伊马替尼联合 P27基因克隆对慢性粒细胞白血病 K562细胞的作用.pdf

1473实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 13 期 ·基 础 研 究· 伊马替尼联合 P27 基因克隆对慢性粒细胞白血病 K562 细胞的作用 王玮孙秉中谢红药立波 摘要目的：探讨伊马替尼和 P27 基因克隆联合作用对 K562 细胞的细胞增殖、 细胞周期及凋亡等的调控作用。 方 法： RT-PCR 扩增 P27 基因， 胶纯化回收后连接到 T 载体测序， 序列正确后构建 P27-pcDNA3. 1 载体， 将 P27-pcDNA3. 1 与 空载体分别以脂质体转染入 P27 基因缺失的 K562 细胞， 经筛选得到 G418 抗性的 K562 细胞株， Western blot 证实转染后 有 P27 蛋白表达， MTT 法检测细胞生长指数和细胞存活率， 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。 结果： 表达外源性 P27 蛋白 的 P27-pcDNA3. 1-K562 细胞株生长速度明显慢于对照 K562 细胞株， 流式细胞仪显示 G0 / G1 期细胞增多， S 期细胞明显 减少，P27-pcDNA3. 1-K562 细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升，MTT 法显示细胞存活率较 P27-K562 细 胞组及伊马替尼 - K562 细胞组均明显下降 ( P 0. 01 vs P27-K562 细胞组, P 0. 05 vs 伊马替尼 - K562 细胞组)。结 论： 表达外源 P27 蛋白联合应用伊马替尼对抑制 K562 细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。 关键词基因产物， rex哌嗪类克隆, 分子增殖抑制凋亡 Effect of imatinib combined with P27 gene clone on chronic myeloid leukemia cell line K562WANG Wei*，SUN Bing-zhong, XIE Hong， YAO Li-bo. *Department of Hematology, 175 Hospital of PLA, Zhangzhou 363000, China 【Abstract】 ObjectiveTo explore the effect of imatinib combined with P27 gene clone on the proliferation, cycle and apoptosis of chronic myeloid leukemia cell line K562.MethodsP27 gene was amplified from peripheral blood mononuclear cells by RT-PCR, and its sequences were confirmed. P27-pcDNA3. 1 vector was constructed and then transfected into P27 gene-deleted K562 cell line by lipofectine. After screened with G418, P27-pcDNA3. 1-K562 cell clone that stably expressed P27 was isolated. P27 protein was identified by Western blot. The cell survival rate was tested by MTT, cell cycle and apoptosis were tested by flow cytometry.ResultsThe expression of P27 protein could be detected by Western blot in P27-pcDN3. 1-K562 cells. A strong inhibition of cell proliferation was observed in P27-pcDNA3. 1-K562 cell compared with the control K562 cell. P27-pcDNA3. 1-K562 cells increased apparently in G0 / G1 phase but declined greatly in S phase. Cell cycle was arrested in G0 / G1 phase. The percentage of apoptosis greatly increased after P27-pcDNA3. 1-K562 cells were combined with imatinib and the cell survival rate greatly declined.ConclusionImatinib combined with P27 gene clone has a synergetic effect on inhibiting cell proliferation and promoting apoptosis of K562 cell. 【Key words“ Gene product, rex PiperazinesCloning, molecularProliferation inhibitionApoptosis 绝大多数慢性粒细胞白血病具有具特征的 Ph 染 色体， 形成异常 Bcr-abl 融合基因， 编码的 P210 蛋白具 有很强的酪氨酸激酶活性，在慢粒发病中起到重要作 用。特异性针对 P210 蛋白激酶的酪氨酸激酶抑制剂 伊马替尼具有高度特异性的抑制作用 1，开创了慢粒 分子靶向治疗的新纪元。但其仍存在着耐药、停药后 复发以及对急变期细胞疗效差等诸多问题 2，因而探 讨联合治疗是其研究的一个发展方向。P27 是细胞周 期蛋白激酶抑制剂家族中重要的一员, 被认为具有抑 癌基因样作用3， 其缺失、 突变或表达降低在肿瘤发病 中发挥重要作用，与伊马替尼联合应用有可能发挥更 理想的治疗作用。 1材料与方法 1. 1试剂伊马替尼 （瑞典 Novartis 公司赠送， 商品 名格列卫） ， 用三蒸水配制成 1. 00 mmol / L 溶液， 过滤 除菌。限制性内切酶 EcoRI 和 Hind、 Taq DNA 聚合 酶、 T4 连接酶、 逆转录酶等工具酶分别购自宝泰克、 上 海生工公司， Trizol RNA 提取试剂、 DNA 纯化试剂购自 Invitrogen 公司，P27 鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠二抗 购自 Santa cruz 公司， G418 购自华舜公司。 1. 2细胞培养K562 细胞（含 Bcr-abl 融合基因，表 达 P210 蛋白）按常规方法在含体积分数为 100 mL / L 的小牛血清的 RPMI1640 培养基中培养于体积分数为 50 mL / L 的 CO2孵箱中。 1. 3菌种和质粒pcDNA3. 1 真核克隆表达质粒购 自美国 Invitrogen 公司， E. coli JM109 菌种由本校生化 教研室提供。 1. 4引物设计与合成P27 上游引物序列：5' GTAAGCTTATGTCAAACGTGCGAGTGTCTA 3'，下游 基金项目： 国家自然科学基金项目(编号： 39770336) 作者单位： 363000福建省漳州市，中国人民解放军第 175 医院 血液科 (王玮， 谢红)； 710032西安市， 第四军医大学西京医院血 液科(孙秉中)； 710032西安市， 第四军医大学生物化学和分子生物学 教研室(药立波) 实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 13 期1474 1、阳性对照（P27 基因与外周血细胞杂交） ；2、阴性结果（P27 基因与 K562 细胞杂交） ； 3、 阳性对照 （P27 基因与胃组织杂交） 图 2 P27 基因与 K562 细胞 Southern 杂交阴性 1、 DGL2000 DNA marker； 2、 从外周血单个核细胞中扩增的 P27 基因 （约 600 bp） ； 3、 从 K562 细胞中扩增的基因片段 图 1 RT-PCR 方法扩增的 P27 基因 引 物 ： 5' TGGAATTCTTACGTTTGACGTCTTCTGAGG 3'， 上下游分别加入 Hind和 EcoRI 酶切位点， 扩增产 物约 600 bp， 引物由上海生工公司合成。 1. 5RT-PCR用 Trizol 从外周血单个核细胞提取 总 RNA，反转录成 cDNA 后进行 PCR，cDNA 0. 2 µg、 10 mmol / L 的 dNTP 0. 5 µL、 引物 10 pmol、 Taq DNA 聚 合酶 1U， 反应体系 25 µL， 94 45 s、 55 40 s、 72 1 min， 30 个循环， 最后延伸 30 min， 产物经 1%琼脂糖电 泳， EB 染色后在紫外反射投射仪扫描成像。 1. 6Southern blot检测 P27 基因提取外周血单个 核细胞及 K562 细胞总 RNA， 反转录成 cDNA， 0. 8%碱 性琼脂糖电泳后进行 Southern 印迹。具体方法详见参 考文献463 - 66。 1. 7PCR 产物胶回收将 PCR 产物电泳条带切下， 用胶回收液试剂盒回收 PCR 产物， 乙醇沉淀。 1. 8T 载体连接及 DNA 序列测定取胶回收产物 5 µL， 加 T 载体 1 µL、 快速连接液 4 µL， 16孵育 4 h 后 转化入 JM109 菌株，蓝白筛选后挑取白色克隆摇菌， 酶切鉴定后将阳性克隆送上海生工公司测序。 1. 9P27-pcDNA3. 1 重组质粒的构建和转染用 Hind 和 EcoRI 内切酶分别将 pcDNA3. 1 和连接上 P27 的 T 载体酶切, 在 T4 连接酶作用下进行重组连 接, 转化到 JM109 菌株中, 酶切鉴定的阳性克隆提取 质粒, 用脂质体转染至 K562 细胞。 48 h 后细胞培养在 含 500 mg / L 的 G418 的 1640 培养液中进行稳定转染 筛选阳性克隆， 28 d 后将筛选阳性克隆存种。 1. 10Western blot 检测 P27 蛋白、cyclinE 蛋白表达 具体方法详见参考文献4366 - 373。 1. 11MTT 法检测细胞生长指数及细胞存活率将 5 × 104/ mL 细胞分别接种于 96 孔板， 实验分 P27 作用 组、 伊马替尼作用组、 联合作用组。每组设 3 孔， 取平 均值， 培养 1、 2、 3、 4、 5 d 后， 分别记数细胞， 绘制细胞 生长曲线及细胞存活率。实验重复 3 次。 1. 12流式细胞仪测定细胞周期及凋亡脂质体转 染 P27-pcDNA3. 1 载体至 K562 细胞， 与伊马替尼共同 作用 48 h 后， 收集细胞， PBS 洗 2 次， 700 mL / L 的预 冷乙醇固定 2 h 以上，经磷酸钠 - 柠檬酸钠缓冲液抽 提处理， RnaseA 消化， 碘化丙锭染色 30 min 后， 应用 流式细胞仪进行测定。 1. 13统计学处理用 SPSS 11. 0 统计软件进行数 据分析，组间比较采用重复测量数据方差分析，两两 比较采用 Dunnett t 检验。 2结果 2. 1RT-PCR 扩增 P27 基因通过 RT - PCR 方法 从外周血单个核细胞扩增 P27 基因的全长 cDNA 序 列， 用于构建 P27-pcDNA3. 1 质粒载体， 产物在 1%琼 脂糖下电泳，可见约 750 bp 处有一阳性条带，片段大 小与设计的 P27 基因全长 cDNA 序列大小一致；同时 以相同引物从 K562 细胞扩增出与 P27 基因片段大小 相似的 DNA 片段。见图 1。 2. 2Southern blot 证实 K562 细胞中 P27 基因杂交 阴性见图 2。 2. 3重组质粒的构建将从外周血单个核细胞扩增 的 P27 基因全长 cDNA 序列及 pcDNA3. 1 质粒分别用 Hind 和 EcoRI 酶切，形成黏性末端后以 T4 连接酶 连接，构建 P27-pcDNA3. 1 重组质粒，将重组质粒用 Hind 和 EcoRI 酶切鉴定，约 600 bp 处可见酶切的 DNA 片段， 大小与 P27 基因的全长 cDNA 大小序列一 致。见图 3。 1、 P27-pcDNA3. 1-K562 重组载体酶切结果； 2、 P27-PMC-pcDNA3. 1 重组 载体酶切结果； 3、 DGL2000 DNA marker 图 3 通过 EcoRI 和 HindIII 酶切 P27-pcDNA3. 1 载体结果 1475实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 13 期 P27-pcDNA3. 1 重组质粒的 K562 细胞生长速度较对 照 K562 细胞明显减慢，转染 P27-pcDNA3. 1 的 K562 细胞与伊马替尼联合应用后其细胞存活率与单纯加 入 伊 马 替 尼 的 未 转 染 K562 细 胞 及 单 纯 转 染 P27-pcDNA3. 1 的 K562 相比均明显降低 (分别 P 0. 05 和 P 0. 01)。见图 8。 3讨论 P27 属于细胞周期素依赖激酶抑制物中 CIP / KIP 图 5 P27-K562-pcDNA3. 1 重组载体基因测序结果 （非因特异 性扩增） 2. 4P27 基因序列分析证实扩增的 P27 基因序列 与设计序列完全一致， 见图 4。同时从 K562 细胞扩增 的 DNA 片段测序, 序列完全不一致， 见图 5, 说明为非 特异扩增， 亦可证实 P27 基因在 K562 细胞中缺失。 2. 5表达 P27 基因的细胞株 P27-pcDNA3. 1-K562 的建立将重组构建的 P27-pcDNA3. 1 真核表达载体 转染 K562 细胞，经 G418 筛选 2 周后形成稳定表达 P27 蛋白的 P27-pcDNA3. 1-K562 细胞株。 经过 Western blot 检测证实此细胞株有 P27 蛋白的高效表达，同时 检测到此细胞株中 cyclinE 蛋白表达降低， 在蛋白定量 一致情况下， 以各细胞表达量一致的 -actin 蛋白作为 内参照， 见图 6。 2. 6细胞周期及凋亡变化正常对照 K562 细胞 为高 S 期细胞，各期细胞比例为：G1 期 30. 2%, S 期 57. 4% , G2 / M 期 12. 3% ; 转染 P27-pcDNA3. 1 质粒 48 h 后 K562 细胞周期分布为：G1 期 52. 5% ，S 期 38. 6% , G2 / M 期 8. 9% 。转染 P27 基因未出现凋亡 峰。取 0. 25 µmol / L 浓度的伊马替尼作用于 K562 细 胞 48 h 后未出现凋亡峰，细胞周期分布为：G1 期 78. 7%, S 期 20. 3%, G2 / M 期 1. 0%。将此浓度的伊 马替尼加入转染 P27-pcDNA3. 1 重组载体的 K562 细 胞，48 h 后能够诱导出明显的凋亡峰 ( 凋亡比例 32. 4% )， S 期细胞比例明显下降(13. 3% )。见图 7。 2. 7转 染 P27-pcDNA3. 1 细 胞 生 长 状 况转 染 图 4 P27-PMC-pcDNA3. 1 重组载体基因测序结果（P27 基因 特异性扩增） 1、正常对照 K562 细胞周期 (G1 期 30. 2% , S 期 57. 4% , G2 / M 期 12. 3% )；2、P27 作用后 K562 细胞周期 (G1 期 52. 5% , S 期 38. 6% , G2 / M 期 8. 9% )； 3、 0. 25µmol / L 伊马替尼作用后 K562 细胞周期(G1 期 78. 7% , S 期 20. 3% , G2 / M 期 1. 0% )； 4、伊马替尼和 P27 联合作用后 K562 细胞周期 和凋亡(凋亡比例 32. 4% , S 期 13. 3% ) 图 7 伊马替尼和 P27 对 K562 细胞周期和凋亡影响 图 6 Western 杂交检测 P27 和 cyclinE 蛋白表达 1、 -actin 蛋 白 阳 性 对 照 ,2、 K562 细 胞 中 -actin 蛋 白 , 3、 P27-pcDNA3. 1-K562 细 胞 中 -actin 蛋 白 ,4、 P27 阳 性 对 照 , 5、 P27-pcDNA3. 1 K562 细胞中 P27 阳性表达, 6、K562 细胞中 cyclinE 蛋白 阳性表达 , 7、 P27-pcDNA3. 1- K562 细胞中 cyclinE 蛋白表达下降 实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 13 期1476 图 8 伊马替尼和 P27 对 K562 细胞存活率的影响 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 （cdk-interacting protein / kinase inhibitor protein） 家族， 主 要与 cyclinE-CDK2 结合抑制它们的激酶活性。我们通 过构建 P27-pcDNA3. 1 载体转染 CML 急变细胞系 K562，经 G418 筛选的 P27-pcDNA3. 1-K562 细胞其细 胞生长速度明显低于对照细胞，流式细胞仪检测其主 要阻滞于 G0 / G1 期，Western blot 证实 cyclinE 蛋白表 达降低，说明其通过对 cyclinE-CDK2 的抑制，使细胞 周期阻滞于 G0 / G1 期， 抑制细胞通过 G1 / S 期检测点 而进入 S 期复制，从而发挥生长抑制作用。本实验同 时发现 P27-pcDNA3. 1 与伊马替尼联合作用后对 K562 细胞增殖抑制起协同作用， 推测其机制与伊马替 尼对细胞周期调控作用有关。 DEININGER 等 5和 JONULEIT 等 6分别发现伊马替尼能下调 cyclinE 和 cyclinD 蛋白的表达， 并使过高的 S 期细胞恢复到正常 水平。 本实验证实 P27-pcDNA3. 1 与伊马替尼联合应用 在促进 K562 细胞凋亡方面起协同作用。 P27 对白血病 细胞的凋亡作用有不同的意见。EYMIN 等7发现 p27 能阻止药物诱导的细胞凋亡，认为是白血病细胞能诱 导 P27 水解， 产生的 P23 和 P15 两种氨基末端肽具有 抗凋亡作用； 而 BARATA 等 8发现高表达 P27 可抑制 IL-7 介导的 Bcl-2 升高从而诱导白血病细胞凋亡。 PATEL 等 9通过腺病毒载体将 P27 基因转染靶细胞 表达 P27 蛋白，可诱导多种肿瘤细胞系凋亡。故 P27 是促进还是抑制凋亡作用必须视其裂解状态、细胞类 型、 细胞状态而定。 Bcr-abl 与 P27 关系失调在 K562 细 胞发病机制中起到重要作用， PARADA 等 10观察到 Bcr-abl 能下调P27 蛋白和 mRNA 的水平，主要通过 PI3K 途径，而伊马替尼不仅能阻止 Bcr-abl 引起的 P27 下调， 还能诱导 P27 蛋白表达增加， 主要原因是抑 制了 PI3K 信号通路， 同时引起 P27 降解减慢， 同时发 现伊马替尼能抑制多种细胞周期素的表达，从而解除 对 P27 蛋白的抑制。因此， 转染 P27 基因不仅在 K562 细胞中重建了细胞周期调控通路，而且伊马替尼与 P27 联合应用后加强了 P27 的诱导凋亡作用，表现出 协同作用。 由于联合应用伊马替尼和 P27 基因克隆后细胞 增殖能力明显降低， 同时凋亡比例明显上升， 且 FANG 等11及 CASLINI 等12分别证实伊马替尼和 P27 有促进 细胞分化的作用， 因此， 联合伊马替尼及 P27 基因治疗 应用于临床有广阔的前景意义。 4参考文献 BUCHDUNGER E，ZIMMERMANN J，METT H，et al.Inhibition of theABLprotein-tyrosinekinaseinvitroandinvivobya 2-phenylaminopyrimidine derivative J. 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