丹参饮应用于运动损伤性血瘀证治疗机理的实验研究.pdf

第2 4卷第9 期 2 006年 9月 中医药学刊 CHI NE SE AR CHI V E S OF T R A DIT I ON A L CHI NE SE ME DI CI NE . 2 4 N o . 9 .20 0 6 丹参饮应用于运动损伤性血痕证治疗机理的实验研究 王 滔 ， 王大 安2 ( I . 广州市番禺职业技术学院， 广东 广州5 1 1 4 8 3 ; 2 . 广州体育学院， 广东 广州5 1 0 0 0 7 ) 摘要: 目 的: 探讨丹参饮治疗运动损伤性血0证机理， 观察丹参饮对急性缺血组织病理改变及细胞凋亡干 预作用。方法: 采用结扎冠状动脉左前降支的方法复制急性组织缺血模型， 巧 条犬随机分为对照组、 模型组、 丹 参饮组， 每组5 条。采用H E染色 及D N A末端标记法( T U N E L ) 分别观察组织病理变化和细胞调亡的变化。结 果: 对照组组织无明显变性与坏死等改变， 仅见少量凋亡阳性细胞; 模型组有明显组织坏死， 细胞凋亡增多; 丹参 饮组示细胞坏死及细胞凋亡均较模型组显著减轻。结论: 丹参饮可有效抑制细胞坏死及凋亡， 减轻组织损伤， 对 缺血组织有保护作用。 关键词: 运动损伤性血疥证; 坏死; 调亡 中图分类号: R- 3 3文献标识码: B文章编号: 1 0 0 9 - 5 2 7 6 ( 2 0 0 6 ) 0 9 一1 6 4 6 - 0 2 祖国医学认为血癖证应包括两个方面。一是血不循 经， 溢出脉外， 不能及时消散的一类寮血; 二是运行于脉中 之运行不畅的癖血。由此可见目 前运动损伤造成的血痕证 均可以用此种理论加以分析， 并且可以以此为据指导治疗。 目 前， 临床之中多用丹参饮为基础方进行加减配伍治疗运 动损伤性血癖证， 并且取得了很好的疗效。为了了解丹参 饮治疗运动损伤性血痕证的具体机理， 本实验就丹参饮对 急性缺血组织病理改变及细胞凋亡的干预作用进行了实验 研究。 1 材料和方法 1 . 1 实验动物和药物健康成年杂种犬， 体重( 1 1 士 3 ) k g ， 雌雄不拘; 丹参饮按文献剂量购买中药材， 浸泡、 煎煮、 浓缩、 灭菌、 4 冷藏保存备用。戊巴比妥钠由上海化学试 剂厂进口分装。 1 . 2 实验器材D H一 1 动物人工呼吸机( 型号: D H一 1 , 浙江医科大学医疗仪器实验厂制造， 流量: I O m Uk g ， 呼吸 频率2 0 次/ m i n ， 呼吸比1 : 2 ) ; B 3 双目 摄影生物显微镜( 麦 克奥迪实业集团公司) ; 体视显微镜图象系统 S M Z一 1 4 3 ( 麦克奥迪实业集团公司) ; 6 1 一 1 海鸥照相机( 上海光耀电 影照相厂) ; F i n e s s e 3 2 5 ( T h e r m o S h a n D o n l i m it e d A s t m o o r . R u n c o r n , s h e s h ir e , W A T I P R U K ) ; 气管 插管 及相应的 手术 器械。 1 . 3 实验方法 动物模型复制: 参考文献 用戊巴比 妥钠( 3 0 m g / k g , i v ) 麻醉犬， 固定， 铺巾单， 行气管插管并连 接动物呼吸机。分离股静脉， 插管予0 . 9 %生理盐水补液。 取胸骨正中切口暴露心脏， 剪开心包并缝至胸壁呈摇篮状， 于冠状动脉左前降支第二角支处穿线， 对照组仅穿线不结 扎， 余各组行完全结扎。动物分组与给药: 实验分组: 先 按体重分层， 再用随机数字表法随机分为3 组: 对照组、 模 型组、 丹参饮组， 每组5 条。造模前灌胃 给药， 每天1 次， 给 药剂量2 0 m Uk g ， 连续5 天， 对照组及模型组: 蒸馏水; 丹参 饮( 含生药1 0 . 2 g / 1 0 k g “ d - ' ) 。 连续灌胃5 天， 并于第5 天 冯连泽， 王卫， 杨莲雪， 等. 当归补血汤对脑缺血的保护作用 的 形态学研究 J . 科技前沿, 2 0 0 0 ， ( 1 ) : 巧 王伟中， 乌云娜， 王爱萍. 当归补血汤的血液流变学研究 J · 内 蒙 古中 医 药， 2 0 0 5 , ( 1 ) : 3 4 陈淑民， 孟华民. 当归补血汤抗氧化作用的研究 J . 四川省 卫生管理干部学院学报， 1 9 9 5 , 1 4 ( 2 ) ; 3 阴祯宏， 李兰芳， 金亚宏， 等. 当归补血汤抗自由基作用的药 效 动 力学 研 究【 J . 中 国 实验 方 剂 学 杂志， 1 9 9 9 , 5 ( 1 ) : 2 4 阴祯宏， 李兰芳， 金亚宏， 等. 运用药效动力学研究方法观察 中药含药血清与整体药效的相关性 J . 中国中医药信息杂 志， 1 9 9 9 , 6 ( 1 1 ) : 3 2 尹艳艳， 王宇翔， 江勤， 等. 当归补血汤的镇痛作用【 J . 安徽 医科大学学报， 2 0 0 0 , 3 5 ( 5 ) : 3 5 5 彭延宽. 当归补血汤对肝硬化门脉高压血液动力学的影响 J · 山 东中医 药大学学报， 2 0 0 0 , 2 4 ( 5 ) : 3 7 3 张莹雯， 谢丹. 当归补血汤对糖尿病大鼠肾组织的保护作用 J . 中 成药， 2 0 0 5 , 2 7 ( 1 ) : 7 5 李德妓， 蒋伯龄， 朱元莉. 当归补血汤对高眼压兔视网膜神 经节细胞凋亡的抑制作用【 J . 中国中医眼科杂忠， 2 0 0 5 , 1 5 ( 1 ) : 3 0 ，J，J 2内、 八j门j resJFesL 气1.J，J 4哎一 八j内j rJrL ，J，J 户011 冉内j 厂ILrL ，J，J n69 八j飞 厂rL 2 6 阴祯宏， 李兰芳， 金亚宏， 等. 运用药效动力学研究方法观察 中药含药血清药理与整体药效的相关性 J . 中国中医药信 息杂志， 1 9 9 9 , 6 ( 1 1 ) : 3 2 2 7 刁凤声， 张丽秋， 孔力， 等. 当归补血汤对小鼠肝癌淋巴道转 移和脾细胞凋亡的影晌【 J . 中药药理与临床， 1 9 9 9 , 1 5 ( 2 ) : 7 2 8 孔祥英. 黄蔑与当归配伍的免疫实验研究 J . 山东中医药 大学学报， 1 9 9 7 ; 2 1 ( 4 ) : 2 6 6 仁 2 9 郝江， 文家福， 成诗黔， 等. 当归补血汤对创伤小鼠 血日 一内 啡肤和皮质醇的影响与免疫保护作用【 J J . 中国中西医结合 急救杂志， 2 0 0 0 , 7 ( 4 ) : 2 3 4 3 0 马世平， 杨汉样墨， 瞿融， 等. 当归补血汤及其组成药物对红 细胞免疫功能的影响 J . 中成药， 1 9 9 0 , 1 2 ( 8 ) : 2 3 3 1 吴大正， 宋纯清， 韩之芬， 等. 当归补血汤对心肌缺血再灌注 损伤大鼠 心功能的 作用【 J . 中 药药理与临床， 1 9 9 9 , 1 5 ( 5 ) : 1 中医药 1 6 4 6 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 3 - 0 9 4 0 基金项目: 教育部青年骨干教师科研基金资助项目( 2 0 0 0 6 5 ) 作者简介: 王滔( 1 9 6 8 一 ) ， 男， 广州梅州人， 讲师， 学士， 主要从事高 校体育教育研究。 学刊 第9期王滔等: 丹参饮应用于运动损伤性血癣证治疗机理的实验研究 灌胃 后2 h 行完全结扎术， 对照组仅穿线不结扎。心肌组 织切片的制备: 实验结束后处死动物， 摘取动物心脏于4 % 多聚甲醛中固定， 常规石蜡包埋， 每隔I m m横断面切数张 4 t,m厚的切片， 分别做H E 染色及细胞凋亡检测。 1 . 4 心肌细胞凋亡原位标记检测及计算机图象分析 每 张切片取3 个不同部位的切片各2 张， 以脱氧核昔酸转移 酶( T d T 酶) 介导的荧光的d U T P 缺口末端标记法( T d T - m e d i a t e d fl u o r e s c e i n 一 d U T P n i c k e n d l a b e li n g , T U N E L ) 标记 凋亡细胞核D N A 3 、 一 O H末端。其主要步骤为: 切片常规脱 蜡人水， 标本片加T B S 1 : 2 0 0 新鲜稀释 P r o t e i n a s e K 3 7 消化 1 5 m i n , 0 . 3 % H 2 0 : 甲醛灭活内源性过氧化物酶( P O D ) 活 性， 加人T U N E L 混合液( 含 T d T 酶及 fl u o r e s c e i n 一 d U T P ) ， 3 7 9 0 孵育 I h ， 加人 P O D转换液， 3 7 C 孵育 3 0 m i n , D A B显 色， 苏木素轻度复染， 脱水， 透明， 封片。正常细胞核呈蓝 色， 凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。切片于光镜下2 0 0 倍放大， 经图象分析仪随机选择 1 0 个视野， 检测阳性表达 率( 阳性核占视野中总细胞核百分比) ， 作为细胞凋亡指数 ( A p o p t o s i s I n d e x , A I ) 。 1 . 5 数据处理采用S P S S 1 0 . 0 软件包处理， 组间比较方 差齐时用方差分析， 方差不齐对数转换后用方差分析。结 果以X土: 表示。 2结果 2 . 1 组织病理学分析 组织病理学分析染色见对照组组 织无明显变性， 坏死等改变， 肌纤维染色均匀， 横纹清晰， 肌 间质无炎细胞浸润， 无出血， 无坏死; 模型组有部分肌灶性 坏死， 肌间质有出血， 炎细胞浸润; 丹参饮组.示部分肌纤维 波浪状， 肌浆分布不均， 肌间质无出血。 表 1 细胞凋亡图象分析结果( X士 : ) 单位面积数细胞凋亡指数( A I ) 4 . 2 0 t 1 . 4 8. 3 5 . 0 0: t 4 . 3 0 2 1 . 0 0士3 . 7 0. 胞凋亡显著减少， 见表 t o 3 讨论 细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的生理死亡过程， 是 维持细胞增生与死亡间平衡的重要方式。在缺血缺氧状态 下， 细 胞 可 发 生 凋 亡川。 细 胞 凋 亡是 缺 血 组 织 损伤的 重 要 机 制 ， 可 导 致组织重 构川。 这可能与 钙稳 定失衡， 线粒 体 损 伤及 氧自 由 基损 伤有关 5 。 在缺 血缺氧 状态下， N H E ( N a 一 H e x c h a n g e r ) 被激活， 导致细胞内N a ' 浓度增高， 从 而促使N a ' - C a t 交换增加， 导致胞内C 扩 十 浓度增高， 激 活一氧化氮酶， 黄嗓吟氧化酶及损伤线性粒体电子链， 导致 一氧化氮， 超氧阴离子等自由 基产生增加， 从而促使细胞凋 亡的发生， 引起蛋白质氧化， D N A断裂， 细胞膜出泡， 内陷 等细胞凋亡的典型特征。 本实验研究采用完全性结扎冠状动脉前降支的方法， 造成缺血模型。从而用 H E染色及 D N A末端标记法 ( T U N E L ) 分别观察组织病理变化与细胞凋亡的变化。研 究发现对照组无细胞变性与坏死， 仅见极少量凋亡阳性细 胞; 模型组有明显组织坏死， 细胞凋亡增多; 丹参饮组细胞 坏死及凋亡均显著减轻。研究结果表明丹参饮可有效抑制 细胞坏死及凋亡， 减轻细胞损伤， 对缺血组织有保护作用。 这可能与丹参饮能维持C a t 平衡， 抗线粒体损伤及氧自由 基损伤有关， 这有待进一步探讨。 参考文献: 1 谭红梅， 张建萍， 吴伟康， 等. 复方血栓通胶囊对实验性犬缺 血心肌的保护作用【 J . 第一军医大学学报， 2 0 0 0 , 2 0 ( 3 ) ; 2 4 1一 2 4 4 2 F l i s s H , C a t ti n g e r D A . A p o p t o s is in i s c h e m i c a n d r e p e r f u s e d d r a t m y o c a r d i u m J . C i r c R e s , 1 9 9 6 , 7 9 ; 9 4 9 一 9 5 6 3 H a n J u r g e n B r o m in e , J u r g e n H o l t z . a p o p t o s i s i n h e a rt ; w h e n a n d w h y J . M o l C e l l B i o c h , 1 9 9 6 , 1 6 3 : 2 6 1 一 2 7 5 4 C o l u c c i W S . M o l e c u l a r a n d C e l la r m e c h a n i s m s o s m y o c a r d ia l f a i l tu r e J . A m J C a r d l a l , 1 9 9 7 , 8 0 ( L 1 A ) : 1 5 L 一 2 5 L 5 C h a k r a b a r ti S , H o q u e A N E , K a r m a z y e n M . A r a p i d i s c h e m ia i n - d u c e d a p o p t o s i s i n i s o l a t e r a t h e a rt a n d i t s a t t e l l a t i o n b y t h e s o d i - u m一 h y d ro g e n e x c h a n g e i n h i b i t o r H O E , 6 4 2 ( c a r i p o r id e ) J . J M o l C e ll C a n d i a l , 1 9 9 7 , 2 9 : 3 1 6 9 一 3 1 7 4 nll00 511、 对照组5 模型组5 丹参饮组 5 注: 与模型组比较， *P 0 . 0 1 o 2 . 2 细胞凋亡分析对照组无细胞变性与坏死， 仅见极 少量凋亡阳性细胞; 模型组细胞凋亡明显增多; 丹参饮组细 T h e s t u d y o f M a c h a n is m a b o u t T h e I s c h e m i c o f S p o r t s I n j u r e C u r e d D a n S h e n Y i n D e c o c t io n W a n g T a o ' , W a n g D a a n 2 ( 1 . P a n y u V o c a t i o n a l S k i ll s U n i v e r s i t y o f G u a n g z h o u , G u a n g z h o u 5 1 1 4 8 3 , G u a n g d o n g , C h i n a ; 2 . G u a n g z h o u U n i v e r s i t y o f P h y s i c a l E d u c a t i o n , G u a n g z h o u 5 1 0 0 7 5 , G u a n g d o n g , C h i n a ) 中医药 A b s t r a c t : O b j e c t i v e : T o s t u d y o f m e c h a n i s m a b o u t t h e i s c h e m i c o f s p o r t s i n j u r e c u r e d D a n S h e n Y i n d e c o c t i o n . M e t h o d s : F i f t e e n d o g s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o 3 g r o u p s : c o n t r o l g r o u p , i s c h e m i c g r o u p , D a n S h e n Y i n g r o u p . T h e l e f t a rt e ry w a s l i g a t e d t o m a k e a m o d e l o f a c u t e i s c h e m i c . T h e c h a n g e s i n p a t h o l o g y a n d c e l l a r a p o p t o s i s n u m b e r o f c e ll a r a p o p t o s i s i n D a n S h e n Y i n g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h o s e o f i s c h e m i c g r o u p . a nt e rio rd e s c e n d i n g c o r o n a ry 学刊 w e reT L I l l e d e t e c t e d . R e s u l t s : n u mb e r o f T h e c e ll s 1 6 4 7 i n c r e a s e d K e y i n i s c h e mi c w o r d s : t h e g r o u p . C o w i s c h e mi c o f s l e s i o n : D a n S h e n Y i n D e c o c t i o n c a n p r o t e c t i s c h e m i c t i s s u e . p o rt s i nu re; n e c r o t i c c e ll s ; c e ll a r a p o p t o s i s