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人参皂苷对糖尿病大鼠膈肌收缩特性的保护作用 王 蕾1， 2， 关宿东2， 邓松华1 2005 -09 -13 接收 基金项目： 安徽省教育厅自然科研计划项目 （编号： 2003KJ002ZC） 作者单位： 1 安徽医科大学病生教研室， 合肥 230032 2 蚌埠医学院生理教研室， 蚌埠 233003 作者简介： 王 蕾， 女， 34 岁， 在读研究生， 讲师； 邓松华， 男， 52 岁， 教授， 硕士生导师 摘要 目的 研究人参皂苷对糖尿病 （DM） 大鼠膈肌功能 的保护作用。方法 对链脲菌素诱导的 DM 大鼠模型予以 人参皂苷腹腔注射 4 周后， 应用离体大鼠膈肌条， 测定其单 收缩张力 （Pt） 、 最大强直张力 （P0） 、 力频率曲线、 疲劳指 数 （FI） 的变化； 检测膈肌组织中的超氧化物歧化酶 （SOD） 活 性和丙二醛 （MDA） 含量的变化， 并在电镜下观察超微结构 的改变。结果 DM 组膈肌的 Pt、 P0、 FI 显著降低 （P 0. 01） ， 在给予 10、 20、 40、 60、 100 Hz 刺激时， 膈肌张力显著 降低 （P 0. 01） ； 膈肌组织中 SOD 活力显著降低 （P 0. 01） ， MDA 含量显著增加 （P 0. 01） ； 电镜下， 肌小节和线 粒体形态改变， 而人参皂苷可抑制上述现象。结论 人参皂 苷对 DM 膈肌的损伤有保护作用。 主题词 糖尿病/ 药物疗法； 膈/ 药物作用； 人参皂苷/ 药理 学； 大鼠 中图分类号 R 284. 1；R 587. 1；R 322. 44 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 01 -0035 -03 糖尿病 （diabetes mellitus， DM） 是遗传和环境因 素联合作用所致的一种全身慢性代谢病。随着人们 生活水平的提高和人口的老龄化， DM 已成为现代 疾病中的第二杀手， 严重威胁人类的健康。骨骼肌 是全身利用葡萄糖最重要的组织之一， 是 DM 损害 的主要靶位 1。膈肌作为重要的呼吸肌， DM 对其 结构和功能均有损伤 2 -4。人参皂苷 （GS） 是人参 的主要成分， 具有防治缺血性疾病、 抗衰老、 抗疲劳、 抗癌、 益智等功能。该研究旨在探讨人参皂苷对 DM 大鼠膈肌的保护作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实验动物 选用成年 SD 大鼠 （200 250 g） ， 由安徽医科大学实验动物中心提供， 普通级， ,、 兼用。 1. 1. 2 主要药品、 试剂、 仪器 链脲菌素 （STZ） ， Sigma 公司产品， 用 0. 1 mmol/ L 柠檬酸缓冲液稀 释， pH5. 0； GS， 惠州市绿源保健品有限公司， 批号 030313； 智能八道生理记录及分析处理系统 （型号 RM6280C， 成都仪器厂） ； 一维位移微调器 （成都仪 器厂） ； SureStep 型血糖仪 （美国强生公司） ； 超氧化 物歧化酶 （SOD） 、 丙二醛 （MDA） 测定药盒购自南京 建成生物工程研究所。 1. 2 方法 1. 2. 1 模型的建立与分组 SD 大鼠 24 只， 随机分 为对照组 （NC） 、 DM 组和 GS 组， 每组各 8 只。将 DM 组和 GS 组大鼠按 50 mg/ kg 链脲菌素腹腔注 射， NC 组注射等量的柠檬酸缓冲液。注射 72 h 后， 由尾静脉采血， 应用 SureStep 型血糖仪测定空腹血 糖， 血糖大于 16. 7 mmol/ L 确定为 DM 模型。GS 组： GS 100 mg/ kg （灌胃） ； NC 组与 DM 组： 生理盐水 10 ml/ kg （灌胃） 。每天 1 次， 连续 4 周。 1. 2. 2 肌条的制备 200 mg/ L 乌拉坦 （6 ml/ kg） 麻醉， 迅速去头。5 min 内剖腹取肋膈肌 （包括中心 腱及部分肋骨） ， 置于盛有 Kreb 液 （mmol/ L： 135 NaCl，5 KCl，2. 5 CaCl2，1 MgSO4， 1 NaH2PO4， 15 NaHCO3， 11 C6H12O6） 的平皿中， 持续通入 0. 95 O2 和 0. 05 CO2的混合气体。取右侧膈肌， 依肌纤维走 行方向修剪成宽约 0. 8 cm 的肌条待用。 1. 3 膈肌张力的测定 参照 Prezant 和 Coombes et al 5 -6的检测方法， 将膈肌条垂直悬挂于装满 37 Kreb 液、 持续通入 0. 95 O2和 0. 05 CO2混合气的麦 氏浴槽中。肋骨端固定在浴槽底部， 中心腱端连接 于张力换能器。张力换能器固定在微调器上， 以便 调节膈肌肌条的初长度。调节肌肉至最适初长度 （L0） ， 静置稳定 20 min。两个铂金丝电极置肋骨端 肋条两边， 电子刺激器以超最大电压 （约 20 V） 5刺 激膈肌。张力传感器的输出信号由智能八道生理记 录及分析系统记录分析， 并测定下列参数。 1.3. 1 收缩特性 每根肌条测定两次在 L0时的单 收缩张力 （Pt） ， 每次刺激 （强度20. 00 V， 波宽2 ms） 间隔2 min。以两次平均值作为测定值， 用肌肉横截 面积 （ cross-sectional area， CSA）校 正 （ 单 位： kg/ cm2） 。 1. 3. 2 最大强直张力 （P0） 在单收缩刺激后静置 10 min， 肌条予100 Hz， 20. 00 V， 波宽2 ms， 串长400 ·53·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） ms 刺激， 测定 P0， 其值由 CAS 校正 （单位： kg/ cm2） 。 1. 3. 3 力-频率曲线测定 强度 20. 00 V， 波宽 2 ms， 以不同频率 （10、 20、 40、 60、 100 Hz） 刺激肌条， 每次刺激后间歇2 min， 根据不同频率刺激下膈肌张 力， 绘出力 - 频率曲线。 1. 3. 4 疲劳指数 （fatigue index， FI） 予肌条 20. 00 V， 波宽 2 ms， 30 串/ min， 5 波/ 串， 5 Hz/ 波， 串间隔 1 s， 总刺激 10 min， 致膈肌疲劳， 2 min 后测疲劳后张 力， 取 2 次平均值为测定值， 将其与 Pt 之比作为 FI 值。 1.3. 5 计算 CAS 测定完成后， 测量肌条长度， 去 除肌条的非肌肉组织后烘干水分， 测其重量， 按下式 计算肌条 CSA。 CSA （cm2）= （肌条重量 （g） 肌条长度 （cm）× 肌肉密度 1. 056 （g/ cm3） 1. 4 膈肌组织 SOD 活力、 MDA 水平测定 制备 肌条同时取部分膈肌组织， 用硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量， 羟胺法测 SOD 活力。 1. 5 细胞超微结构观察 取膈肌组织， 制成 1 mm3 小块， 置于 0. 025 戊二醛溶液 （安徽省立医院提供） 中固定， 电子显微镜观察膈肌的超微结构。 1. 6 统计学处理 实验数据以%x ± s 表示， 采用单 因素方差分析和 q 检验。 2 结果 2.1 收缩特性及疲劳指数 与正常组相比， DM 组 膈肌的 Pt、 P0、 FI 显著降低 （P 0. 01） ； 与 DM 组相 比， GS 组 Pt、 FI 明显增加 （P 0. 05） ， P0显著增加 （P 0. 01）（表 1） 。 2. 2 力-频率曲线的变化 在给予 10、 20、 40、 60、 100 Hz 刺激时， DM 组膈肌张力均显著低于对照组 （P 0. 01） ， GS 组张力明显高于 DM 组 （P 0. 05） （图 1） 。 图 1 GS 对糖尿病大鼠膈肌力-频率曲线的影响 表 1 人参皂苷对膈肌收缩能力的影响 （%x ± s， n =8） 组别Pt （kg/ cm2）P0（kg/ cm2）FI NC0. 64 ±0. 101. 88 ±0. 190. 45 ±0. 11 DM0. 40 ±0. 111. 17 ±0. 330. 30 ±0. 02 GS0. 56 ±0. 13&1. 69 ±0. 57&&0. 41 ±0. 11& 与 NC 组比较： P 0. 01； 与 DM 组比较：&P 0. 05，&&P 0. 01 2. 3 MDA 和 SOD 变化 与对照组相比， DM 组膈 肌 MDA 含量显著增高 （P 0. 01） ， SOD 活力显著降 低 （P 0. 01） ； GS 则能抑制这种变化 （表 2） 。 表 2 各组大鼠膈肌组织中 SOD 和 MDA 的变化 （%x ± s， n =8） 组别SOD （U/ mgprot）MDA （nmol/ mgprot） NC190. 33 ±11. 543. 98 ±0. 48 DM160. 47 ±10. 545. 51 ±0. 76 GS181. 79 ±13. 16&&4. 40 ±0. 74& 与 NC 组比较： P 0. 01 ，&P 0. 05； 与 DM 组比较：&&P 0. 01 2. 4 膈肌超微结构的观察 电镜下观察对照组： 肌 纤维结构完整， Z 线清晰， 线粒体无明显肿胀变性。 DM 组： 肌纤维萎缩， Z 线模糊不清， 线粒体肿胀变 性， 部分有空泡样变和髓样小体形成。GS 组： 肌纤 维完整或有轻度萎缩， Z 线较清晰， 线粒体无明显肿 胀变性或有轻度水肿， 无空泡样变和髓样小体形成 （图 2） 。 图 2 各组膈肌组织超微结构的变化 NC 组： 肌纤维完整， Z 线清晰， 线粒体无肿胀 （ ×20 000） DM 组： 肌纤维萎缩， Z 线模糊不清， 线粒体肿胀变性， 部分有空泡变和髓 样小体形成 （ ×15 000） GS 组： 肌纤维完整或有轻度萎缩， Z 线较 清晰， 线粒体无肿胀变性或有轻度水肿 （ ×15 000） 3 讨论 葡萄糖是细胞生长的重要调节因子， 长期高血 糖对机体内环境有普遍的毒性， 导致一系列病理反 应。DM 时， 血糖浓度升高， 自由基生成增加， 且对 自由基的清除能力减低， 从而造成自由基大量堆 积 7， 可直接损伤组织的蛋白质、 核酸、 脂质， 干扰 ·63·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） 呼吸链。并且自由基可致生物膜中的不饱和脂质发 生过氧化作用， 使过氧化脂质的代谢产物 MDA 积 聚， MDA 进而可使细胞膜、 线粒体膜的通透性下降， 影响细胞的物质交换和能量代谢， 最终导致细胞的 结构和功能的损伤。作为骨骼肌， 膈肌同样易受到 高血糖的损害， 因此 DM 大鼠膈肌组织中 SOD 活力 降低， MDA 含量增加。自由基生成增多、 脂质过氧 化增加， 还会造成膈肌肌原纤维损伤， 收缩蛋白对 Ca2 +反应性降低， 引起膈肌收缩力及抗疲劳能力降 低。电镜下观察 DM 大鼠膈肌组织肌小节模糊、 线 粒体肿胀， 从形态学角度说明了 DM 对膈肌的损伤。 现已证实人参皂苷具有抗疲劳、 抗氧化及清除 氧自由基等作用， 能显著抑制 MDA 的产生和 SOD 活性的下降 8， 从而对 DM 大鼠膈肌组织的自由基 清除增加， 由自由基引起的脂质过氧化减少， 减轻了 细胞的损伤。本实验显示 GS 组大鼠膈肌组织中 MDA 含量明显减少， SOD 活力显著升高； 膈肌的收 缩力及抗疲劳能力较 DM 组显著增强， 力频率曲 线明显上移。有研究证明， 人参皂苷具有生物膜保 护作用， 保护细胞膜及线粒体膜免于破坏， 从而保护 了线粒体的呼吸链功能， 改善细胞能量代谢 9， 减 轻了高糖对膈肌组织的毒性作用， 使 DM 大鼠膈肌 收缩功能及抗疲劳能力得到明显改善。有研究表 明， GS 还有阻滞钙离子内流的作用， 能对抗和预防 钙超载的毒性作用 10， 可减少自由基的生成， 阻断 了钙超载和自由基生成之间的恶性循环， 从而改善 膈肌细胞的收缩功能。 参考文献 1 张 宏， 白景文， 于得民，等. 糖尿病性肌病的超微病理结构 及可能机理 J . 中国糖尿病杂志， 2002， 10 （6） ： 326 -9. 2 Pokotsky V Y， Wilson J A， Haines A S，et al. 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Results Compared with control group， Pt， P0and FI in diabet- ic group decreased significantly（P 0. 01） and tetanic tension under the stimulus with frequency of 10， 20， 40， 60 and 100 Hz in diabetic group decreased significantly（P 0. 01） ； MDA in diabetic group was higher（P 0. 01） and SOD was lower than those in control group （P 0. 01） . The ultrastructure under electron microscope indicated that diaphragm fibred in diabetic group fracture，Z lines blured，mitochondrions swelled and degenerated. The a- bove changes were inhibited by Ginsenoside. Conclusion Ginsenoside can protect diaphragm in diabetic rats. MeSH diabetes mellitus/ drug therapy；diaphragm/ drug effects；Ginsenoside/ therapeutic use；rats ·73·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1）