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人肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建* 王祥1 刘本德1 曾秋棠1 阮秋蓉2 摘要 目的: 利用A D - E A S YTM系统, 构建高效而又安全的肝细胞生长因子(HG F) 基因腺病毒载体(A d - HG F) , 以研究HG F基因在心脏内的表达。方法: 从人胎肝中抽提总R NA, 并以该肝细胞总R NA为模版, 利用 合成的1对引物, 采用R T - P C R技术获得HG F基因的c D NA, 并引入酶切位点, 先转入感受态质粒, 再转化大肠 杆菌进行扩增, 筛选阳性菌落, 经酶切及测序, 证实目的HG F基因已经转入, 再将该基因转入p U C 1 8质粒, p U C 1 8质粒与A d - E A S Y质粒进行同源重组, 用 P a c 酶切成线性化D NA, 利用脂质胺转染2 9 3细胞, 经3轮扩 “, 制备高效表达并用绿色荧光标志A d - HG F。并将该载体作实验组, 与HG F组作比较, 观察对V E C的抗凋亡 作用。结果: 在荧光显微镜发现2 9 3细胞发光率为1 0 0%,A d - HG F的HG F c D NA经过测序鉴定与基因库序列一 致。结论:A d - HG F的成功构建, 为冠心病转基因治疗的基础与临床研究奠定了基础。 关键词 肝细胞生长因子; 腺病毒; 载体; 基因治疗 中图分类号 R 3 7 3. 1 文献标志码 A 文章编号 1 0 0 1 - 1 4 3 9(2 0 0 6)0 4 - 0 2 3 8 - 0 4 C o n s t r u c t i o no fa d e n o v i r u s - r e c o m b i n e dv e c t o ro fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r WANGX i a n g 1 L I UB e n d e1 Z ENGQ i u t a n g1 R UANQ i u r o n g2 ( 1D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y, U n i o n H o s p i t a l,T o n g j iM e d i c a lC o l l e g e,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo f S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,Wu h a n,4 3 0 0 2 2,C h i n a; 2D e p a r t m e n to fP a t h o l o g y, T o n g j iM e d i c a lC o l - l e g e,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y) A b s t r a c t O b j e c t i v e:T oc o n s t r u c th i g he f f i c i e n ta n ds a f ea d e n o v i r u sv e c t o ro fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r(A d - HG F)g e n er e c o m b i n a t i o nw i t hA D - E A S Y TMs y s t e mi no r d e r t or e s e a r c ht h ee x p r e s s i o no fHG Fg e n e i nt h eh e a r t . M e t h o d:T oe x t r a c t t o t a lR NAf r o mh u m a nf e t a l l i v e r,t a k et h et o t a lR NAo fh e p a t o c y t ea sm o d e l,u s eap a i ro f s y n t h e t i cp r i m e r s,a d o p tR T - P C Rt e c h n i q u e t oo b t a i nc D NAo fHG Fg e n ea n di n s e r te n z y m ec u t t i n gs i t e,t u r nt o c o m p e t e n c ep l a s m i d f i r s t,a n d t h e n t r a n s f e r t h e c o l i b a c i l l u s t oa m p l i f y,s c r e e n t h ep o s i t i v e c o l o n y,e n s u r e t h e t a r g e - t e dHG Fg e n eb e i n gt r a n s f e r r e da f t e r e n z y m ec u t t i n ga n ds e q u e n c i n g,t h e nt r a n s f e r t h eg e n e i n t op U C 1 8p l a s m i d, c a r r yo u t h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nw i t hp U C 1 8p l a s m i da n dA D - E A S Yp l a s m i d,e n z y m e c u t t i n g i n t o l i n e a r i z a t i o n D NAw i t hP a c I,u s e f a t t ya m i n e t ot r a n s f e c t 2 9 3c e l l,a m p l i f yt h r e et i m e s,A d - HG Fg e n er e c o m b i n a t i o nl a b e l l e d b yf l u o r e s c e n c ew a sp r e p a r e dw i t hh i g he f f e c t i v ee x p r e s s i o n .R e s u l t:HG Ff u l l l e n g t hc D NAh a sb e e nc l o n e da n d r e c o m b i n a n tHG Fa d e n o v i r u sv e c t o rw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y,a ss h o w nb yP C R,r e s t r i c t i n ge n d o n u c l e a s ed i - g e s t i o na n a l y s i sa n df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n . I tw a s f o u n dt h a t 2 9 3c e l l l u m i n a n c ew a s1 0 0% u n d e r t h e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e . C o n c l u s i o n:Ar e c o m b i n a n t a d e n o v i r u sv e c t o r o fHG Fw a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yw h i c hm a yb e ap o - t e n t i a lb a s i s f o r t h eg e n e t h e r a p yo f c o r o n a r ya r t e r yd i s e a s ea n de s t a b l i s h e da f o u n d a t i o nf o r f u r t h e rs t u d y . K e yw o r d s H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r;A d e n o v i r u s;V e c t o r;G e n e t h e r a p y *基金项目: 湖北省自然科学基金( N o:2 0 0 4 A B A 2 2 2) 1华中科技大学协和医院心内科 华中科技大学同济医学院心 血管病研究所(武汉, 4 3 0 0 2 2) 2华中科技大学同济医学院病理学系 导师 通讯 作 者: 王 祥,E m a i l:w x i a n g 1 2 8y a h o o . c o m. c n/w x - i a n g 1 2 8h o t m a i l . c o m 研 究 表 明,肝 细 胞 生 长 因 子 (h e p a t o c y t e g r o w t hf a c t o r,HG F) 是一种具有多功能的生物大 分子, 它能促进肝细胞、 肾小管上皮细胞、 胃黏膜细 胞以及血管内皮细胞等的增生与分裂; 抑制肿瘤细 胞的生长与迁移 1,2。其中较为突出的是对内皮细 胞的保护和促分裂作用。在血管损伤后重建过程 中内皮的及时修复对防止血管狭窄等方面有重要 作用 3。目 前 多 使 用 基 因 转 染 的 方 法, 使 含 有 HG F基因的真核表达载体进入动物体内, 使之于 靶组织局部表达 4。可供真核基因表达的载体很 多, 如质粒、 噬菌体、 反转录病毒载体等 5。本实验 拟构建含人HG F基因的重组腺病毒载体( a d e n o - v i r u s v e c t o r o f h e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r,A d - HG F) , 旨在为下一步冠心病的基因治疗研究提供 基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 各种试剂盒如:R NA抽提试剂盒、 胶回收试剂 盒等均为G e n eV公司产品, 各种限制性内切酶如 X b o 、E c o r V、N h e 和P a c 均来自基因有限公 司,DMEM培养基来自H y C l o n e - P I E R C E公司, 胎牛血清来自G i b c o公司,HE K 2 9 3细胞系本院卢 实博士馈赠, 携带荧光蛋白的腺病毒来自中国科学 · 832 · JC l i nC a r d i o l(C h i n a) ,A p r2 0 0 6,V o l 2 2,N o4 院病毒研究所。P C R仪、-8 0冰箱、 细胞培养箱 以及离 心 机 均 来 自 美 国 三 元 公 司, 显 微 镜 来 自 O l y m p u s公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 总R NA的抽提及R T - P C R 从-8 0冰 箱中取出预先保留的包膜完整人胎肝1g, 按R NA 抽提试剂盒说明书方法一步抽提出总R NA, 并放 入-2 0冰 箱 备 用。应 用P r i m e r分 析 软 件 对 HG F序列进行分析, 设计1对P C R引物: 引物F:5 ' C C G G C T T G C AA C AT T C T T 3 '引物R:5 ' T G C T - T C AAATA C A C T G G C C T C T T C TA 3 '。按 以 下 顺 序加样: 1 0mm o l/Lb u f f e r 1µl,2 5mm o l/L氯化镁 2µl,1 0mm o l/Ld NT P1µl,R n a s e0. 2µl,R t a s e 0. 2µl,T a g0. 2µl, 引物F0. 4µl, 引物R0. 4µl, 总R NA3. 6µl,D E P Cd d H2O1. 0µl。合计总体积 1 0µl。反应条件:9 4 5 0s,5 4 6 0s,7 2 9 0s。 扩增3 5轮。以抽提肝组织R NA为对照组, 以扩增 产物为实验组进行电泳分析, 对所得扩增产物行胶 回收, 胶回收按试剂盒说明书进行。 1. 2. 2 转化大肠杆菌 取3 0µ l已经准备好的感 受态质粒, 加入3µlP C R产物, 在冰水中轻轻旋转 3 0m i n, 然后4 2热击4 5s, 冰浴3m i n, 加入2 5 0 µ lN Z Y,于3 7 2 2 52 5 0r/m i n摇床复苏1h。 吸取1 5 0µl转化物, 铺已经备好的L B平板, 3 7 培养箱中培养2 44 8h。挑选生长良好的菌落, 加 入5 0 0m lL B培养基中摇菌2 4h。 1. 2. 3 腺病毒穿梭质粒S h u t t l e - CMV - HG F的构 建 取出p U C 1 8质粒的L B培养液, 80 0 0r/m i n 离心2m i n, 抽提质粒, 用X b a回收得到2 . 2k b 的D NA片段, 用N r u和P v u双酶切p c D NA 3, 回收约1. 0k b的D NA片段, 将这2个片段连接得 质粒p UD( 约3. 3k b) 。用A v a和S s p双酶切 p UD, 回收约2. 7k b的D NA片段, 另用 AVR酶 切p E G F P - N 1, 回收约1. 1k b的D NA片段, 该片 段含有完整的卡那霉素基因, 连接2个回收D NA 片段得质粒p UD K( 约3. 8k b) 。然后将HG F c D - NA克隆至p UD K载体的多克隆位点, 获得携带人 HG F基因的重组质粒载体, 命名为p UD KH(6. 0 k b) 。用B a mH I和H i n d双 酶 切p c D NA 3 L a c Z 后, 回收大小约3. 0k b的D NA片段, 将其插入至 p UD K载体的B a mH I和 H i n d位点, 获得S h u t - t l e - CMV - HG F质粒。 1. 2. 4 制备含HG F基因的p A d E a s y - 1质粒载体 取4只无菌的1. 5m l的离心管( 分别标记为a、 b、c、d) 和0. 2c m的电转化杯, 在冰上预冷; 取适量 的B J 5 1 8 3感受态细胞, 于冰上融化; 向每个离心管 中加入4 0µl左右的B J 5 1 8 3感受态细胞。在a管 中, 加入1µl( 1m g /L) 线性化的去磷酸化的S h u t - t l e - CMV - HG F质粒和1µl(1 0 0µg/L) 超螺旋的 p A d E a s y - 1质粒载体, 轻轻混匀后置于冰上放置; 在b管中, 加入1µl( 1g /L) 线性化的去磷酸化的 S h u t t l e - CMV - l a c Z和1µl(1 0 0µg/L) 超 螺 旋 的 p A d E a s y - 1质粒载体, 轻轻混匀后置于冰上放置; 在c管中, 加入1µl( 1g /L) 线性化的去磷酸化的空 白的s h u t t l e载 体 和1µl(1 0 0µg/L) 超 螺 旋 的 p A d E a s y - 1质粒载体, 轻轻混匀后置于冰上放置 ( 该杯为阴性对照: 作为穿梭载体的背景对照用) ; 在d管中, 加入1µl( 0. 0 1µg/L) 的p U C 1 8对照质 粒。调节电转化仪, 电击参数: 2 0 0 、5k V、2 5µF; 将离心管稍适离心, 将管中的菌液与D NA转至相 应的电转化杯中; 电击; 电击完毕后, 迅速取出电转 化杯, 立即加入1m l无菌的L B培养基, 用p i p e t - m a n吹吸混匀。将菌液转至1 5m lF a l c o n2 0 9 5管 中; 于3 72 2 52 5 0r/m i n摇床复苏1h; 重组反 应及对照反应的菌液( a、b、c3管) , 取一定的稀释 度( 如: 5 0、1 0 0、2 5 0、6 0 0µl等) , 分别涂布于25 块L B - K a n平板; p U C 1 8质粒转化组, 仅作为感受 态效率测试的对照, 取1 01 0 0µl涂布于L B - Am p 平板中; 取一些感受态细胞涂布于L B - K a n平板, 作为菌体空白对照; 3 7培养过夜。 1. 2. 5 转染HE K - 2 9 3细胞 从重组( p S h u t t l e - CMV加目的基因) 实验平板和重组对照(p S h u t t l e - CMV - L a c Z) 平板上, 分别挑选1 0个或更多的很小 的克隆, 加入35 m lL B - k a n a m y c i n培养基中, 3 7、2 2 52 5 0r/m i n恒温摇床培养过夜。取2m l 或更多的培养过夜的培养基小量提取D NA, 最终 得到的D NA的体积为5 0µl,D NA用T e b u f f e r或 者灭菌的d H2O重悬。用P a c 酶切1 0µl小量提 取的D NA, 完全消化后在0. 8%的TA E琼脂糖凝 胶上电泳, 证实已经得到目的基因的D NA片段; 在 1只E P管中加入5 0µl的上述D NA, 另加入4 5 0 µ l的不含血清DMEM培养基, 轻轻混匀; 在另1只 E P管中加入4 5 0µl的不含血清DMEM培养基, 再 加入7µl脂质胺, 混匀; 然后, 将2只E P管液体混 匀, 3 7水中温浴2 0m i n。最后将上述液体加入用 不含血清DMEM培养基润洗1遍的HE K - 2 9 3细 胞培养瓶中, 并放入3 7、 2 2 52 5 0r/m i n摇床。 1. 2. 6 收 集 病 毒 原 种 及 扩 增 6h 后 在 上 述 HE K - 2 9 3细胞中加入含1 2%的胎牛血清DMEM 培养基。1d后在荧光显微镜可看见细胞有绿色荧 光, 45d小心更换1次培养基, 尽量避免HE K - 2 9 3细胞悬浮; 然后继续在培养箱培养45d。待 观察到有大量细胞发生悬浮时, 用吸管轻柔的上下 吹打直到细胞完全悬浮。将细胞悬液移入戴螺旋 帽的离心管中, 低速离心分离细胞。去除并保留上 清, 用0. 5m l的灭菌P B S重悬细胞, 并转移到已经 灭菌的细胞保存管中, 低速离心分离细胞, 去除上 清后再用新鲜的0. 2m lP B S重悬细胞。将细胞保 · 932 ·临床心血管病杂志2 0 0 6年4月第2 2卷第4期 存管密封放入液氮罐中5m i n后, 取出放入3 7水 中均匀摇动3m i n, 使管中液体完全融化。重复上 述过程共4次, 最后将保留培养基上清及细胞裂解 液混 匀, 得 到 病 毒 原 液。 在 感 染 前2 4h, 更 换 HE K - 2 9 3细胞培养基, 待培养瓶中细胞覆盖率为 5 0%7 0%时, 将上述过程所得到的病毒原液1m l 加入5 0m l的培养瓶中, 再放入3 7、 2 2 52 5 0r/ m i n摇床中2h; 再加入含1 2%的胎牛血清DMEM 培养基。2d后在荧光显微镜可看见细胞有绿色荧 光, 45d后可收集细胞, 用吸管轻柔的上下吹打 直到细胞完全悬浮。将细胞悬液移入戴螺旋帽的 离心管中, 低速离心分离细胞。去除并保留上清, 用1 m l的保留上清液重悬细胞, 并转移到已经灭菌 的细胞保存管中, 将细胞保存管密封放入液氮罐中 5m i n后, 然后在3 7水中均匀摇动3m i n, 使管中 液体完全融化。重复上述过程共4次, 最后将保留 培养基上清及细胞裂解液混匀。这一过程重复4 5次后可获得1×1 0 1 01×1 01 2/ m lA d - HG F。此 载体可以在-8 0的条件下保存1年。 2 结果 2. 1 R T - P C R结果 通过R T - P C R方法, 利用引物, 从肝细胞中扩 增出1条长度2. 2k b的条带, 与理论预计的c D NA 片段长度一致( 图1) 。 2. 2 目的片段的酶切及测序鉴定 2. 2k b的目的片段经限制性内切酶X b a l 酶 切后电泳。目的片段的测序结果与N C B I的G e n - B a n k收录的HG F序列一致。 2. 3 重组质粒的酶切鉴定 从转化后E. c o l i J M 1 0 9中抽提的质粒, 用P a c 酶切后电泳, 得到1条2. 2k b条带( 图2) 。 2. 4 目的基因转染及扩增 使用A d - HG F转染2 9 3细胞后( 图3) 。荧光 显微镜下发光率达9 0%以上, 证明载体构建成功。 3 讨论 HG F是一种多功能的细胞生长因子,HG F的 1: D NA/H i n d M a k e r;2: 对照组3: 实验组 图1 R T - P C R 1: D NA/H i n d M a k e r;2,3均为重组质粒 图2 重组质粒H i n d和P a c I酶切产物 分子量为8 7 0 0 01 0 5 0 0 0, 其前体是由7 2 8个氨基 酸残基组成的单链, 经蛋白酶水解后产生有生物活 性的异二聚体 1,2, 其作用受体为细胞膜上的 C - ME T受体, 经膜受体对细胞进行信号及周期调 节 3。 近 年 来 在 心 血 管 方 面 的 研 究 开 始 增 多 , 图3 转染2 9 3细胞后普通光镜像(b, 1 0 0) 、 荧光显微镜像(c,1 0 0) 与未转染A d - H F普通光镜像(a,2 0 0)对比 · 042 · JC l i nC a r d i o l(C h i n a) ,A p r2 0 0 6,V o l 2 2,N o4 H a y a s h i等 6发现 HG F,V E G F,F G F能抑制缺氧 时细胞发生凋亡, 并能促进内皮细胞生长。V a n B e l l e等 7报道 HG F可刺激体外培养的人脐静脉 血管内皮细胞的增殖迁移, 其对血管内皮细胞增殖 的直接作用类似且强于血管内皮细胞生长因子 (V E G F) 。目前已经证实人和鼠的HG F高度同 源 2, 因此, 使用人 HG F能够满足本实验研究的要 求。 腺病毒载体是一种D NA病毒, 与其他载体相 比, 有如下优点:腺病毒基因组的结构和功能清 楚, 允许大分子插入;腺病毒没有外膜, 结构稳 定, 对介导相关的灭活作用不敏感;复制缺陷的 腺病毒由于没有基因重组情况的发生, 不引起宿主 的细胞癌变;可以进入不分裂的细胞或终末分化 细胞;在宿主细胞内具有很高的拷贝数, 而且容 易浓缩制备。基于上述优势, 我们选择以腺病毒为 载体, 本研究表明, 我们克隆的人HG F c D NA长度 为2. 2k b,与报道的HG F c D NA长度一致, 同时, X b a l 酶切鉴定也表明此c D NA 片段与文献报道 的相同。为了进一步证实我们构建的A d - HG F含 有能够有效表达的HG F基因, 我们对构建的A d - HG F进行了测序, 结果表明此表达系统含有完整 的HG F c D NA, 同时, 表达系统的开放阅读框没有 发生错位。 使用构建的A d - HG F表达系统转染2 9 3细胞 后, 使用荧光显微镜可以观察到A d - HG F表达系 统能够成功地在此细胞内表达, 表明我们构建的 A d - HG F真核表达系统能够有效地在上述细胞内 “ 生产” 蛋白质。 参考文献 1NAKAMUR AT,NAWA W,I CH I HA R A A. P a r t i a l p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh e p a t o c y t eg e o w t h f a c t e r f r o ms e r u mo fh e p a t o c t e m i e dr a t eJ. B i o c h e m B i o p h y sR e sC o mm u n,1 9 8 4,1 2 2:1 4 5 0-1 4 5 9. 2NAKAMUR A T,N I S H I Z AWA,HAG I YA M,e ta l . M o l e c u l a r c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f h u m a nh a p a t o c y t e g r o w t hf a c t o rJ.N a t u r e,1 9 9 4,3 4 3:4 4 0-4 4 4. 3MO R I S H I TAR. R e c e n tp r o g r e s s i ng e n et h e r a p yf o r c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s eJ. C i r cJ,2 0 0 2,6 6:1 0 7 7- 1 0 8 6. 4 吴丹莉, 劳妙芬, 邱兆华, 等.腺病毒载体介导肝细胞 生长因子基因对大鼠心肌缺血的基因治疗J.科学 通报, 2 0 0 2,4 7(2 2) :1 7 2 0-1 7 2 3. 5P A T E LSR,L E ELY,MA C KC A,e ta l . S a f e t yo f d i r e c tm y o c a r d i a l a d m i n i s t r a t i o no f a na d e n v i r a l v e c t o r e n c o d i n gV E G F 1 2 1J. H u m G e n eT h e r,1 9 9 9,1 0: 1 3 3 1-1 3 4 8. 6 HAYA S H IS,MO R I S H I TA R,NAKAMUR A S,e t a l . P o t e n t i a l r o l eo fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r,an o v e l a n g i o g e n i cg r o w t hf a c t o r,i np e r i p h e r a l a r t e r i a ld i s e a s e :d o w n r e g u l a t i o no f HG Fi nr e s p o n s et oh y p o x i ai n v a s c u l a rc e l l sJ. C i r c u l a t i o n,1 9 9 9,1 0 0(S u p p l): 1 3 0 1-1 3 0 8. 7VANB E L L EE,W I T Z E N B I CHL E RB,CHE ND, e t a l .P o t e n t i a t e d a n g i o g e n i ce f f e c to fs c a t t e rf a c t o r/ h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o rv i a i n d u c t i o no fv a s c u l a re n - d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r:T h e c a s e f o rp a r a c r i n e a m p l i - f i c a t i o no fa n g i o g e n e s i sJ.C i r c u l a t i o n,1 9 9 8,9 7:3 8 1 -3 8 1. ( 收稿日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 3 1) 医学论文中英文摘要的书写规范( 二) 1. 4 缩略词要求全部大写, 但要严格限制使用缩略词, 除非那些全称较长, 缩写后已得到科技界公认, 且在 读者群中非常熟悉的才可使用 例: L A S E R(l i g h ta m p l i f i c a t i o nb ys t i m u l a t e de m i s s i o no f r a d i a t i o n, 激光) D NA(d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d, 脱氧核糖核酸) A I D S(a c q u i r e d i mm u n ed e f i c i e n c ys y n d r o m e, 获得性免疫缺陷综合征, 艾滋病) C T(c o m p u t e r i z e dt o m o g r a p h y, 电子计算机断层摄影) MR I(n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e i m a g i n g, 磁共振成像) B C G(b a c i l l iC a l m e t t e - G u e r i n, 卡介苗) 还有一些可以根据不同专业学科来选定, 如 临床心血管病杂志 中常用的AM I( a c u t em y o c a r d i a l i n - f a r c t i o n, 急性心肌梗死) ,E C G(e l e c t r o c a r d i o g r a m, 心电图) 等。 1. 5 与副题名可以用冒号分开, 不得用破折号 1. 6 特殊字符即数字符号和希腊字母在题名中尽量不用或少用 例:TN F 在大鼠心肌梗死后心室重构进程中表达的变化及意义 误T u m o rn e c r o s i sf a c t o re x p r e s s i o nd u r i n gp r o g r e s s i o no fl e f tv e n t r i c u l a rr e m o d e l i n gi nr a t m y o c a r d i a l i n f a r c t i o nm o d e l 正T u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h ae x p r e s s i o nd u r i n gp r o g r e s s i o no f l e f tv e n t r i c u l a rr e m o d e l i n gi n r a tm y o c a r d i a l i n f a r c t i o nm o d e l · 142 ·临床心血管病杂志2 0 0 6年4月第2 2卷第4期