人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N和3UTR位点多态性与中国北方汉族成人肺结核易感性的关系.pdf

中国临床康复第!“卷 第#$期2006-06-25 !“ Chine 人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白 1 基因 D543N 和 3!U,- 位点多态性与 中国北方汉族成人肺结核易感性的关系! 纪春梅 1!安雅臣2!李 军 3!王育华4 ! 临床研究 ! 1唐山市协和医院呼吸内科,河北省唐山市 063000;2华北煤炭医学院 附属医院内二科, 河北省唐山市063000;3唐山市钢铁公司职工医院 骨科,河北省唐山市063000;4唐山市第四医院一病区,河北省唐山市 063000 纪春梅!,女,1./0年生,河北省唐山市人,汉族,2005年华北煤炭医学 院毕业,硕士,主治医师,主要从事结核病基因易感性的研究。 中图分类号0-521文献标识码01文章编号016/1-5.2622006324-0010-04 收稿日期02006-03-02修回日期02006-04-06206-50-3-16.345!663 Asso iation of D543N and 3'234 5o678o95:is8 o; natsist?n =asso iatd8a 9o5:a59otinAnBit: s5tiCi6it7 to ad9 D?ns o; Eo9t: F:in? %? -78A:9;:B C7DAEA=7F GA7H7 I8A;9JF,9=KH9= 063000FI7L7A M:NA=E7FOHA=9P 2Q7E=D D789:;? R=;7:=9J C7DAEA=7F1?AJA9;7D I8A;9JFN:;H7:= OHA=9 O9J C7DAE9J OJJ7K7F ,9=KH9=063000F I7L7A M:NA=E7F OHA=9P 3D789:;? S:;H87DAEF Q;9? I8A;9J ? ,9=KH9= Q;77J ONA=E7FOHA=9P 4TA:; U9:D 1:79F TV:;H I8A;9J ? ,9=KH9=F ,9=KH9=063000F I7L7A M:NA=E7F OHA=9 %7:F1;7=DA=K 8HBAEA9=FD789:;? -78A:9;:B C7DAEA=7F GA7H7 I8A;9JF ,9=KH9=063000F I7L7A M:NA=E7F OHA=9 G iHdI 2006-03-02J 5tdI 2006-04-06 JCst9? t JKLI, A=N7;AK9;7 ;H7 9EA9;A= L7;W77= ;H7 =9;V:9JX:7A;9=E7X 9EA9;7D 8H9K7 8:;7A= 1YN-1CM1ZK7=7 8JB=9:B ;VL7:EVJA2,ZA= ;H7 I9= ? N:;H OHA=9 LM3DNDOI1 ;9J ? 124 9DVJ; 89;A7=; WA;H , 9K7D 1 B79: : A I8A;9J W7:7 7J7E;7D 9 ;H7 E97 K:V8 C79=WHAJ7F ;H7 H79J;HB 87:= ? ;H7 9=9JA;BF 9JD 9=D :7AD7=; ? ;H7 9: EV=;BZFA=?7E;7D WA;H ?/(1+/2e*i)A 2)1e*/),(7;A?A7D LB U=A?:=;:J K:V81 101 =;:J ;VDB W9 9D8;7DF9=D ;H7 8JB=YMO-Z9=D :7;:AE;A= ?:9KJB N-1CM1 8JB=7=NA:=:9=D 89;HJKAE9J EH9=K7 ? ;VL7:EVJA W9 EJJ7E;7D WA;H _V7;A=9A:7 ; 9=9JBa7 ;H7 EJA=AE 9=D 89;HJKB ? ,F A=KJ7 9=D : JKA;AE 9=9JBA W7:7 9J E=DVE;7D 4MP2QRPI,H7:7 W7:7 124 E97 A= ;H7 E97 K:V8 A=EJVDA=K 3 JDF :787E;AN7JBF ;H7 9K7 =7; ? JD7: ;H9= ?7 124 E97 A= ;H7 E=;:J K:V8FJD 9=D ?7JD,H7:7 W9 = AK=A?AE9=; DA?7:7=E7 L7;W77= ;H7 ;W K:V8 YB d 005Z e7=7 ;B8A=K ? D543N 9=D 3fU,-0D543N e41F3'U,- ,e,eg4D7J K7=;B87 EEV:7D V8 ;H9= ;H7 E=;:J K:V8FWA;H E:VD7 S- Y.5hORZ L7A=K 2625(1123-6134)9=D 2/33 Y1513-4.3Z R= A=KJ7 9=D : 9=9JBA ? 1/ 7=NA:=:FD543N e41F3'U,- ,e,eg4D7J K7=;B87 W7:7 ;AJJ AK=A?AE9=;JB E:7J9;7D WA;H , 9?;7: 9DiV;? E9: ? Oe N9EEA=7FDB V:7 HA;:BF9=D S-Y.5hORZW9 9DiV;7D ; 3151 (1225-105)9=D 3306Y151/-/201Z1;B87F ;H7:7 W9 = AK=A?AE9=; DA?7:7=E7 A= 89;HJKAE9J EH9:9E;7: ? 8VJA A= ;H7 ;W K:V8 FNEFQ2PKNEIMJB?D543N9=D3'U,-JEAA= N-1CM1 K7=7 : ; , A= ;H7 I9= ? N:;H OHA=9 %2FG,;HE(= *1?$4和 4“BCD位点多态性与中国北方汉族成人肺结核易感性的关系S%T9中国临床康复! #“K!“M#$RO!“P4SIII9U6F2V=92;,T 摘要 目的“探讨人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N和3fU,-位点 多态性与国内北方汉族成人肺结核发病的关系。 方法“ 以2004-03406唐山市结核病医院连续收治的汉族成人 (年龄 “1岁)结核患者124例为研究对象,为病例组。 同期通过健康查体的 方式选择与病例组患者同民族、同性别、年龄相差c 3岁,相同居住地 (城市或农村), 且经统一结核菌素试验确认为有结核分支杆菌感染的 健康者为对照组。 采用1j1配对设计的病例对照观察。 采用聚合酶链反 应-限制性片段长度多态性分析检测人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1 基因中D543N和3'U,-两个多态性位点,对肺结核相关的环境因素进 行问卷调查,对肺结核的临床和病理进行分析,并进行单因素和多因素 条件6KA;AE回归分析。 结果“病例组124例,男3例,女41例;男性患者年龄(4/b16)岁,女性 (3/b15)岁,男性患者发病年龄大于女性(B c 005Z;农村患者/5例,城 市4.例。 对照组124例,男性年龄(4/b15)岁,女性(3b12)岁,与病例 组比较差异无显著性(B d 005)。D543N和3'U,-两个多态性位点 的基因分型:D543N e41,3'U,- ,e,eg4D7J基因型病例组频率显著高 于对照组,其G0值(.5h.H)分别为2625(1123k6134),2/33(1513k 4.3)。对1/个环境危险因素进行单因素分析和多因素分析中, 在调整卡痕、婚姻状况、体质量指数、接触史4个因素后,D543N e41, 3'U,- ,e,eg4D7J基因型仍与肺结核显著相关,调整G0值(.5h.H)分 别为3151(1225k105),3306(151/k/201)。在不同基因型中,病 例组和对照组肺结核病变性质差异无显著性。 结论“人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N,3'U,-位点多态性 可能是国内北方汉族成人肺结核的易感因素。 主题词“结核,肺;巨噬细胞炎性蛋白质1;病例对照研究 S引言 结核病成为一个全球性的严重公共卫生问题,是 单一感染因素引起死亡人数最多的疾病l1m。 而在感染 结核分支杆菌人群中仅1410发病,提示个体差异可能 与结核病的易感性相关l2m。 宿主易感基因与疾病发生 与发展中有重要作用。 人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白 1基因就是主要的候选易感基因之一。 人自然抵抗相 关巨噬细胞蛋白1基因已被定位于人染色体2_35,某 些多态现象可能影响对肺结核的易感性l3m。 国外有把 环境因素与机体遗传因素割裂开来进行研究, 结果不 尽相同。 国内的研究对象为单纯部队人员、男性、年龄 段较窄,因而缺乏人群代表性。本文采用配对病例对照 研究设计和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分 析方法, 探讨国内北方汉族成年一般人群人自然抵抗 相关巨噬细胞蛋白1基因D543N和3'U,-两个位点 !“ !“# $%,且排除与此次病例 组患者有血缘关系的人群作为对照组。 主要仪器:聚 合酶链反应自动扩增仪(美国7?A),微量凝胶电 泳系统(美国BC=DA),离心沉淀机(上海安亭科学仪 器厂),电子天平(上海精科天平厂),紫外光分析仪 ( 上 海 长 明 光 学 仪 器 厂 ), 微 量 加 样 器( 德 国 EDD?FGAH)。 主要试剂:三羟甲基氨基甲烷(IA=J碱)、 乙二胺四乙酸、盐酸、氯仿、异戊醇、无水乙醇、溴化 乙啶、溴酚蓝、聚丙烯酰胺、琼脂糖均购自华美生物 工程公司;蛋白酶K(宝生物工程有限公司),内切酶 (宝生物工程有限公司),特异性引物(北京赛百胜基 因技术有限公司),ILMN#O聚合酶(北京赛百胜基因 技术有限公司)。 设计、实施、评估者:设计为第一作者,实施为全 部作者,评估为第二作者,评估者经过正规培训。 方法: 环境相关危险因素调查:采用面对面问卷调查形 式, 由经过统一培训的调查人员逐一询问并认真填 写,内容包括出生年月、职业、文化程度、民族、婚姻状 况、呼吸系统疾病史及其他重大疾病史、烟酒嗜好、卫 生习惯、饮食生活习惯、家庭经济状况、住房状况、家 族患结核病情况、结核病接触史、卡介苗接种史及其 他系统疾病史和服药史。 基因组N#O的获取: 每个研究对象晨起空腹抽 取静脉血( 7P,*- Q.P乙二胺四乙酸-R( 7P抗凝,冰 盒保存。 采用低渗溶血法分离白细胞,常规氛抽提法 提取基因组N#O。 聚合酶链反应:N(,3#和3'BI/的引物设计参考 文献93:('STO+ I+I + +OO II+ OIT TIS3'和('S OO+ ITI + O+I +IO I+ ITS3'。 由宝生物工程 (大连)有限公司合成。聚合酶链反应体系:反应的总体 积为*( $P, 其中ILM N#O聚合酶$ B,$-U聚合酶链 反应W.P, GXIYJ -R* 77W.P,N#O模板$R- $P, 无菌 双 蒸 水 $,R( $P。 聚合酶链反应条件:)( Z ( 7=F后,), Z ,( J,(4 Z ,( J,卡痕、婚姻状况、体质量指数为肺结核 发病的保护性因素,见表4。 2.7不同基因型与肺结核病变的性质和程度的关 1:人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N位点聚合酶链反应扩增产物;2: D543N G/G基因型Ava限制性内切核酸酶酶切产物;3:D543N A/A基因型Ava 限制性内切核酸酶酶切产物;4:D543N G/A基因型Ava限制性内切核酸酶酶 切产物 图3人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N位点聚合酶链反 应-限制性片段长度多态性分析结果 16: 人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N和3'UTR位点聚合酶链反应 扩增产物(聚合酶链反应产物为240 bp或244 bp) 图1人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因D543N和3!UTR位点聚 合酶链反应扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳结果 1:人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因3'UTR位点聚合酶链反应扩增产物; 2:3'UTR TGTG del/del基因型Fok限制性内切核酸酶酶切产物;3:3'UTR +/+ 基因型Fok限制性内切核酸酶酶切产物;4:3'UTR del+/-基因型Fok限制性 内切核酸酶酶切产物 图2人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因3!UTR位点聚合酶链反 应-限制性片段长度多态性分析结果 表3单因素条件Logistic回归分析 因素-1值95%可信区间2 卡痕 婚姻状况 接触史 家族史 卡介苗接种史 体质量指数 D543NG/A基因型 3'UTR +/del基因型 0.235 0.143 1.842 2.818 0.323 0.843 2.625 2.733 0.1090.508 0.0320.629 1.0543.220 1.4175.607 0.1580.658 0.7750.915 1.1236.134 1.5134.938 0.001 0.010 0.032 0.003 0.002 0.002 0.026 0.001 表4多因素条件Logistic回归分析 模型变量调整-1值2 D543N模型 3'UTR模型 1.000 3.151 0.475 0.075 0.834 2.693 1.000 3.306 0.214 0.084 0.801 2.816 0.017 0.010 0.004 0.000 0.008 0.003 0.001 0.005 0.000 0.008 95%可信区间 D543NG/G D543NG/A 卡痕 婚姻状况 体质量指数 接触史 3'UTR +/+ 3'UTR +/del 卡痕 婚姻状况 体质量指数 接触史 1.225-8.105 0.270-0.835 0.0130.426 0.766-0.908 1.2992.585 1.5177.201 0.0850.540 0.0150.472 0.7180.893 1.3066.075 !“ 中国临床康复第!“卷 第#$期2006-06-25出版 Chine 系根据结核病变性质,病变程度(按照NTA分类 法7)分组,在D543N不同基因型中,代表疾病进展 表现的渗出性病灶和干酪性病灶比例高于代表机 体免疫力占优势的增殖性病灶, 但差异无显著性 (!2=3.362,? 0.05),见表5。 在不同基因型同病变 的轻重程度的关系研究中,也没有发现两者有相关 性,见表6。 3讨论 大量遗传学证据表明,肺结核的发生是环境因素 (此处指除遗传因素以外的所有后天因素, 包括个体 生活方式) 与机体遗传因素共同作用的复杂结果,与 环境危险因素如居住拥挤、抽烟、酗酒、营养不良等有 关。 近年来,国外有人进行了肺结核易感基因的病例- 对照研究,但两者通常都是分别进行,无法确定它们 在肺结核发病中的独立作用,也没有研究两者间的交 互作用。 本文将环境因素与易感基因共同纳入病例- 对照研究,克服了以上缺点,因此具有更好的人群代 表性,能够较清楚阐明绝大多数受感染成人个体保持 健康而不发病,从而更有利于分析宿主基因与肺结核 病易感性的关系。 在影响宿主防御机制的遗传学因素中, 作为一种 自然抵抗因素的人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1占 有重要的地位。 人自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1位 于静息巨噬细胞晚期胞内腔内, 在巨噬细胞吞噬病 原体后,转移到吞噬体膜5。 进一步的研究表明人自 然抵抗相关巨噬细胞蛋白1可能通过改变吞噬溶酶 体内环境限制胞内病原体的繁殖6。 本文发现调整了 卡痕、婚姻状况、体质量指数、接触史4个环境因素 后,多态性位点D543NG /A、3'UTR TGTG+/del基因 型在病例中的分布频率显著高于对照组, 可能是肺 结核的易感基因型。 越来越多的肺结核易感基因如VDR基因、MBL 基因和HLA基因等被发现, 而在不同人群中开展的 基因组流行病学研究, 将使这些易感基因在疾病发 生中的作用及基因与基因间、 基因与环境间的交互 作用可能被逐步阐明。 这将有助于肺结核高危人群 的预测,从而为优选干预措施(医学干预、行为干预 或环境干预)提供科学依据,为制定适宜的预防策略 打下的基础。 4参考文献 Bloom BR, Murray CK.TuLerMuloNONP MommeQRary oQ a reemerSeQR TOller./ien/e 1UU2V257W5073)P1055-64 DolOQ XK, RaYOSlOoQe MC, ZoMO A.GloLal RuLerMuloNON OQMOdeQMe aQd morRalORy durOQS 1UU0-2000.A), B(*,C De+,2h E*F+n 1UU4V72(2)P213-20 Bellamy R, RueQde C, Corra T,e2 +,. VarOaROoQN OQ Re NRAMX1 SeQe aQd NuNMeROLOlORy Ro RuLerMuloNON OQ eNR A_rOMaQN.= GnF, H IeC 1UUV33W10)P 640-4 彭卫生,王英年,肖成志.新编结核病学M.北京:中国医药科技出版社, 2003:1U5 GrueQeOd a, XOQQer b, DeNcardOQN M, e2 +,J NaRural reNONRaQMe Ro OQ_eMROoQ OR OQRraMellular aRoSeQNPRe Nram1 roReOQ ON reMruORed Ro Re memLraQe o_ Re aSoNome.H GKL IeC 1UU7V15W4)P717-30 aueT d, aueToYa L, NelNoQ H, e2 +,; A yeaNR maQSaQeNe RraQNorRer relaRed Ro Re maMroaSe roReOQ OQYolYed OQ MoQ_errOQS reNONRaQMe Ro myMoLaMRerOa. ?*(/ =+2, M/+C /i N M 1UU6VU3W10)P5105-10 1 2 3 4 5 6 表5基因型与肺结核病变性质的单因素分析Wn/e) 多态性位点 渗出性干酪 性病灶为主 增殖性病灶为主 43/42.2 14/63.6 31/42.5 16/31.4 3.362 1.570 !2? 5U/57. /46.4 42/57.5 35/6.6 0.067 0.143 D543N G/G基因型 D543N G/A基因型 3'UTR +/+基因型 3'UTR +/del基因型 表6基因型与肺结核病变程度的关系Wn/e) 多态性位点 肺结核病变程度(NTA分类法) 63/61. 13/5U.1 4/65. 2/54.U 3.601 1.77U !2? D543N G/G基因型 D543N G/A基因型 3'UTR +/+基因型 3'UTR +/del基因型 13/121.7 6/27.3 U/12.3 10/1U.6 0.165 0.411 轻度中度重度 26/25.5 3/13.6 16/21.U 13/25.5 NTA分类法:轻度:无空洞,病变范围相加不超过两个肺野;中度:有空洞,病变范 围相加不超过两个肺野;重度:有空洞,病变范围相加超过两个肺野 向您报告一条本刊的最新信息 经新出报刊!“#$%283#;?)#;.ABC)*+,;#.-ABC)*+, 咨询电话%#“+:“*)#, “# “$ %$ “$ ;E2 J76:7223:76 K2;2L3*= !“