γ-干扰素对兔胆总管愈合过程中α-平滑肌动蛋白表达的影响.pdf

第 4 0 卷第 1 期 2 0 0 6 年 2 月 哈尔 滨医科 大学学 报 J OU R N A L O F 1 I A RB I N ME DI C A L U N I V E t t s 1 T Y V o l . 4 0 , N o. I F e b2 ( K 足 1 7 一 干扰素对兔胆总管愈合过程中a 一 平滑肌 动蛋 白表达的影响 王 秋实， 吴德全 ， 孙凌宇 ( 哈尔滨医科大学第二临床医学院 普外科，黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 9 1 ) 摘要 目的 观察Y -干扰素( U N - Y ) 对胆总管损伤愈合过程中， 平滑肌动蛋白( a - S M A ) 表达的影响， 为临床防 治胆管狭窄寻求一条新的途径。方B制作兔肝外胆管损伤修复模型 1 6 只， 随机分为实验组和对照组各 9只， 实 验组每天肌注I M- 1 1 0 万N / k g ， 对照 组肌注 等量生理盐水， s 周后处死动物， 取材， 行H E 染色和， S M A 免疫组化染 色， 图像分析仪定量分析。摊果实验组 a - S M A单位面积分光密度均与对照组有显著性差异。祛格Y - 干扰素通 过抑制 a - S M A的表达， 抑制胆道挛缩， 减轻胆总管愈合过程中的胆道狭窄。 【 关键词Y - 干扰素; 平滑肌动蛋白; 肌成纤维 细胞; 胆管损伤 中图分类号1 R一3 3 2 文献标识码1 A 文章编号1 1 0 0 0 - 1 9 0 5 ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 3 3 一 0 2 E ff e c t o f i n t e r f e r o n - ' y o n e x p r e s s i o n o f a - s m o o t h m u s c l e a c t i n i n h e a li n g p r o c e s s o f b i le d u c t W A N G Q iu - s h i , W U D e - q u a n , S U N L n g - y u ( D e p a r t m e n t of S i ng e r ) ， T h e S e c o n d C l i n i c a l C o l le g e , H a r b in M e d ic a l U n i v e r s it y , H a r b i n 1 5 0 0 8 1 , C h in a A b s t r a c t : O b j e c t iv e T o o b s e r v e t h e e f fe c t o f i n t e r f e ro n - y ( I N F - y ) o n t h e e x p re s s i o n o f a - s m o o t h m u s c l e a c - t in ( a - S M A ) in th e h e a l in g p r o c e s s o f th e b il e d u c t . Me t h o d s S i x t e e n r a b b i t - b il e - d u c t - i n j u ry m o d e ls w e re c o n s tr u c te d . T h e y w e re d e v i d e d i n t o t w o g rou p s . O n e，e x p e r im e n t a l g r o u p w h i c h*。 in j e c t e d o f I F N - y ( 1 0 0 0 0 1 U / d - k g ) . T h e o t h e r w a s c o n t ro l g ro u p . A ll r a b b i ts w e r e s a c r i fi c e d a t t h e e ig h t h w e e k . T h e e x p re s s i o n o f a - S M A i n th e a n a s t o m o t i c t is s u e w a s o b s e r v e d 场i n u n u n o p a t h o l o g y a n d im a g e d a n a l y s a t o r q u a n t i ta t i v e a n a l y - s i s . R e s u lt s T h e re w a s s ig n if c a n t d iv i a t io n b e t w e e n t h e e x p e r im e n t a l g ro u p a n d t h e c o n t r a g ro u p o n t h e i n t e - g r a l o p t i c d e n s i ty p e r s t a n d a r d a r e a . C o n c l u s i o n T h e e x p r e s s i o n o f a - S M A c a n b e i n h i b it e d 场I N F - y . T h i s p ro v i d e s a n i n v i v o b a s i s f o r I N F - Y t o in h i b i t b i l e d u c t re s te n o s i s . K e y w o r d s : i n t e r f e ro n - y ; s m o o t h m u s c l e s a c t i n ; m y o fi b m b l a s t ; b i l e d u c t i n j u ri e s 良性胆管狭窄的处理是胆道外科的一大难题， 术后突 出表现为胆道瘫痕性挛缩和管腔狭窄， 尤以 肝门部或肝门部以上的胆管狭窄为著。胆总管属于 纤维弹性管道， 愈合过程中勃膜下大量原有的纤维 细胞转化为功能活跃的成纤维细胞， 导致胶原纤维 的 大量合成。 成纤维细胞在局部刺激下还可转 化为 肌成纤维细胞( M F B ) ， 导致胆管瘫痕挛缩。1 F N - Y 是 活化的T 淋巴细胞产生的一种免疫调节因子 ， 近年 来发现 I F N - ,/ 体内及体外均抑制成纤维细胞的合成 及胶原的分泌， 抑制成纤维细胞 a - S N L 、 的表达， 减 少M F B的 合成 从而抑制疲痕的 挛缩。 本实验旨在 通 过建 立兔肝外胆管损伤修复模型， 观察在胆道愈 合 过程中】 F N - r 对a - S M A 表达的影响， 为临床防治 胆道狭窄 探索一条新的途 径。 材料与方法 收稿日 期 2 0 0 5 一H一 田 作者简介7 王秋实( 1 9 7 9 一)男， 黑龙江哈尔滨人， 硕士研究生。 ， 通 讯作 者 1 . 1 胆道狭窄动物模型的建立、 分组 取健康雄性哈尔滨大白兔( 哈尔滨医科大学动 物实验中心提供) 1 6 只， 体重2 . 3 一 2 . 7 k g ， 月龄4 - - 5 月， 普通饲料分笼饲养。实验动物以2 . 5 %戊巴妥 钠l m l / k g 静脉麻醉， 经上腹正中 切口 进腹， 首先距 十 二指肠上缘2 c m处游离出胆总管， 上下游离范围 不超过 l c m, 沿横向切开胆总管前壁， 范围不超过胆 总管两侧纵轴， 约为其周长的 1 / 3 。用显微外科技术 哈尔 滨医科大 学学报第 40 卷 以8 一 0 无损伤缝线作私膜对钻膜外翻全层吻合， 针 距0 . 6 mm ， 边距0 . 3 一 。 . 4 nun 。 术毕探查吻合口无渗 漏后 关腹， 术后每天肌注庆大霉素4 万U 预防感染 治 疗3d。建模成功后实验动物随机分为实验组和 对照组各 8 只: 实验组术后每天肌注 N . 袱购 自上 海生物制品研究所) 10万U/k g ， 对照组术后肌注等 量生理盐水。 1 . 2 标本制备及病理学检查 各组实验动物在术后8 周， 空气栓塞法处死动 物。 剪取胆总管吻合口及上下 I c m胆管组织， 生理 盐水冲洗管腔内胆汁， 10%中 性甲 醛固定， 常规脱 水、 透明、 浸蜡、 包埋制成蜡块， 沿胆总管横断面切 片， 制成5 脚 厚度的连 续切片 分别行IIE 染色 和免 疫组化染色。 1 3 免疫组化染色 采用sAB C 法， 第一抗体鼠 抗人平滑肌肌动蛋 白( 舰之 in( SmOO 目 1 )f l 拼 ) 单抗及 SAB C 试剂盒， D A B 试剂盒购自 武汉博士德公司。染色步骤: 石蜡 切片脱蜡和水化后， 蒸馏水冲 洗3 次， 每次5 二 n ; 3 % 新鲜配置的双氧水室温下孵育5 一 10 I ni l l 以阻断内 源 性过氧化物酶; 蒸馏水冲洗3 次， 每次5 而n ; 正常 山 羊血清封闭液37 孵育20 nun ， 不洗， 甩去多余液 体; 滴加单克隆抗体 PcNA ( 1 : 1 00) ， 。 一 咖。 ( 1 : 1 00) 4 湿盒过夜; PBS 冲洗3次， 每次 51 苗 川滴加生物素 标记羊抗鼠够 ， 37孵育30而 n ， PBS 冲洗3 次， 每 次5 而 11;滴加试剂S A B C ， 37 孵育30而 n ， P B S 冲 洗4 次， 每次S lmn ; 滴加新鲜配置D AB 显色液(l 耐蒸馏 水加A 、 B 、 C 试剂 各 1 滴) ， 室温显色， 显微镜下控制 显色时间， 蒸馏水冲洗; 苏木素轻度复染， 脱水， 透明 后中性树胶封片观察。 1 ， 4 计算机图 像分析 采用平均阳性染色面积百分比法: 图像采集: 使用计算机将免疫组化切片进行数码图像采集。 图 像分析: 使用图 像分析软 件( 江苏捷达8 01病理图 象分析系统) 对所采集的图 像进行分析: 首先， 使用 软件的“ 染色” 功能， 对感兴趣区内的所有阳性细胞 所占的 区域进行“ 染色” ， 这样， 图片 上所有阳 性细 胞 染色区域即被同一种颜色表示出来。然后， 利用软 件的 “ 擦除” 功能， 人工对照原图片， 将一些” 假阳性” 的染色区域擦除。结果输出: 每张切片随机选取 4 个染色区 域进行计算， 取其平均 值得到实验数据。 1 . 5 统计分析 数据用无 土 : 表示， 应用5 飞5 10. 0 统计软件进 行数据处理， 采用 检验， p 0 . 05认为差异有显著 J性。 2 结果 HE 染色光镜下见对照组胆管壁大量炎性细胞 浸润， 纤维组织增生明显， 实验组炎性细胞较少， 可 见纤维组织增生。S M A表达于肌成纤维细胞( M FB) 胞浆、 平滑肌组织。正常胆管表达于管壁少量平滑 肌组织。对照组有大量 a 5 卜 I A的表达， 阳性细胞数 较多， 染色较深。 实验组与对照组平均阳性染色面 积百分比比较， 有显著性差异( 9 . 81士 0 . 21) %和 ( 1 2 . 6 士 0 43) %， P 00 1 。 3 讨 论 正常胆管中成纤维细胞合成功能处于静止或不 甚活跃状态， 使胆管壁的基质处于平衡状态， 胆管损 伤后， 损伤部位的成纤维细胞发生表型改变、 功能活 化且大量增殖， 并向肌成纤维细胞转化， 不断产生大 量胶原等细胞外基质， 从而 使损伤部位发生纤维性 增厚、 瘫痕挛缩、 管腔狭窄， 这是损伤性胆管狭窄发 生的 主要原因。M FB 在超微 结构上兼有成纤维细 胞和平滑肌细胞两者特征， 细胞内富含微丝和大量 的 粗面内质网lJ， 微丝主要由肌动蛋白构成。 - S h L 、 作为 成纤维细 胞向M FB分化的标志， 实际上也 就成为M FB 的重要标志。 耿智敏图通过制作犬肝 外胆管损伤修复模型， 分别于术后 1 周、 3 周、 3 月、 6 月取材行S M A 免疫组化SP染色观察。结果S M A 表 达于术后 1 周至6 月表达均较强。肌成纤维细胞功 能活跃， 细胞外基质过度沉积， 结果导致旅痕性挛 缩， 管腔狭窄， 表明 5 呱气 及肌成纤维细胞是导致胆 道瘫痕性挛缩的主要原因。 F N 一 丫 由活性T 淋巴 细胞在炎症环境和免疫反 应中释放产生， 具有抗病毒、 抗肿瘤、 影响细胞增殖 和分化等多种生物学效应。体外实验中， I FN一 丫 可 以抑制 成纤维细胞增殖阁 及向 肌成纤维细 胞分化， 促进成纤维细胞凋亡闭， 通过下调工、 111型原胶原 m R N A 表 达减 少总 胶 原的 合 成 5， 同 时 还可以 抑制 肌 成纤维细胞在体外表达a- S h 认的11 J I N A及蛋白 产物 。 本实验观察到术后 8 周时， 实验组 Q 一 sMA平均 阳性染色面积百分比小于对照组， 表明 M FB 产生减 少， 提 示 任 N 一 了 抑制成纤维细胞向M F B的转化机制 可能是I F N 一 Y 调节了与瘫痕形成有关的正性细胞调 节因 子， 如T G F 书 、 ILI ， 这尚 待进一步研究。 参考文献 【 1 J七 丫 口PD， M 侧 习 山n hA G玉 1 吧 1“ ，成佣 1 】在叨 ， 1 比 刚 xk i叭ona 第 I 期 王秋实 等 7 -干扰素对兔胆总管愈合过程中Q 平滑肌动蛋白表达的影响 4j5j s m oo th m u s cl e a c t in e xp - io n切f ib ro b la s t e J . J C e R F h y a io l , 1 9 9 4 , 1 5 9 ( 1 ) : 1 6 1 - 1 7 5 . 耿智敏， 向国安， 韩庆卜平滑肌肌动蛋白( S M A ) 在胆道愈合过程 中的表达及意义【 J 肝胆外科杂志, 2 0 0 0 , 8 (4 ) :3 1 2 -3 1 3 D u an M R , B e - B . -f - l rt e d e m n i s th e l y u q ,h o k in e a n d 卜 In te r fe ro n 此 tmu o ld n e m s p m n ib le 佃id 五 1 it im o f 班a o b l a e t c 崛 e n p ro d u c ti o n a n d l a te b u t n o t e s r ly f ib r o b la s t p m l ife m ti o n J l .J E x p M o d , 1 9 8 5 , 1 6 2 ( 2 ) : 5 16 - 5 2 7 . 岑瑛， 严小蓉7 - 干扰素对增生性旅痕成纤维细胞影响的实验 研究【 J . 中国修复重建外科杂志， 1 9 9 9 , 1 3 ( 2 ) : 1 2 2 - 1 2 6 . Ji m in e a S A , F r ， n d lic h B , R c s e n b l J . S e lxti m in h ib iti m o f h m ra n d ip lo i d f ib ro b l am c o lla g e n sy n th es is 场in te d e m n a J l 一 J C li n In v es t , 1 9 8 4 ,7 4 ( 3 ) : 1 1 1 2 - 1 1 1 6 - D m m n u li m e A , B m rd t L R , A b d i u A , m成. a - m n a o th m a e c le w ti m is e x p r e a e=e d in a su b p q 刘. ti - o f c u l tu r e d an d c lo n ed M n o b la s ts a n d i s n m d id e te d b y Y - in te r fe ro n J . E cp C e lllt s, 1 9 9 2 , 2 0 1 ( 1 ) : 6 4 - 7 3 6 1 漏斗胸的外科治疗 张临 友“，王 秋实 ， ， 杨洪华 2 ，彭 海 ( 1 . 哈尔滨医科大学第二临床医学院 胸外科，黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 8 1 ; 2铁力市人民医院胸外科，黑龙江 铁力 1 5 2 5 0 0 ) 搁要 4岭总结分析漏斗胸矫治手术治疗经验。方a t 对1 9 9 5 年 1 月一2 0 0 5 年 5 月手术治疗的3 1 例病人进 行 分析。全 组手术行带腹直肌蒂胸骨翻转术。倍果 全组无死亡， 无明显手术并发症发生， 术后随访恢复良好。 赌格 适当的手术时机及矫治方法是保证手术成功的关键， 带蒂胸骨翻转法是漏斗胸矫正较为理想的手术方式。 关键词7 漏斗胸; 胸廓崎形; 矫治手术 中 图分类号l x 6 5 5 文献标识码I A 文章编号1 1 0 0 0 - 1 9 0 5 ( 2 0 0 6 ) 0 1 一 0 0 3 5 一 。 漏斗胸是一种小儿常见的胸壁畸形， 主要表现为胸骨体 向内凹陷， 其顶点常在胸骨体和剑突交接处， 使前胸下 部呈 漏斗状。由 于胸骨体下端向内 后进 行性凹陷， 使该处胸廓前 后径缩短， 胸腔容积减小 将影响患儿的心肺功能。畸形的 长期存在， 对患儿的心理也有一 定程度的损伤。所以 及时 的手术治疗是完全必要的。 我院1 9 9 5 年1 月一 2 0 0 5 年5 月 进行此类手术 3 1 例， 效果良好， 报告如下。 横断胸骨将肋软骨胸骨板附着胸廓内动静脉及腹直肌蒂顺 时针 1 8 0度翻转， 胸骨凸面向前， 用力将凸面削平， 镶于原 位。 两侧胸廓内 动静脉及腹直肌均呈“ x “ 形交叉。钢丝固 定胸骨断端。切除多余的肋软骨， 用丝线做端端缝合， 安放 胸骨后或胸腔引流管， 缝合胸大肌及皮肤切口， 胸带固定并 加压包扎。 2结 果 资 料 与 方 法 1 . 1 一般资料 全组3 1 例， 男 1 9例， 女 1 2 例。年龄2一1 9岁， 平均 9 . 8 岁。其中 I 例 1 3岁患者是 8 年前曾做过胸骨抬举术， 术后 复发。3 1 例中7例有心肺受压症状， 活动后胸闷气短; 2例 有反复上呼吸道感染史; 1 1 例出现不同的异常心电图， 多为 不完全形右束支传导阻滞， 窦性心率失常; 7 例脊柱侧弯。 畸形漏斗胸指数 2 . 3 一 2 . 9 0 1 .2 手术方法 3 1 例漏斗胸患者全部采用带腹直肌蒂胸骨翻转术m 手术在气管插管全麻下进行。自 胸骨 角稍上方至剑突 下1 . 2 c m作正中切口， 游离两侧皮肤及肌层， 显露凹陷的 胸骨及相 应后弯的肋软骨。保留腹直肌在剑突及肋软骨上的附着点， 适当解剖腹直肌， 于凹陷部稍外侧， 从肋弓开始逐条切断肋 骨或肋骨及 肋间肌至第2 肋间， 术中注意保护胸膜， 胸膜破 口 应及时修补， 如破口 较大时应放置胸腔闭式引流管。 在第 2 肋间游离该处胸廓内动静脉， 并达合适长度， 于第2肋间 术后胸廓稳定， 无反常呼吸。术后 5 例一侧气胸; 全组 切口均 工 1 甲愈合， 本组 3 1 例全部治愈， 畸形矫正良好， 术后 平均 1 0-1 4 天出院二全部病例均随访， 目前尚未发现复发 者 。 3讨 论 收摘日期 2 0 0 5 一 09一 加 作者简介张临友( 1 9 6 4 一) ， 男， 黑龙江尚志人， 主任医师， 硕士 博士研 究生导 师。 ， 通讯作 者 3 . I病 因 漏斗胸的病因至今尚不完全清楚 ， 多数认为是先天性因 素所致， 约有2 0 %一 3 7 %有家族性传染病史。近年来有人认 为与激素发育水平有关。在解剖学上是胸骨下部肋软骨( 第 3 一 7 肋骨) 过度向后方错位生长， 形成胸骨体及其邻接肋软 骨极度凹陷; 同时， 由于隔肌中心键发育过短， 胸骨剑突后方 连接的腹直肌韧带挛缩， 使下位胸骨体和剑突极度下陷。 3 . 2 手术年龄 国内外多数专家认为手术矫正时间以3 一 6岁为宜， 3 岁 以前畸形有自然矫正的可能, 3岁后胸廓畸形会逐渐加重， 甚至会引起脊柱侧弯。但也有专家提出手术最佳时机应选 择在6 -8 岁以后进行， 以免婴幼儿早期因接受广泛前胸廓 手术而阻碍胸廓发育和影响心肺功能。最大年龄并无限制 从精神的影响上考虑， 最好在学龄前手术。 ( 下转 3 9页)