不同舌苔舌上皮细胞的凋亡及相关基因分子机理研究.pdf

中国中西医结合杂志2 0 0 5 年 1 1 月第 2 5 卷第 1 1 期 C J I T WM, N o v e m b e r 2 0 0 5 , V o l . 2 5 , N o . II 不同舌苔舌上皮细胞的凋亡及相关基因分子机理研究 吴正治 李 明 张盛薇2 蔡英3 张永锋 陈馒菌 摘要目的探讨不同舌苔舌上皮细胞凋亡及其相关基因表达的关系。方法运用末端脱氧核普酸转 移酶介导的脱氧尿啥咤核普三磷酸缺口末端标记技术、 原位杂交、 免疫组化和图像分析技术， 检测常见舌苔 舌上皮细胞凋亡及凋亡相关基因b a x , f a s , T G F - 那 m R N A和蛋白产物。结果 4 种常见舌苔其舌上皮细胞 均可见细胞凋亡发生， 不同舌苔变化趋势与凋亡指数变化趋势相反。与正常及薄苔比较， 剥苔b a x , f a s 基因 过度表达伴随细胞凋亡增多， 而厚苔b a x , T G F - 邓m R N A低表达伴随细胞凋亡减少。舌苔上皮细胞中 促凋 亡基因b a x , f a s , T G F - 那表达水平变化趋势与细胞凋亡水平变化趋势一致。结论凋亡相关基因b a x , f a s , T G F - 那表达水平的变化可能是影响舌苔上皮细胞凋亡， 并导致不同舌苔变化的重要原因。 关键词舌苔; 原位缺口末端标记技术; 原位杂交; 免疫组织化学; 图像分析 S t u d y o n t h e Mo l e c u l a r Me c h a n i s m o f L i n g u a l E p i t h e l i a l C e l l A p o t o s i s a n d i t s R e l a t e d G e n e s i n D i f f e r e n t T o n g u e F u r s WU Z h e n g - z h i ， L l Mi n g , S h e n g We i ， e t a l C l i n i c a l I n s t i t u t e o f I n t e g r a t i v e T r a d i t i o n a l C h i n e s e a n d We s t e r n Me d i c i n e o f S h e n z h e n C i t y ， G u a n g d o n g( 5 1 8 0 3 1 ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f l i n g u a l e p i t h e l i a l c e l l ( L E C ) a p o p t o s i s a n d i t s r e l a t e d g e n e s e x p r e s s i o n i n d i f f e r e n t t o n g u e f u r s . Me t h o d s T h e L E C a p o p t o s i s a n d i t s r e l a t e d g e n e s e x - p r e s s i o n i n c l u d i n g b a x ， f a s , T G F - 月 3 m R N A a n d p r o t e i n p r o d u c t i n t o n g u e f u r w a s d e t e r m i n e d u s i n g t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e n i c k e n d l a b e l l i n g t e c h n i q u e ( T U N E L ) ， i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ， i mm u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e a n d i m a g e a n a l y s i s . R e s u l t s L E C a p o p t o s i s c o u l d a l w a y s b e s e e n i n 4 t y p e s c o m mo n l y e n c o u n t e r e d t o n g u e f u r . T h e t e n d e n c y o f c h a n g i n g i n t h i c k n e s s o f t o n g u e f u r w a s o p p o s i t e t o t h a t o f a p o p t o t i c i n d e x . C o m p a r e d w i t h n o r m a l t h i n f u r , b a x a n d f a s g e n e s w e r e o v e r - e x p r e s s e d i n e x f o l i a t i v e f u r w i t h i n c r e a s e d a p o p t o s i s ， w h i l e i n t h i c k f u r , b a x a n d T G F - R 3 g e n e s w e r e l o w - e x p r e s s e d a n d a c c o m p a n i e d w i t h d e c r e a s e d a p o p t o s i s . T h e l e v e l o f a p o p t o s i s p r o m o t i n g g e n e s , b a x , f a s ， T G F - 俘3 g e n e e x p r e s s i o n i n L E C s h o w e d a t e n d e n c y p a r a l l e l t o t h a t o f L E C a p o p t o s i s . C o n c l u s i o n C h a n g e o f a p o p t o s i s r e l a t e d g e n e s e x p r e s s i o n , b a x , f a s a n d T G F - 俘 3 m a y e f f e c t t h e L E C a p o p t o s i s a n d b e t h e i m p o r t a n t f a c t o r f o r c h a n g i n g o f t h e t h i c k n e s s o f t o n g u e f u r . K e y w o r d s t o n g u e f u r ; T U N E L ; i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ; i mm u n o h i s t o c h e m i c a l ; i m a g e a n a l y s i s 舌苔变化能较为客观地反映病情， 察舌辨证能指 导临床用药 。 有关舌苔变化机理的研究虽已深人到 亚细胞水平 2 - 4 ) ， 但在基因水平的研究尚属罕见。为 此， 本课题自2 0 0 0 年 1 月一 2 0 0 3年 1 2月运用末端脱 氧核昔酸转移酶介导的脱氧尿嚓陡核昔三磷酸( d - U T P ) 缺口末端标记技术( t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d - U T P n i c k - e n d l a b e l l i n g t e c h - 其金项目: 国家自 然科学基金资助项目( N o . 3 9 7 7 0 8 9 0 ) 作者 单 位: 1 . 广 东 省深 圳 市 中西 医结 合 临床 研 究 所 ( 广 东 5 1 8 0 3 1 ) ; 2 . 广东省深圳市中医院; 3 . 深圳市第二人民医院口腔科 通 讯 作者: 吴正治， T e l : 0 7 5 5 - 8 3 2 4 6 3 9 3 , E - m a il : z h e n g z h w ) y a h o o . n i q u e , T U N E L 技术) 检测舌苔上皮细胞凋亡情况， 并 用原位核酸分子杂交、 免疫组织化学技术对凋亡相关 基因b a x , f a s , T G F - 阳在正常及常见病理舌苔上皮细 胞中的m R N A转录水平及蛋白产物进行测定， 以期从 基因分子水平阐明常见舌苔的形成机理和影响因素。 资料与方法 1 资料来源病理舌苔受检者均系深圳市第二 人民医院门诊及住院患者， 病种不限， 但注意各组病种 分布的平衡; 正常组选择无全身各系统器质性病变， 并 排除近月内舌、 口、 鼻、 咽等局部病变， 舌质淡红、 舌苔 薄白而润者。参考 中医诊断学 舌诊标准辨舌苔( 5 1 中国中西医结合杂志 2 0 0 5 年 1 1 月第 2 5 卷第 1 1 期 C J I T WM, N o v e m b e r 2 0 0 5 , V o l . 2 5 , N o . 1 1 分为4 组: 正常组 1 2例， 男 6 例， 女 6 例; 年龄2 4 一6 8 岁。薄苔组3 0 例， 男 1 4 例， 女 1 6 例; 年龄2 1 一7 3 岁。 厚苔组 3 0 例， 男 1 7例， 女 1 3例; 年龄 2 4 一6 8岁。剥 苔组 1 6 例， 男 7例， 女 9例; 年龄 1 9 一7 5 岁。经统计 学分析， 各组性别、 年龄分布比较差异无显著性。 取材: 每位观察对象用经高温高压消毒的丝瓜络 用力刮取舌背中部( 花剥苔者取无舌苔覆盖部位表层) 舌苔， 装于有预冷生理盐水( 含 0 . 1 % D E P C ) 的1 0 m l 具塞离心管中， 洗涤、 涂片后一 7 0 密闭保存备测。 2 主要试剂抗 B a x , F a s 蛋白多克隆抗体为美 国O n c o g e n e 公司产品; 第二抗体 E n v i s i o n +、 抗体稀 释液均购自美国D A K O公司; T U N E L细胞凋亡检测 试剂盒， b a x , f a s , T G F - 叩 原位杂交检测试剂盒、 抗 T G F - 邓多克隆抗体均为武汉博士德公司产品; 二乙基 焦碳酸醋( D E P C ) 购自华美生物工程公司; 多聚- L 一 赖 氨酸为S ig m a 公司产品; 其余试剂均为国产分析纯。 3方法 3 . 1 细胞凋亡的测定 采用 T U N E L法。所有 标本涂片用 4 %多聚甲醛固定 1 5 m i n , P B S洗涤 3 m i n ， 共2 次， 双蒸水洗涤3 m i n ， 共2 次; 3 %H 2 q 浸泡 3 0 m i n ， 双蒸水洗涤 5 m i n ， 共 3 次; 涂片加标记缓冲液 湿润后， 加标记液3 7 标记2 h , T B S 洗涤5 m i n ， 共3 次; 加封闭液封闭3 0 m i n ; 加生物素化抗地高辛抗体， 3 7 C孵育 3 0 m i n , T B S洗涤 5 m i n ， 共 3 次; 加 S A B C , 3 7 C孵育6 0 m i n , T B S 洗涤5 m i n ， 共 4 次; D A B显色。 阳性反应为细胞核中有棕黄色颗粒， 阴性对照( 以标记 缓冲液代替标记液) 细胞核中无棕黄色颗粒。 3 . 2 b a x , f a s , T G F - (3 3 m R N A的测定 采用原位 杂交法， 按试剂盒说明书操作。阳性杂交信号为棕黄 色， 阴性对照( 用预杂交液代替杂交液) 为无色。 3 . 3 b a x , f a s , T G F - 邓 蛋白的测定 采用免疫组 化标记葡聚糖多聚体( l a b e l l e d d e x t r a n p o l y m e r , L D P ) 法。所有标本涂片以冷丙酮固定 1 5 m i n ， 双蒸水充分 洗涤; 0 . 5 % H 2 0 2 / 甲醇溶液浸泡 3 0 m i n , P B S洗涤 5 m i n ， 共3 次; 加第一抗体后， 4 C孵育 1 7 h , P B S 洗涤5 m i n ， 共3 次， 加E n v i s i o n + 3 7 C孵育4 0 m i n , P B S 洗涤 5 m i n ， 共3 次; D A B 显色。阳性反应信号为棕黄色， 阴 性对照( 以P B S 代替一抗) 为无色。 3 . 4图像半定量分析 采用 C MI A S真彩色病理 图像分析系统( 空军总医院生物医学工程研究所研 制) ， 在光镜下( x 4 0 0 ) 每张涂片随机选取 5 个视野， 对 T U N E L 法结果以平均每 1 0 0 个细胞中所含凋亡细胞 数作为凋亡指数( A I ) ; 对原位杂交和免疫组化涂片， 测定每张涂片的阳性细胞率( %) 和阳性单位( P U 值) 。 4 统计学方法结果中阳性细胞率的比较均先 经过平方根反正弦变换后采用单因素方差分析和 q 检验( N e w m a n - K e u l s 法) a P U值的比较则直接进行 单因素方差分析和4 检验。 阳性率的比较采用 2X 检验。 结果 1 不同舌苔舌上皮细胞 A l ( %, x士、 ) 测定结果 A l : 与正常组( 2 . 2 8 士1 . 5 7 ) 和薄苔组( 2 . 2 7 士1 . 4 5 ) 比 较， 剥苔组( 3 . 9 9士1 . 9 3 ) 升高( 尸 0 . 0 5 ) ， 而厚苔组 ( 1 . 1 0 士 0 . 6 7 ) 降低( 尸0 . 0 5 ) ， 厚苔组与剥苔组间比 较差异有显著性( P0 . 0 1 ) 。各组舌苔中以剥苔组 A l 最高。 2 不同舌苔舌上皮细胞T G F - 邵原位杂交和免疫 组化测定结果 见表1 o T G F - 邵n iR N A和蛋白质在舌 苔脱落细胞除完全角化细胞外的各层部分细胞都可见 阳性着色， 但以颗粒层最明显， 原位杂交和免疫组化方 法中阳性细胞率: 厚苔组和剥苔组与正常组和薄苔组比 较， 差异有显著性( P 0 . 0 5 或 P 0 . 0 1 ) ; 厚苔组和剥 苔组阳性细胞率比较差异也有显著性( P 0 . 0 5 ) o P U 值各组间比较差异均无显著性。在薄苔组或厚苔组中， 不同 颜色( 黄、 白) 舌苔间T G F ，一 田m R N A和蛋白阳性细 胞率和阳性单位值差异均无显著性。 表 1 不同舌苔舌上皮细胞T G F - 阳原位杂交 和免疫组化测定结果比较( x士、 ) 组别 例数 原位杂交免疫组 化 正常 薄苔 厚苔 剥苔 阳性细胞率( %) 1 3. 7 5士3. 0 8 1 4. 7 3士3. 8 9 9 . 4 5 士3 . 7 2 * 0 P u值阳性细胞率( %)P u值 9. 3 6士2. 4 5 9. 03士 2. 1 3 1 3. 6 2士3. 8 2 1 3. 4 5士4. 8 4 7. 9 2士2 1 6 5 . 2 7 土 2 . 1 8 * * 8 . 0 6 士1: : 9. 8 3士2. 7 0 5. 6 2士2. 6 4 9. 4 9士1 . 9 0 9. 3 1士1 . 7 5 ， ， 8 . 0 7 士1 . 8 3 * * A 8. 8 5士2. 3 3 乙nUCU 1门、内、 注: 与正常组比较， * P 0 . 0 5 , * * P0 . 0 1 ; 与薄苔组比较， 0P 0 . 0 5 , 0 0 P 0 . 0 1 ; 与厚苔组比较， A P 0 . 0 5 3 不同舌苔舌上皮细胞 b a x原位杂交和免疫组 化测定结果见表2 . b a x 基因在 m R N A和蛋白质两 个水平的表达趋势一致， 在舌苔脱落细胞各层部分细 胞( 完全角化细胞除外) 均有弱阳性表达。 两种方法中 表 2 不同舌苔舌上皮细胞 b a x 原位杂交 和免疫组化测定结果比较( x士、 ) 组别 例数 原位杂交免疫组化 阳性细胞率( %)P U值阳性细胞率 %)P u值 正常 薄苔 厚苔 剥苔 2. 8 6士0. 9 8 2. 4 9士1. 0 2 1 . 1 2 士0 . 6 7 * 0 4 . 7 7士2 . 0 2* AA 4. 1 1士1 . 2 7 4. 3 1士1 . 5 3 4. 0 5士1 . 1 7 4. 7 0士2. 0 8 2. 8 7士0. 9 6 2. 21士 1. 1 5 1 . 1 6士0. 6 7 4. 8 2士 2. 1 8: 立 4. 8 1士 1 . 6 3 4. 7 4士 1 . 9 1 4. 5 4士 1 . 7 6 4. 4 2士 2. 0 6 乙nUnU石U 1.且内、1二 注: 与正常组比较， * P 0 . 0 5 ; 与薄苔组比较， 0 P0 . 0 5 ; 与厚苔 组比较， p 0 . 0 1 中国中西医结合杂志2 0 0 5 年 1 1 月第 2 5 卷第 1 1 期 C J I T WM, N o v e m b e r 2 0 0 5 , V o l . 2 5 , N o . I I b a x阳性细胞率: 剥苔组和厚苔组与正常组和薄苔组 比较， 差异均有显著性( P0 . 0 5 ) ， 厚苔组与剥苔组间 比较差异有显著性( P0 . 0 1 ) ， 但以剥苔组 b a x阳性 细胞率最高。P U值各组间比较差异无显著性。在薄 苔组或厚苔组中不同颜色( 黄、 白) 舌苔间b a x m R N A 和蛋白阳性细胞率和阳性单位值比较差异无显著性。 4 不同舌苔舌上皮细胞 f a s 原位杂交和免疫组 化测定结果见表 3 o f a s m R N A和蛋白质都只在部 分观察对象舌苔脱落细胞中有微弱阳性表达， 并且原 位杂交和免疫组化阳性表达情况一致。剥苔 f a s 阳性 率高于其他各组( P 0 . 0 5 ) . 表3 不同舌苔舌上皮细胞 f a s 原位杂交 和免疫组化测定结果比较( 例) 上皮细胞中b a x , f a s , T G F 一 邵等基因 起促进凋亡的 作 用(s ,9 ) 。本课题首次从m R N A和蛋白质两个水平探讨 了b a x , f a s , T G F - R 3 基因在舌苔上皮细胞凋亡中的变 化规律。我们发现， 与正常及薄苔比较， 剥苔 b a x , f a s 基因过度表达伴随细胞凋亡增多， 而厚苔b a x , T G F - 邓 基因低表达伴随细胞凋亡减少。舌苔上皮细胞中促凋 亡基因b a x , f a s , T G F - 邵表达水平变化趋势与细胞凋 亡水平变化趋势一致。结果提示凋亡相关基因 b a x , f a s , T G F - 邵表达水平的变化可能是影响舌苔上皮细 胞凋亡并导致舌苔厚度变化的重要原因。深人研究其 他凋亡相关基因特别是抑制凋亡的 b c l - 2等基因在常 见舌苔舌上皮细胞中的表达规律， 对阐明舌苔形成的 基因水平的物质基础和机理有重要意义。 组别例数 原位杂交 、 免疫组化 阳性阴性 参考文献 ，.了OllC， 11勺勺 正常 薄苔 厚苔 剥苔 1长 4赞 3任 7 12303016 注: 与剥苔组比较， * P 0 . 0 5 在薄苔组或厚苔组内部， 经四格表资料的精确概 率法计算， 不同颜色( 黄、 白) 舌苔间f a s m R N A和蛋白 阳性细胞率和阳性单位值比较差异均无显著性。 讨论 细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程， 它 参与机体许多的生理、 病理过程， 如胚胎发育、 免疫调 节、 衰老过程、 肿瘤发生等( 6 ) 。在正常表皮中， 上皮角 质形成细胞通过调节其增殖、 分化、 凋亡的过程来维持 表皮结构的动态平衡川。对于同属于复层扁平上皮的 舌豁膜上皮， 本课题用 T U N E L技术证实了舌上皮细 胞在增殖、 分化的同时， 有一部分细胞发生了细胞凋 亡。舌苔的厚度与舌上皮细胞的增殖、 分化及凋亡之 间的平衡密切相关。当舌上皮细胞增殖与分化、 凋亡 处于相对平衡状态时， 舌苔表现为薄苔。而当细胞增 殖占优势， 细胞凋亡和分化相对占劣势时， 舌上皮细胞 增多， 舌苔即变厚; 反之则出现剥苔。而我们临床上常 见到痰湿证患者， 其特征性的体征之一是舌苔厚腻。 根据中医辨证给予化湿药后 1 - - 2天左右厚腻苔开始 消退。化湿药物及其他多类中药是如何影响舌苔消长 的， 其中是否涉及到凋亡调控机制改变， 值得进一步 研究。 细胞凋亡的调控是多种基因综合作用的结果， 在 1李乃民主编. 中国舌诊大全 北京: 学苑出版社， 1 9 9 4 : 5 4 5 - 5 8 8 . L i N M, e d i t o r . C h i n e s e c o l l e c t i o n o f t o n g u e d i a g n o s i s . B e ij i n g : A c a d e my P r e s s , 1 9 9 4 : 5 4 5 一5 8 8 . 2 吴正治， 郭振球， 谢锦玉. 胃院痛属脾虚者舌苔上皮的细胞化 学研究. 中医杂志 1 9 9 2 ; 3 3 ( 2 ) : 4 1 一 4 2 . Wu Z Z , G u o Z Q, Me J Y. C y t o c h e m i c a l s t u d y o f t o n g u e f u r i n p a t i e n t s w i t h s t o m a c h a c h e o f s p l e e n d e f i c i e n c y s y n d r o m e . J T C M 1 9 9 2 ; 3 3 ( 2 ) : 4 1 一4 2 . 3 吴正治. 舌苔原理研究. 广州: 中山大学出版社， 1 9 9 8 ; 9 一 1 0 . Wu Z Z . O n m e c h a n i s m o f t o n g u e f u r s . G u a n g z h o u : Z h o n g s h a n U n i v e r s i t y P r e s s , 1 9 9 8 : 9 一1 0 . 4 昊正治， 周小青， 郭振球， 等. 虚寒薄白苔的细胞化学初步研 究. 中国中西医结合杂志 1 9 9 3 ; 1 3 ( 1 1 ) : 6 4 9 一 6 5 1 . Wu Z Z , Z h o u X Q , G u o Z Q, e t a l . A p r i ma r y s t u d y o n c y t o - c h e mi c a l o f t h i n a n d w h i t e t o n g u e f u r i n p a t i e n t s w i t h c o l d o f i n s u f f i c i e n c y t y p e . C h i n J I n t e g r T r a d i t We s t Me d 1 9 9 3 ; 1 3 ( 1 1 ) : 6 4 9 一 6 5 1 . 5 朱文锋主编 中医诊断学. 上海: 上海科学技术出版社， 1 9 9 8 4 2 . Z h u WF , e d i t o r . D i a g n o s t i c s o f t r a d i t i o n a l C h i n e s e m e d i c i n e . S h a n g h a i : S h a n g h a i S c i e n t i f i c a n d T e c h n i c a l P u b l i s h e r s , 1 9 9 8 : 4 2 . 6 G a s t ma n B R, F u t r e l l J W, Ma n d e r s E K. A p o p t o s i s a n d p l a s t i c s u r g e r y . P l a s t R e c o n s t r S u r g 2 0 0 3 ; 1 1 1 ( 4 ) : 1 4 8 1 一1 4 9 6 . 7 T a k a h a s h i H, A o k i N, N a k a mu r a S , e t a l . C o r n i f i e d c e l l e n v e - l o p e f o r m a t i o n i s d i s t i n c t f r o m a p o p t o s i s i n e p i d e r m a l k e r - a t i n o c y t e s . J D e r m a t o l S c i 2 0 0 0 ; 2 3 ( 3 ) : 1 6 1 一1 6 9 . 8 T e r a k i y , S h i o h a r a T . A p o p t o s i s a n d s k i n . F u r J D e r m a t o l 1 9 9 9 ; 9 ( 5 ) : 4 1 3 一4 2 5 . 9 R o s f j o r d E C , D i c k s o n R B . G r o w t h f a c t o r s , a p o p t o s i s a n d s u r - v i v a l o f m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s . J Ma m m a r y G l a n d B i o l N e o - p l a s i a 1 9 9 9 ; 4 ( 2 ) : 2 2 9 一2 3 7 . ( 收稿: 2 0 0 5 一 0 4 一 0 2 修回: 2 0 0 5 一 0 6 一 2 0 )