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一氧化氮在结肠黏膜上皮细胞氧化损伤中的作用观察 梅 俏1， 许建明1， 项 立1， 魏 伟2， 徐叔云2 2005 -08 -11 接收 作者单位： 安徽医科大学第一附属医院1消化内科、 2 临床药理研究 所， 合肥 230032 作者简介： 梅 俏， 33 岁， 男， 博士， 副教授； 许建明， 50 岁， 男， 教授， 博士生导师， 通讯作者， Tel： （0551） 2922039， E-mail：meiqiao hotmail. com 摘要 目的 探讨一氧化氮 （NO） 在结肠黏膜上皮细胞氧化 损伤中的作用及褪黑素的影响。方法 利用 FeSO4+ H2O2 产生羟自由基损伤结肠黏膜上皮细胞， 观察 L-精氨酸、 L- NAME 对模型中 NO 合成的影响及相应细胞损伤程度的改 变， 并观察褪黑素对该过程的影响。实验检测指标包括乳酸 脱氢酶 （LDH） 、 丙二醛 （MDA） 、 谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH- Px） 、 过氧化氢酶 （CAT） 、 超氧化物歧化酶 （SOD） 、 NO 和黏液 含量。结果 模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞 MDA 和 LDH 水平增高， CAT、 GSHPX、 SOD 和黏液含量减少，NO 水平增 高与结肠黏膜上皮细胞氧化损伤相关， L-精氨酸和 L-NAME 通过促进或抑制 NO 合成， 显著加重或减轻这种氧化损伤。 褪黑素可逆转羟自由基及 NO 引起的氧化损伤。结论 NO 直接参与羟自由基对结肠黏膜上皮细胞的氧化损伤， 褪黑素 通过直接清除羟自由基和 NO 及可能形成的过氧化亚硝基 阴离子， 对大鼠结肠黏膜氧化损伤具有保护作用。 主题词 褪黑激素/ 药理学；肠黏膜/ 细胞学；上皮细胞/ 药 物作用；结肠炎；一氧化氮 中图分类号 R 329. 2；R 977. 1； R 322. 45 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 01 -0038 -03 大量研究表明， 炎症性肠病 （inflammatory bowel disease，IBD） 患者和实验性结肠炎动物的结肠黏膜 中活性氧及其引起的细胞氧化损伤明显增强， 其中 羟自由基在结肠黏膜细胞的损伤中起主要作用 1。 同时， 在肠黏膜炎症过程中诱生性一氧化氮合酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的表达和活 性及其产物一氧化氮 （nitric oxide，NO） 含量明显增 加， 并与炎症程度相关， 抑制 NO 合成可减轻结肠炎 症 2。因此，通过建立羟自由基氧化损伤大鼠结肠 黏膜上皮细胞模型， 加入 L-精氨酸和 L-NAME， 从促 进和抑制 NO 合成的角度， 观察并阐明 NO 在结肠 黏膜上皮细胞氧化损伤过程中的作用。另一方面， 褪黑素具有清除 NO、 过氧化亚硝基阴离子及抗结 肠炎作用 3， 在上述研究基础上， 现进一步探讨褪 黑素的作用机制。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 动物 SD 大鼠， ,兼用， 体重 280 g ± 20 g， 普通级， 购于安徽医科大学实验动物中心。在室 温、 光照周期 （12h : 12h） 条件下饲养 1 周后使用。 1. 1. 2 药物与试剂 褪黑素、 萘乙烯二胺盐酸盐、 二盐酸邻联茴香胺、 胶原酶、 L-精氨酸、 L-NAME 为 美国 Sigma 公司产品； 1， 1， 3， 3-四乙氧基丙烷、 硫代 巴比妥酸为瑞士 Fluka 公司产品； DTNB、 胰蛋白酶、 二硫苏糖醇、 台盼蓝由华美生物工程公司提供； 还原 型谷胱甘肽、 SOD 标准品为中科院上海生化所产 品； 小牛血清白蛋白由北京邦定生物医学公司提供； 辅酶 I 由上海蓝季科技发展有限公司提供； 链蛋白 酶为 Serva 公司产品； 小牛血清由安徽医科大学微 生物教研室提供， 临用前 56 热灭活； 阿利新蓝由 上海化学试剂采购供应站提供； 其它试剂均为国产 分析纯试剂。 1. 2 方法 1. 2. 1 大鼠结肠黏膜上皮细胞分离方法及氧化损 伤模型制备 按文献 4 方法， 采用链蛋白酶消化 法制备结肠黏膜上皮细胞， 加入 24 孔培养板， 每孔 含结肠黏膜上皮细胞 1 ×106， 置37， 5% CO2培养 箱中培养 2 h 后， 加入 FeSO420µl 及 H2O220 µl （终 浓度均为 10 mmol/ L， 培养液终体积 2. 0 ml） ， 利用 FeSO4+ H2O2产生羟自由基体外攻击结肠黏膜上皮 细胞， 继续培养 3 h。取出 4 离心， 3 000 r/ min × 10 min， 取上清测乳酸脱氢酶 （lactic dehydrogenase， LDHs） 。振荡使细胞悬浮， 超声波匀浆 30 s， 重复 3 次， 离心取上清测 LDH （LDHT） 、 丙二醛 （malondia- dehyde，MDA） 、 谷胱甘肽过氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSHPx） 、 过氧化氢酶 （catalase，CAT） 、 超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 、 NO 和黏液含量。MDA、 GSHPx、 CAT、 SOD、 NO、 LDH 和 黏液含量测定均按参考文献方法进行 5。 1.2. 2 大鼠结肠黏膜上皮细胞及药物处理 实验 设正常对照组、 模型组、 模型 + L-精氨酸组 （10 µmol / L） 、 模型 + L-NAME组 （10µmol / L） 、 模型 + ·83·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） 表 1 褪黑素对结肠上皮细胞损伤模型中 LDHS/ LDHT、 黏液、 MDA 和 NO 含量的影响（%x ± s，n =4） 组别 剂量 （µmol/ L） LDHS/ LDHT 黏液 （mg） MDA （µmol/ L） NO （µmol/ L） 正常26.3 ±5.6a0. 881 ±0. 025a0. 50 ±0. 06a37. 0 ±1. 5a 模型-71.1 ±7.20. 624 ±0. 0232. 42 ±0. 1564. 8 ±0. 7 模型 + L-Arg1088.5 ±7.1a0. 561 ±0. 045b3. 08 ±0. 43a78. 5 ±16. 9c 模型 + L-NAME1067.3 ±3.2c0. 684 ±0. 014a1. 85 ±0. 02a40. 3 ±0. 6a 模型 + melatonin1.041.2 ±4.4a0. 778 ±0. 003a1. 17 ±0. 02a48. 2 ±1. 5a 模型 + L-Arg + melatonin1.054.6 ±6.3d0. 786 ±0. 003d1. 24 ±0. 02d45. 3 ±2. 3d 与模型对照组比较： bP 0. 05； 与模型 + L-Arg 组比较：dP 0. 05； 与模型 + L-Arg 组比较： dP 0. 01 3 讨论 氧自由基是 IBD 肠黏膜的主要损伤因素之 一 6， 利用 Fenton 反应产生的羟自由基攻击结肠黏 膜上皮细胞， 导致培养上清的 MDA 含量增高， GSH- PX、 SOD、 CAT 水平下降， 引起反映细胞损伤程度的 LDH 含量增高， 反映细胞合成功能的黏液水平下 降， 充分证明氧自由基可直接引起肠黏膜损害。另 一方面， 结肠黏膜上皮细胞在羟自由基攻击下 NO 含量增加， 加入 L-精氨酸和 L-NAME 则分别增加和 减少 NO 合成， 提示 NO 的增加与氧自由基损伤有 关， 但氧自由基引起 NO 产生增多的机制目前尚不 清楚， 有待于进一步研究。褪黑素可显著降低 LDH、 NO 和 MDA 含量， 恢复 GSHPX、 SOD、 CAT 和 黏液水平， 对结肠黏膜上皮细胞具有直接保护作用， 可能与褪黑素直接清除羟自由基有关， 并与其抗结 肠炎作用的研究一致。 NO 在整体水平对结肠黏膜上皮细胞起着保护 ·93·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） 与损伤的双重效应，L-精氨酸途径的 NO 合成可能 介导结肠炎症 7。Rachmilewitz et al8发现抑制 iN- OS 表达、 减少 NO 产生可能是治疗 IBD 的有效靶点 之一。目前推测羟自由基引起结肠黏膜上皮细胞合 成 NO 增加， 并进一步与 Fenton 反应中的超氧阴离 子形成细胞毒性强于 NO 的过氧化亚硝基阴离子， 与酪氨酸反应破坏细胞的功能和结构， 引起组织损 伤。这一直接的细胞毒性作用在体外实验中显得更 加突出， 在反应体系中加入底物 L-精氨酸和特异性 NO 合成抑制剂 L-NAME， 可显著加重或减轻结肠黏 膜上皮细胞的氧化损伤。其中， L-NAME 主要通过 抑制 iNOS 减少 NO 含量， 减轻结肠损伤和炎症 9。 褪黑素可直接清除 NO 和过氧化硝基阴离子， 并可有效抑制 iNOS 活性， 减少 NO 合成， 发挥保护 作用。因此， 在底物 L-精氨酸存在的条件下， 褪黑 素可迅速清除羟自由基， 同时快速清除 NO 和过氧 化亚硝基阴离子，更加有效的减轻由此引起的双重 氧化损伤， 但这一过程的详细机制需进一步探讨。 参考文献 1 Hata Y，Kawabe T，Hiraishi H，et al. Hydrogenperoxide-media- ted cytotoxicity to cultured colonic epithelial cells J . Life Sci， 1997， 60 （24） ： 2221 -30. 2 Cross R K，Wilson K T. Nitric oxide in inflammatory bowel dis- ease J . Inflamm Bowel Dis， 2003， 9 （3） ： 179 -89. 3 Mei Q， Yu J P， Xu JM， et al. Melatonin reduce colon immunolog- ical injury in rats by regulating activity of macrophage J . Acta Pharmacologica Sinica， 2002， 23 （10） ： 882 -6. 4 Baten A， Sakamoto K， Shamsuddin A M. Long-term culture of nor- mal human colonic epithelial cells in vitro J . FASEBJ， 1992， 6： 2726 -34. 5 梅 俏， 项 立， 赵宗豪，等. 褪黑素对结肠黏膜上皮细胞氧 化应激的影响 J . 安徽医科大学学报， 2003， 38 （3） ： 191 -4. 6 Keshvarzian A， Morgah G， Sedghi S， et al. Role of reactive oxygen metabolites in experimental cotilis J . Gut， 1990， 31 （7） ： 786 - 90. 7 Neilly P J，Kirk S J，Gardiner K R，et al. Manipulation of the L- arginine-nitric oxide pathway in experimental colitis J .Br J Surg， 1995， 82 （9） ： 1188 -91. 8 Rachmilewitz D，Karmeli F，Okon E，et al. Experimental colitis is ameliorated by inhibition of nitric oxide synthaseactivity J . Gut， 1995， 37 （2） ： 247 -55. 9 Middleton S J，Shorthouse M，Hunter J O. Increased nitric oxide synthesis in ulcerative colitis J . Lancet， 1993， 341 （8843） ： 465 -6. Effects of nitric oxide on oxidative injury of colonic mucosal epithelial cells induced by hydroxyl radical Mei Qiao，Xu Jianming，Xiang Li， et al （Dept of Digestion， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022） Abstract Objective To investigate the pathogenesis role of nitric oxide （NO）on the oxidative injury of colonic mucosal epithelial cells induced by hydroxyl radical and the effects of melatonin on this oxidative injury. Methods The oxidative injury model of colonic mucosal epithelial cells was produced by hydroxyl radical generated from the Fenton reaction. L-Arginine was used to increase NO levels while L-NAME lowered its levels in the oxidative injury model，and the effects of melatonin on this model were also observed. At the end of the experiment， the con- tent of lactic dehydrogenase （LDH） ，malondiadehyde（MDA） ，glutathione peroxidase （GSHPx） ，catalase（CAT） ， superoxide dismutase（SOD） ，NO and mucus in the supernatant were detected. Results The content of LDH and MDA elevated while the content of GSHPx，CAT，SOD and mucus reduced in model group，particularly contents of NO increased in parallel with the degree of oxidative injury of the colonic mucosal epithelial cells. NO production which enhanced by L-Arginine while inhibited by L-NAME，significantly strengthened or ameliorated this oxidative injury. Melatonin inversed this oxidative injury caused by hydroxyl radical combined with NO. Conclusion Data show that NO directly plays a role in oxidant injury of colonic mucosal epithelial cells induced by hydroxyl radical. As one of the strongest scavengers of hydroxyl radical，NO and peroxynitrite probably form in the course of cellular oxidative reaction. Melatonin has protective effects on rat colon mucosal oxidative injury. MeSH melatonin/ pharmacology；intestinal mucosa/ cytology；epithelial cells/ drug effects；colitis；nitric oxide ·04·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1）