[水产标准]-SCT 3024-2004 腹泻性贝类毒素的测定 生物法.pdf

I C S B 5 0 6 7 . 0 5 0 Sc 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 S C / T 3 0 2 4 -2 0 0 4 腹泻性贝类毒素的测定生物法 D e t e r m i n a t i o n o f d i a r r h o e a s h e l l f i s h p o i s o n B i o a s s a y 2 0 0 4 一 0 1 一 0 7 发布2 0 0 4 一 0 3 一 0 1 实施 中华 人 民共 和 国农业 部发 布 S C A T 3 0 2 4 -2 0 0 4 o u青 本标准参考了日本厚生省推荐使用的腹泻性贝类毒素的测定方法。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位： 国家水产品质量监督检验中心、 中国水产科学研究院东海水产研究所。 本标准主要起草人： 王联珠、 袁骥、 李晓川、 冷凯良、 陈亚瞿、 蒋玫。 S CA T 3 0 2 4 -2 0 0 4 腹泻性贝类毒素的测定生物法 1 范围 本标准规定了腹泻性贝类毒素 （ D S P ）的测定方法生物法。 本标准适用于软体动物贝类可食部分中腹泻性贝类毒素 （ D S P )的测定。 2 原理 用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后，再以1 吐温- 6 0 生理盐水溶解 残留物，注射小鼠，观察存活情况，计算其毒力。 3 试剂和材料 丙酮 （ 分析纯） 。 乙醚 （ 分析纯） 。 1 吐温一 6 0 生理盐水：称取1 . 0 g 吐温- 6 0 ，溶于生理盐水 （ 0 . 8 % N a C l ）中，并定容至1 0 0 . 0 ICJq口 QQ口Q口 mL. 4 仪器和设备 4 . 1 旋转蒸发器。 4 . 2 均质器。 4 . 3 磨口烧瓶：圆底，5 0 0 m L , 1 0 0 m L o 4 . 4 布氏漏斗：0 1 0 0二 。 4 . 5 分液漏斗：具塞，5 0 0 m L o 4 . 6 天平：感量0 . 1 g o 4 . 7 刻度试管：1 0 mL，具塞。 4 . 8 冰箱：0 一5 和一1 5 一一2 0 C。 4 . 9 注射器：1 mL o 4 . 1 0 注射器针头： 8 # 。 4 . 1 1 小鼠：体重为1 6 g - - 2 0 g 的健康1 C l x 系雄性小鼠。 5 检样的制备 5 . 1 生鲜带壳的贝类 a )用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉， 切勿割破肉体； b )收集贝肉，沥水5 m i n ， 捡出碎壳等杂物， 迅速冷冻，贮藏备用； c ）注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺 （ 又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色） 。 开壳前不能加热或用麻醉剂。 5 . 2 冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样品 （ 带壳或去壳的）呈半冷冻状态，按 5 . 1方法清洗、开壳、淋洗、 S C / T 3 0 2 4 -2 0 0 4 取肉。 5 . 3 取样 a )可以切取中肠腺的贝类 （ 扇贝、贻贝、牡a等） ，称取2 0 0 g 贝肉后，仔细切取全部中肠腺， 将中肠腺称重后细切混合作为检样， 注意不要使中肠内容物污染案板； b )对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合， 作 为检样； c )为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5 的次氮酸钠 溶液中浸泡 1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也应用5 的次氯酸钠溶液处 理 。 6 提取 6 . 1取5 . 3 a ） 处理的中 肠腺， 或5 . 3 b ) 处理的2 0 0 g 贝肉置于 均质杯内， 均质2 m in . 6 . 2 加3 倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量 丙酮再次抽滤两次， 合并抽滤液。 6 . 3 将抽提液移人5 0 0 m L的磨口 烧瓶中， 减压浓缩 （ 旋转蒸发器， 5 6 r - ）去除丙酮，直至在液体 表面分离出油状物。 6 . 4 将浓缩液移入分液漏斗内，以1 0 0 ml - -2 0 0 m L乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡 （ 不 能生成乳浊液） ， 静置分层后， 去除水层 （ 下层） ，用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚 层移人2 5 0 m l 、 的磨口 烧瓶中， 减压浓缩 （ 旋转蒸发器， 3 5 C）去除乙醚。 6 . 5 以少量乙醚将浓缩物移入1 0 0 m l . 磨口烧瓶中， 再次减压浓缩去除乙醚。 6 . 6 以1 吐温- 6 0 生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到1 0 m L 。此时1 ml 、 试液相当于2 0 g 去壳贝肉的重量，以此悬浮液作为试验原液。 6 . 7 以试验原液注射小鼠，2 4 h内3 只均死亡时，需将试验原液进一步稀释， 再注射小鼠。稀释前， 应先振荡使溶液成均匀悬浮液，再取部分试液以1 吐温- 6 0 生理盐水稀释。 7 小 鼠试验 以振荡器使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液。 将每只小鼠称重，每三只小鼠为一组，分别将 1 mL试液注射到小鼠腹腔中。 同时， 另取三只小鼠作为对照组，注射1 m L1 吐温- 6 0 生理盐水于腹腔中。 观察自注射开始到2 4 h 后的小鼠存活情况，求出一组三只中死亡两只及两只以上的最小注 口门八0 ，了7了下了了了 射量。 7 . 5 小鼠注射腹泻性贝毒后的症状为运动不活泼，大多呼吸异常，致死时间长。 8 结果计算和表述 8 . 1 毒力的计算 使体重1 6 g - 2 0 g 的 小鼠在2 4 h 死亡的 毒力为1 个小鼠 单位 （ M U ) o 样品中D S P 毒力的计算，按表1 选择2 4 h 内死亡两只及两只以上鼠的最小注射量及最大稀释倍 数进行计算。 8 . 2 注射里与毒力的关系 注射量与毒力的关系见表 1 0 s c / T 3 0 2 4 -2 0 0 4 表 t 注射里与毒力的关系 试验液 注射量 mL 检样量“毒力 MU / g 92010切55 原液 原液 2 倍稀释液 2 倍稀释液 4 倍稀释液 4 倍稀释液 8 倍稀释液 8 倍稀释液 1 6 倍稀释液 1 6 倍稀释液 以中肠腺为检样时， 1. 2 5 0. 6 2 5 相当于含有中肠腺的去壳贝肉量。 S c / T 3 0 2 4 -2 0 0 4 附录A （ 资料性附录） 本标准与日本厚生省标准的技术差异及原因 表A . 1 为本标准与口 本厚生省标准的技术差异及原因一览表。 表A . 1 本标准与日 本厚生省标准的技术差异及原因 本标准的章条技术性差异原因 封面、 前言、标准的全文 原方法标准的格式与此完全不同 文 字叙述中有部分改动，将原文， I ， 的大段文字 修改为逐条叙述 原标礁为 “ 必要时，对试验溶液可做进一步稀 释” ，现改为 “ 以试验原液注射鼠时， 2 4 h内3 只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射 鼠” 标准格式采用 G B / ' r 1 . 1 -2 0 0 0 的规定 5 章 一9章 按 G B / T 1 . 1 -2 0 0 0的要求，将标准条文细化， 使其更有逻辑性、更有条理， 使用便捷 更清楚说明需要稀释时的情况， 便于试验时的操 6 7