检疫， 如种猪检疫， 对每份鼻腔病料应涂抹每种分离平板2 个。不同种分离平板不能 混涂同一拭子( 因抑菌剂不同) 。 对伴有肠道感染( 腹泻) 的或环境严重污染的猪群， 每份鼻腔病料可用一 个平板作浓厚涂抹， 另一个平板作划线接种， 即先将棉拭子病料在平板的一角作浓厚涂抹， 然后以铂圈 作划线稀释接种。 2 . 3 . 2 . 2 门猪支气管败血波氏杆菌的分离培养 将接种的H F MA平板于3 7 0C 培养4 0 h - - 7 2 h , 猪支气管败血波氏杆菌菌落不变红， 直径约 1 m m-2 m m左右， 圆整、 光滑、 隆起、 透明， 略呈茶色， 较大的菌落中心较厚呈茶黄色， 对光观察呈浅蓝 色。 用支气管败血波氏杆菌O - K抗血清作活菌平板凝集反应呈迅速的典型凝集。 有些样品菌落粘稠或 十韧， 在玻片上 不能做成均匀菌液， 须移植一代才能正常进行活菌平板凝集试验。 未发现典型菌落时， 对 N Y/ 'r 5 4 6 - - 2 0 0 2 所有可疑菌落， 均需作活菌平板凝集试验， 以防遗漏。 如菌落小， 可移植增菌后进行检查。 如平板上有大 肠杆菌类细菌( 变红、 粉红或不变红) 或绿脓杆菌类细菌( 产生或不产生绿色素但不变红) 覆盖， 应将冰箱 保存的棉拭子再进行较稀的涂抹或划线培养检查， 或重新采取鼻汁培养检查。 2 . 3 . 2 . 2 . 2 产毒素性多杀巴氏杆菌的分离培养 将接种的N L H MA平板于3 7 C 培养1 8 h -2 4 h ， 根据菌落形态和荧光结构， 挑取可疑菌落移植鉴 定。多杀巴氏杆菌菌落直径约1 m m-2 m m, 圆整、 光滑、 隆起、 透明， 菌落或呈粘液状融合; 对光观察有 明显荧光; 以4 5 C 折射光线于暗室内在实体显微镜下扩大约 1 0 倍观察， 呈特征的桔红或灰红色光泽， 结构均质 即F o 荧光型或F o 类似菌落。 间有变异型菌落， 光泽变浅或无光泽， 有粗纹或结构发粗， 或夹 有浅色分化扇状区等。 平板目的菌菌落计数分级见附录Co 2 . 13 分离物的特性鉴定 2 . 13 门猪支气管败血波氏杆菌分离物的特性鉴定 2 . 3 . 31 . 1 一般特性鉴定 革兰氏阴性小杆菌。 氧化和发酵( ( ) / F ) 试验阴性， 即非氧化非发酵严格好氧菌。 具有以下生化特性 ( 一般3 7 C 培养3 一5 d 记录最后结果) : 。 ) 糖管: 包括乳糖、 葡萄糖、 蔗糖在内的所有糖类不氧化不发酵( 不产酸、 不产气) ， 迅速分解蛋白 陈明显产碱， 液面有厚菌膜。 b ) 叫试验阴性。 c ) 不产生硫化氢或轻微产生。 d ) 甲基红( MR ) 试验及维培( V P ) 试验均阴性。 e ) 还原硝酸盐。 f ) 分解尿素及利用构摊酸， 均呈明显的阳性反应。 9 ) 不液化明胶。 卜 ) 石蕊牛乳产碱不消化。 1 ) 有运动性， 在半固体平板表面呈明显的膜状扩散生长， 扩散膜边沿比较光滑; 但 0 . 0 5 肠-0 . 1 % 琼脂半固体高层穿刺3 7 C培养， 只在表面或表层生长， 不呈扩散生长。 2 . 111 . 2 菌相鉴定 将分离平板上的典型单个菌落划种于绵羊血改良鲍姜氏琼脂( 见第B . 4 章) 平板( 凝结水已干燥) 1 -. , W 3 7 C 潮湿温箱中培养 4 0 h -4 5 h按下列要求分相: ) I 相菌落小， 光滑， 乳白色， 不透明， 边沿整齐， 隆起呈半圆形或珠状， 钩取时质地致密柔软， 易 制成均匀菌液。菌落周围有明显的R 溶血环。菌体呈整齐的革兰氏阴性球杆状或球状。活菌 玻片凝集定相试验， 对K抗血清呈迅速的典型凝集， 对0抗血清完全不凝集。 工 相菌感染病例 在平板上， 应不出现中间相和皿 相菌落。 b ) m 相菌落扁平， 光滑， 透明度大， 呈灰白色， 比I 相菌落大数倍， 质地较稀软， 不溶血， 活菌玻片 凝集定相试验， 对0抗血清呈明显凝集， 对K抗血清完全不凝集。 c ) 中间相菌落形态在 I 及I 相之间， 对K及0抗血清都凝集。中间相及. 相菌， 以杆状为主。 2 . 3 . 3 . 2 产毒素性多杀巴氏杆菌分离物的特性鉴定 2 . 3 . 3 . 2 . 1 一般特性鉴定 2 . 13 . 2 门门革兰氏阴性小杆菌， 呈两极染色。不溶血， 无运动性。具有以下生化特性: a ) 糖管: 对蔗糖、 葡萄糖、 木糖、 甘露醇及果糖产酸， 对乳糖、 麦芽糖、 阿拉伯糖及杨昔不产酸。 b ) V P , MR 、 尿素酶、 拘椽酸盐利用、 明胶液化、 石蕊牛乳均为阴性。 c ) 不产生硫化氢。 d 硝酸还原及叫噪试验均为阳性。 N Y/ 'r 5 4 6一 2 0 0 2 2 . 112 . 1 . 2 对分离平板上的可疑菌落， 也可先根据三糖铁服半固体高层( 见第B . 3 章) 小管穿刺生 长 特 点 进 行 筛 检 。 将 单 个 菌 落 以 接 种 针 由 斜 面 中 心 直 插 人 底 层， 轻 轻 由 原 位 抽 出 .， 再 在 斜 面 上 轻 轻 涂 抹 ， 3 7 C 斜放培养1 8 h 。 多杀巴氏 杆菌生长特点: a ) 沿穿刺线呈不扩散生长， 高层变桔黄色; b ) 斜面呈薄苔生长， 变桔红或桔红黄色; c ) 凝结水变桔红色， 轻浊生长， 无菌膜; d ) 不产气、 不变黑。 2 . 3 - 3 - 2 . 2 皮肤坏死毒寮产生能力检查 体重3 5 0 g -4 0 0 g 健康豚鼠， 背部两侧注射部剪毛( 注意不要损伤皮肤) ， 使用 1 m l注射器及 4 - 1 -6 号针头， 皮内注射分离株马丁肉汤3 7 'C 3 6 h ( 或 3 6 h -7 2 h ) 培养物 。1 mL 。注射点距背中线 1 . 5 c m， 各注射点相距2 c m以上。 设阳性及阴性参考菌株和同批马丁肉汤注射点为对照， 并在大腿内 侧 肌注硫酸庆大霉素4 万单位( 1 m l ) 。 注射后2 4 h , 4 8 h及7 2 h 观察并测量注射点皮肤红肿及坏死区的 大小 坏死区直径1 . 0 c m左右为皮肤坏死毒素产生( D N T ) 阳性， 小于0 . 5 c m为可疑， 无反应或仅红肿 为阴性。 可疑须复试。 阳性株对照坏死区直径应大于1 . 0 c m， 阴性株及马丁汤对照应均为阴性。 阳性结 果记为D N T I- ， 阴性结果记为D NT-, 2 . 3 - 3 - 2 . 3 英膜型简昌鉴定方法 2 . 112 . 11 透明质酸产生试验( 改良C a r t e r 氏法) 在。 . 2 % 脱纤牛血马丁琼脂平板上于中线以直径2 m m铂圈均匀横划一条已知产生透明质酸酶的 金黄色葡萄球菌( A T C C 2 5 9 2 3 ) 或等效的链球菌新鲜血斜培养物， 将每株多杀巴氏杆菌分离物的血斜 面过夜培养物， 与该线呈直角的线两侧， 各均匀划种一条同样宽的直线， 并设英膜A型及D型多杀巴氏 杆菌参考株作对照。 3 7 C 培养2 0 h , A型株临接葡萄球菌菌苔应产生生长抑制区， 此段菌苔明显薄于远 端未抑制区， 荧光消失， 长度可达 1 c m， 远端菌苔生长丰厚， 特征荧光型( F o 型) 不变， 两段差别明显。D 型株则不产生生长抑制区， F o型荧光不变。个别A型分离物不产生明显多量的透明质酸， 本法及叮吮 黄试验时判定为D型， 间接血凝试验( S a w a d a氏法) 则判定为A型。 2 . 112 . 12 叮吮黄试验( 改良C a r t e r 氏法) 分离株的。 . 2 % 脱纤牛血马丁琼脂1 8 h -2 4 h 培养物， 括取菌苔， 均匀悬浮于P H 7 . 0 0 . 0 1 m o l / I 磷酸盐缓冲生理盐水中。取。 . 5 m 1细菌悬液加人小试管中， 与等容量0 . 1 %中性叮吮黄蒸馏水溶液振 摇混合， 室温静置。D型菌可在5 m i n 后自 凝， 出现大块絮状物， 3 0 m i n 后絮状物下沉， 上清透明。其他 型菌不出现或仅有细小的颗粒沉淀， 上清浑浊。 2 . 4 猪支气管败血波氏杆菌K凝集抗体检查 2 . 4 . 1 使用须知 2 . 4 . 1， 本试验是使用猪支气管败血波氏杆菌 工 相菌福尔马林死菌抗原， 进行试管或平板凝集反应检 测感染猪血清中的特异性K凝集抗体。其中平板凝集反应适用于对本病进行大批量筛选试验， 试管凝 集反应作为定性试验。 2 . 4 . 1 . 2 哺乳早期感染的仔猪群， 自1 月龄左右， 逐渐出现可检出的K抗体， 到5 -8 月龄期间， 阳性 率可达9 0 %以上， 以后继续保持阳性。 最高K抗体价可达1 : 3 2 0 - 6 4 0 或更高， 3 周龄以上的猪一般可 在感染后1 0 d -1 4 d出现K抗体。 2 . 4 . 1 . 3 感染母猪通过初乳传递给仔猪的K抗体， 一般在出生后 1 -2 个月内消失， 注射过猪支气管 败血波氏杆菌菌苗的母猪生下的仔猪， 则被动抗体延缓消失。 2 . 4 . 2 试验材料 2 . 4 - 2 . 1 抗原。 2 . 4 . 2 . 2 标准阳性和阴性对照血清。 2 . 4 . 2 . 3 被检血清: 应新鲜， 无明显蛋白凝固， 无溶血现象和无腐败气味。 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 2 . 4 - 2 . 4 稀释液: 为p H 7 . 0 磷酸盐缓冲盐水。 配方如下: 磷酸氢二钠( N a , H P O , · 1 2 H , O ) 2 . 4 g 或磷酸 氢二钠( N a , H P O , ) 1 . 2 g ) , 抓化钠( N a C I ) 6 . 8 g , 磷酸二氢钾( K H I P O , ) 0 . 7 g , 蒸馏水 1 0 0 0 m L ， 加温溶 解， 两层滤纸滤过， 分装， 高压灭菌。 2 . 4 . 3 操作方法及结果判定 2 . 4 . 3 门试管凝集试验操作程序( 为参考使用方法) 2 . 4 . 3 . 1 . 1 被检血清和阴、 阳性对照血清同时置 5 6 'C水浴箱中灭能 3 0 m i n . 2 - 4 . 11 . 2 血清稀释方法: 每份血清用一列小试管( 口径8 m m-1 0 m m) ， 第一管加人缓冲盐水 0 . 8 m I ， 以后各管均加人。 . 5 m l ， 加被检血清0 . 2 m l于第一管中。 换另一支吸管， 将第一管稀释血清充分 混匀， 吸取。 . 5 m L加人第二管， 如此用同一吸管稀释， 直至最后一管， 取出。 . 5 m L弃去。 每管有稀释血 清。 . 5 m l 。 一般稀释到1 : 8 0 ， 大批检疫时可稀释到1 ， 4 0 。 阳性对照血清稀释到1 ， 1 6 0 3 2 0 ; 阴性对 照血清至少稀释到1 : 1 0 , 2 . 4 - 3 . 1 . 3 向上述各管内添加工作抗原。 . 5 m L ， 振荡使血清和抗原充分混匀。 2 . 4 . 11 . 4 放人 3 7 C温箱 1 8 h -2 0 h 。然后取出在室温静置 2h ， 记录每管的反应。 2 . 4 . 3 . 1 . 5 每批试验均应设有阴、 阳性血清对照和抗原缓冲盐水对照( 抗原加缓冲盐水 0 . 5 m L ) , 2 . 4 - 3 . 1 . 6 结果判定 “ 十+” ， 表示1 0 0 %菌体被凝集。液体完全透明， 管底覆盖明显的伞状凝集沉淀物。 “ +十” ， 表示 7 5 %菌体被凝集。液体略呈浑浊， 管底伞状凝集沉淀物明显。 “ +” ， 表示5 0 %菌体被凝集。液体呈中等程度浑浊， 管底有中等量伞状凝集沉淀物。 “ +” ， 表示 2 5 %菌体被凝集。液体不透明或透明度不明显， 有不太显著的伞状凝集沉淀物。 “ 一” ， 表示菌体无凝集。液体不透明， 无任何凝集沉淀物。细菌可能沉于管底， 但呈光滑圆沱状， 振 荡时呈均匀浑浊。 当抗原缓冲盐水对照管、 阴性血清对照管均呈阴性反应， 阳性血清对照管反应达到原有滴度时. 被 检血清稀释度妻1 0 出现“ +” 以上， 判定为猪支气管败血波氏杆菌阳性反应血清。 2 . 4 - 3 . 2 平板凝集试验 2 . 4 . 3 . 2 . 1 被检血清和阴、 阳性对照血清均不稀释。可以不加热灭能。 2 . 4 . 3 . 2 . 2 干清洁的玻璃板或玻璃平皿上， 用玻璃笔划成约2 c m ， 的小方格。 以1 m l吸管在格内加一 小滴血清( 约。 . 0 3 m L ) ， 再充分混合一铂圈( 直径8 m m ) 抗原原液， 轻轻摇动玻璃板或玻璃平皿， 于室温 ( 2 0 C -2 5 'C ) 放置 2 m i n ， 室温在2 0 C以下时， 适当延长至5 m i n , 2 . 4 . 3 . 2 . 3 每次平板试验均应设有阴、 阳性血清对照和抗原缓冲盐水对照。 2 . 4 - 3 - 2 . 4 结果判定: “ +” ， 表示 1 0 0 %菌体被凝集。 抗原和血清混合后2 m i n内液滴中出现大凝集块或颗粒状凝 集物， 液体完全清亮。 “ +” ， 表示约7 5 %菌体被凝集。在2 m i n内液滴有明显凝集块， 液体几乎完全透明。 “ +” ， 表示约5 0 %菌体被凝集。液滴中有少量可见的颗粒状授集物， 出现较迟缓， 液体不透明。 “ +” ， 表示 2 5 %以下菌体被凝集。液滴中有很少量仅仅可以看出的粒状物， 出现迟缓， 液体浑浊。 “ 一” ， 表示菌体无任何凝集。液滴均匀浑浊。 当阳性血清对照呈“ +” 反应， 阴性血清和抗原缓冲盐水对照呈“ 一” 反应时， 被检血清加抗原 出现“ +” 到“ +” 反应， 判定为猪支气管败血波氏杆菌阳性反应血清。“ 十+” 反应判定为疑 似， “ +” 至“ 一” 反应判定为阴性。 3 诊断方法的综合应用及判定 对猪群的检疫应综合应用临床检查、 细菌检查及血清学检查， 并对病猪作病理解剖检查。检疫猪群 诊断有鼻漏带血、 泪斑、 鼻塞、 喷嚏， 特别有鼻部弯曲等颜面变形的临床指征病状， 鼻腔检出支气管败血 NY / T 5 4 6 -2 0 0 2 波氏杆菌 工 相菌及/ 或产毒素性多杀巴氏杆茵， 判定该猪群为传染性萎缩性鼻炎猪、 群 具有鼻甲骨萎缩 病变无论有或无鼻部弯曲等症状的猪， 诊断为典型病变猪。检出支气管败血波氏杆菌 工 相菌及/ 或产毒 素性多杀巴氏杆菌的猪， 诊断为病原菌感染、 排菌猪检出猪支气管败血波氏杆菌K凝集抗体的猪， 判 定为猪支气管败血波氏杆菌感染血清阳转猪疫群中的检菌及血清阴性的外观健康猪， 需隔离多次复 检， 才能作最后阴性判定 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 附录A ( 资料性附录) 且腔横断面皿甲骨婆缩程度分级 A 门正常( “ 一” ) 两侧鼻甲骨对称， 骨板坚硬， 正常占有鼻腔容积( 间腔正常) ， 鼻中隔正直。两侧鼻腔容积对称， 鼻腔 纵径大于横径。 A. 2 可疑( “ ? ” ) 鼻甲骨形态异常( 变形) 不对称， 不完全占有鼻腔容积， 卷曲， 特别是腹卷曲疑有萎缩但肉眼不能判 定， 鼻中隔或有轻度倾斜 A . 3 轻度萎缩( “ +” ) 一侧或两侧卷曲主要是腹卷曲轻度或部分萎缩， 相应间腔加大; 或卷曲变小， 卷度变短， 骨板变粗， 相应间腔增大。也有轻度萎缩和变粗同时存在的病例。或伴有鼻中隔轻度倾斜或弯曲。表现出两侧或 背、 腹卷曲及其相应间腔的轻度不对称。 A . 4 中等婆缩( “ +” ) 腹卷曲基本萎缩， 背卷曲部分萎缩。 A . 5 重度婆缩( “ +” ) 腹卷曲完全萎缩， 背卷曲大部萎缩。 A . 6 完全婆缩( “ 十+十+” ) 背卷曲及腹卷曲均完全萎缩。 鼻甲骨中等萎缩到完全萎缩的病例， 间或伴有鼻中隔的不同程度的歪斜和弯曲， 两侧鼻腔容积不对 称， 或鼻腔的横径大于纵径。严重者鼻腔周围骨( 鼻骨、 上额骨) 可能萎缩变形。 卷曲萎缩明显以至消失者不难判定， 但是腹卷曲的轻度萎缩有时难于判定， 且易与发育不全混淆 卷曲往往只有变形而看不到萎缩。 鼻甲骨轻度萎缩与发育不全的鉴别: 腹鼻甲骨发育不全是腹卷曲小， 卷曲不全， 甚至呈鱼钩状， 但骨 板坚硬， 几乎正常占据鼻腔容积， 两侧对称， 其他鼻腔结构正常。 如背卷曲同时变形， 疑有萎缩， 鼻中隔倾 斜， 则分级为“ 可疑” 。 NY / T 5 4 6 -2 0 0 2 附录B ( 规范性附录) 培养基的制备 B . 1 血红素肤喃哇酮改良麦康凯琼脂( H F MA ) 培养基配制方法 B . 1 . 1 成分 B . 1 . 1 . 1 基础琼脂( 改良麦康凯琼脂) 蛋白陈2 0 o 氯化钠( N a C I ) 0 . 5 % 琼脂粉1 . 2 0 o 葡萄糖1 . 。 % 乳糖1 . 。 % 三号胆盐( o x o i d ) 0 . 1 5 % 中性红。 . 0 0 3 0 0 ( 1 %水溶液 3 m L / L ) 蒸馏水加至1 0 0 0 m L 加热溶化， 分装。 l 1 0 0C ( 7 0 k P a ) 2 0 m i n 灭菌， p H为7 . 0 -7 . 2 。 培养基呈淡红色。 贮存于室温或4 C 冰箱备用。 B . 1 门. 2 添加物 l o o 吠喃哇酮二甲基甲酞胺溶液。 . 0 5 m L / 1 0 0 m L ( 吠喃哇酮最后浓度为5 p g / m L ) 1 0 %牛或绵羊红血球裂解液1 mL ( 最后浓度为 1: 1 0 0 0 ) 4 C 冰箱保存备用。吠喃哇酮二甲基甲酞胺溶液临用时加热溶解。 B 门. 2 配制方法 基础琼脂水浴加热充分溶化， 凉至55'5 5 C-6 0 C， 加人峡喃哇酮二甲基甲酞胺溶液及红血球裂解液， 立即充分摇匀， 倒入平皿， 每个平皿2 0 m l . ( 平皿直径9 0 c m) 。 干燥后使用， 或贮4 C 冰箱一周内使用。 防 霉生长可加人两性霉素B 1 0 p g / m L或放线酮3 0 p g / m l . - 5 0 p g / m L 。 对污染较重的鼻腔拭子， 可再加 人壮观霉素5 p g / m L -1 0 p g / m L ( 活性成分) 。 B 门， 3 用途 用于鼻腔粘液分离支气管败血波氏杆菌。 B . 2 新霉紊洁耳紊血液马丁琼脂( N L H MA ) 培养基配制方法 B . 2 . 1 成分 马T琼脂p H 7 . 2 -7 . 4 脱纤牛血0 . 2 % 硫酸新霉素2 p g / m l . 盐酸洁霉素( 林可霉素)1 p g / m L B . 2 . 2 配制方法 马丁琼脂水浴加热充分溶化， 凉至约5 5 加人脱纤牛血、 新霉素及洁霉素， 立即充分摇匀， 倒平板， 每个平皿 1 5 m 工 . -2 0 m L ( 平皿直径9 0 c m ) 干燥后使用， 或保存4 'C 冰箱一周内使用。 s . 2 . 3 用途 用于鼻腔粘液分离多杀巴氏杆菌。 N Y/ 'r 5 4 6 -2 0 0 2 B . 3 B . 3 三精铁服半固体商层培养基配制方法 . 1 成分 多型蛋白膝( p o l y p e p t o n e ) 牛肉膏 抓化钠( N a C I ) 磷酸二氢钾( K H 2 P O , ) 琼脂粉 硫代硫酸钠 硫酸亚铁钱 混合指示剂 葡萄糖 孚 L 糖 尿素 。 · 5 %酸性品红水溶液 注 : 混合指示剂配制 : 1 . 0 0 0 0 . 5 0 5 0 . 3 0 0 0 . 1 0 5 0 . 3 0 0 0 . 0 3 Y o 0 . 0 3 % 5 mL 0 . 1 0 5 1 . O 0 o 2 . 0 % 2 . 0 mL 0 . 2 %澳百里酚蓝( B T B ) 水溶液( 0 . 2 g B T B溶于5 0 m L酒精， 加熬馏水5 0 . 1 J 2 . 0 m l 0 . 2 %百里酚蓝( T B ) 水溶液( 0 . 4 g T B溶于1 7 . 2 m L 0 . 0 5 m o l / L氢氧化钠( N a O H ) ， 加燕馏水1 0 0 m l ， 再加水 稀释 I 倍) 1 . 0 m l B . 3 . 2 配制方法 将前7 种成分充分溶解于蒸馏水后， 修正p H为6 . 9 。 再加人混合指示剂， 葡萄糖、 乳糖及尿素， 充分 溶解。每支小试管分装 2 m L -2 . 5 m L ， 流动蒸汽灭菌1 0 0 m i n ， 冷却放成半斜面， 无菌检验 4 'C 冰箱保 存备用。 3 用途 用于筛检鼻腔粘液分离平板上的可疑多杀巴氏杆菌菌落。 绵羊血改良鲍姜氏琼脂培养基的配制方法 1 成分 1 门签础琼脂( 改良鲍典氏琼脂) 1 . 1 门马铃，漫出液 白 皮马铃薯( 去芽， 去皮， 切长条)5 0 0 g 甘油蒸馏水( 热蒸馏水 1 0 0 0 m L ， 甘油 4 0 m L ， 甘油最后浓度 1 %) 洗净去水的马铃薯条加人甘油蒸馏水， 1 1 9 'C-1 2 0 C( 1 0 3 k P a ) 加热3 0 m i n ， 不要振荡， 倾出上清液 B3.B.4B4B4B4 使用。 B . 4 . 1 . 1 . 2 琼脂液 抓化钠( N a C D 1 6 . 8 g ( 最后浓度0 . 6 0 o ) 蛋白 陈1 4 g ( 最后浓度。 . 5 0 0 ) 琼脂粉3 3 . 6 g ( 最后浓度1 . 2 % ) 蒸馏水加至2 1 0 0 m L 1 1 9 C-1 2 0 C( 1 0 3 k P a ) 加热溶解 3 0 m i n ， 加人马铃薯浸出液的上清液 7 0 0 m L ( 即两液比例为 7 5 写及 2 5 %) 0 混合， 继续加热溶化， 四层纱布滤过， 分装， 1 1 6 -C 3 0 m i n 。 不调p H, 高压灭菌后p H一般 为6 . 4 6 . 7 ， 贮于4 冰箱或室温备用。 备作斜面的基础琼脂加蛋白 脉， 备作平板的不加蛋白 脏 B . 4 . 1 . 2 脱纤绵羊血 N Y / T 5 4 6 -2 0 0 2 无菌新采取， 支气管败血波氏杆菌K和O凝集价均小于 1 : 1 0 ， 按 1 0 %浓度加人基础琼脂中 B . 4 . 2 配制方法 基础琼脂溶化后凉至约 5 5 C， 加人脱纤绵羊血， 立即充分混合， 勿起泡沫， 制斜面管或倒平板( 直径 9 0 c m平皿， 每皿2 0 m L ) ， 放4 C 冰箱约一周后使用为佳。 B . 4 . 3 用途 用于支气管败血波氏杆菌的纯菌培养及菌相鉴定。 3 8 2 N Y / 'r 5 4 6 -2 0 0 2 附录C ( 规范性附录) 分离平板 目的菌落计数分级 一目的菌落阴性。 +目的菌落 1 个1 0 个。 +目的菌落 n 个一5 。 个 +目的菌落 5 1 个一1 0 0 个。 +十+目的菌落 1 0 0 个以上。 a目的菌落密集成片不能计数。 X非目的菌( 如大肠杆菌、 绿脓杆菌、 变形杆菌等) 生长成片， 覆盖平板， 不能判定有无目的菌落