二氧化碳安乐死在实验动物中的应用与最新进展.pdf

2 0 0 9 年8 月 第1 9 卷第8 期 中国比较医学杂志 C H N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E A u g u s t ，2 0 0 9 V 0 1 1 9 N o 8 厅e g 喵) 墨综述与专论I j 也M 、! 镕、±目、±目e ；妙 二氧化碳安乐死在实验动物中的应用与最新进展 张潇1 ，谭德讲1 ，李保文2 ，梁春南2 ，李明2 ( 1 中国药品生物制品检定所；2 国家药物安全评价监测中心) 【摘要】本文概述了二氧化碳( C 0 2 ) 安乐死法的作用机制、c 0 ：使用浓度、应用范围和操作注意事项，并讨论 了该方法的动物福利、设备改进等问题。 【关键词】二氧化碳；安乐死；动物，实验 【中图分类号】R 3 3 【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 2 0 0 9 1 0 8 0 0 8 1 0 4 A p p l i c a t i o na n dP r o g r e s so fC a r b o nD i o x i d eE u t h a n a s i si nL a b o r a t o r yA n i m a l s Z H A N GX i a 0 1 ，T A ND e ·j i a n 9 1 ，L IB a o - w e n 2 ，L I A N GC h u n l l a n 2 ，L IM i n g z ( 1 N a t i o n a lI n s t i t u t ef o rt h eC o n u o lo fP h a r m a c e u t i c a la n dB i o l o g i c a l P r o d u c t s ； 2 N a t i o n a lC e n t e rf o rS a f e t yE v a l u a t i o no fD r u g s ) 【A b s t r a c t 】 A so i l eo ft h ew i d e l yu s e d k i l l i n gt e c h n i q u e sf o rl a b o r a t o r ya n i m a l s ，t h eC O ；e u t h a n a s i sm e c h a n i s m ， c o n c e n t r a t i o nc o n t r o l ，a p p l i c a t i o ns c o p ea n dc a u t i o n so fc a r b o nd i o x i d ee u t h a n a s i sm e t h o df i f es u m m a r i z e di nt h i sp a p e r S o m en e w a d v a n c e so ft h i st e c h n i q u e ，s u c ha sw e l f a r ep r o b l e m sa n de q u i p m e n ti m p r o v e m e n t ，a r ea l s od i s c u s s e d ( K e yw o r d sJ C a r b o nd i o x i d e ；E u t h a n a s i a ；A n i r a a l ，L a b 随着人类对动物保护意识的加强和动物福利伦 理要求，对于必须使用实验动物进行研究的行业，安 乐死问题越来越受到广泛关注。任何一种安乐死方 法都是在追求处死动物时尽可能减少动物的疼痛和 痛苦或缩短疼痛和痛苦的持续时间n 。实验动物安 乐死方法主要分为三类：吸人药物法、非吸人药物法 和物理方法。 吸人药物法中的C 0 2 安乐死法，虽然在使用中 仍存在一些问题，但由于其对人类没有危害，使用方 便，成本较低等优点，已经被各国广泛应用于小型实 验动物上，包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔及禽类乜 。但 此法在使用中仍需注意一些问题，本文从C O ：安乐 死的作用机制出发，探讨了此法在应用中应注意的 问题。 1 C 0 2 安乐死的作用机制 安乐死药物通过三种机制引起动物死亡：( 1 ) 直 接或间接的缺氧；( 2 ) 生命功能的神经元抑制；( 3 ) 大 脑活动或生命功能神经元的直接破坏。二氧化碳法 是通过上述第一种途径即直接或间接的缺氧引起动 。物死亡的，它可以在各种场所使用，并可以不同的速 度使动物失去意识。要想达到无痛苦、无疼痛的死 亡，就要在动作( 肌肉活动) 消失之前丧失意识。但 是动作消失并不等同于丧失意识和没有痛苦。因 此，只能引起肌肉麻痹而不能使动物丧失意识的药 物不能作为单独的安乐死药物。二氧化碳法可能使 动物在丧失意识之后产生运动活动，但这些运动活 动只是反射活动，不能被动物感知¨J 。因此可以独 立的作为安乐死方法。 作者简介】张潇( 1 9 8 4 一) ，主要从事实验动物相关工作。 通讯作者】谭德讲( 1 9 6 5 一) ，舅主任技师主要研究方向：药理及实验动物管理。 万方数据 8 2中国比较医学杂志2 0 0 9 年8 月第1 9 卷第8 期C h i nJC o m pM e d ，A u g u s t2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 8 2 二氧化碳( C O ：) 安乐死方法的应用 2 1C 0 2 安乐死法的应用范围 二氧化碳在空气中的含量仅为0 0 4 ，比空气 重且无色无味。 C O ：安乐死法的应用范围广泛，多种动物都可 选用，但以啮齿类、禽类与兔最常用。表1 根据文献 概括显示了各类动物是否可以选用该方法。 表1 各种动物对c 0 2 安乐死法的使用情况 T a b 1T h ea p p l i c a t i o no fc a r b o nd i o x i d ee u t h a n a s i a i nd i f f e r e n ta n i m a l s 小鼠M o u s e 大鼠R a t 禽P o u l t r y 鱼F i 出 豚鼠G u i n e ap i g- 4 两栖类A m p h i b i a n s 兔R a b b i t 狗D o g s 猫C a t s 猪S w i n e 爬行动物R e p t i l e s O 海生哺乳动物 M a d n em a m m a l B 。 非人灵长类 O N o n h u m a np r i m a t e s 反刍类R u m i n a n t s X 注：可接受；在一定条件下才可接受；X ：不能使用 N o t e ：a c c e p t a b l e ；O ：a c c e p t a b l eu n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n s ；x ：c Mn o tb e u s e d 2 2C O ：安乐死法的浓度选用 C O ：要在肺泡中达到一定浓度才能导致动物死 亡，故动物的死亡需要一定时间。对一日龄的雏鸡 研究表明C O ：是有效的安乐死试剂，它几乎不引起 痛苦，抑制神经紧张活动，在5m i n 之内引起动物的 死亡。C O ：浓度越高，动物失去意识的时问就越短。 当C O ：浓度增长缓慢时，也会延长动物失去意识的 时间。表2 显示了不同浓度的C O ，对动物产生的 影响。 从表2 可以看出，随着C O ，浓度增高，动物失去 意识和死亡的时间在逐步缩短；但一些研究者发现， 吸人高浓度的C 0 2 会使动物感到痛苦，因为c 0 2 气 体在潮湿的鼻黏膜上溶解，产生碳酸，刺激鼻黏膜上 的伤害性感受器( n o c i c e p t o r ) 。一项研究表明，猪在 9 0 C 0 2 中会感到痛苦，而在3 0 C 0 2 中就不会感 到痛苦。3 0 。通过检测大鼠在3 3 C O ，的环境下I r a i n 之后的促肾上腺皮质激素、葡萄糖和血清中皮 质酮的含量，并没有发现其有明显的痛苦表现H 。 所以在给动物进行安乐死时，不要事先向C O ：箱中 通入C O ：气体，以免引起动物的痛苦，而应该在通 人C O ：时，通过流量控制，使浓度逐步增高以减少 动物感受到疼痛和痛苦的时间川。 上述方法主要适用于成年动物，而对于新生动 物，由于其对于C O ：有一定的耐受性，因此在使用 该方法时要注意C O ：浓度和时间的控制。呼吸活 动在胚胎发育时期就已经存在，未孵化的小鸡的生 存环境中C O ：的浓度达到1 4 。因此，在对刚孵出 的小鸡和其他动物的新生儿进行安乐死时，C 0 2 的 浓度一定要高，且持续时间要长。一些穴居动物，如 O r y c t o l a g u s 兔，可延长在C O ：环境中的存活时间，因 此对这些动物进行安乐死时，C O ：的浓度和持续时 间很重要。 3 二氧化碳( C O ：) 安乐死操作方法、注意事项及优 缺点 进行安乐死的C O ：瓶上要装有流量表和压力 调整器。最好安放在一可移动平台上。打开开关后 要让C O ：稳定的流入安乐死箱内。调整压力，控制 流速为安乐死箱容积的2 0 每分钟。如果流速过 快会产生噪声，引起动物应激。在动物失去意识之 表2 不同浓度c 0 2 对动物产生的影响 T a b 2E f f e c t so fd i f f e r e n tC 0 2c o n c e n t r a t i o no na n i m a l s 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年8 月第1 9 卷第8 期C h i nJC o m pM e d ，A u g u s t2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 8 8 3 后，可以加大流速到安乐死箱容积的1 0 0 每分钟 或者更高，以达到缩短动物从失去意识到死亡的这 段时间b 1 。在箱内下部加一个底篦，以防动物应激 产生的排泄物污染动物身体。箱体侧壁下方应设有 出气口，其对侧上方为进气口，以保证C O ，气体循 环。安乐死箱的箱体要透明、密闭、内外表面光滑， 易清洗，最好为硬塑材质1 。箱盖须与箱体要配套， 且密闭性好。开启时，动物可顺利放入箱内。放入 的动物数量要根据安乐死箱大小而定，不可造成拥 挤现象，且动物的整个身体都要进入安乐死箱。要 保证每次放进的动物是同一种类，如果是啮齿类动 物，则每次放进的动物在实验期时是在同一饲养盒 中饲养的，这样可避免动物产生恐慌。一般在3 0s 内，动物就会失去意识口o 。但要持续通人C O ：达2 r a i n 或者直到动物停止呼吸8 1 ，然后再关闭C O ：瓶 上的开关。 由于对动物吸入c 0 2 的时间掌握不准确，不同 种类动物安乐死所需时间也不一致，尤其是新生动 物，故有可能出现动物再度苏醒现象，所以确定动物 死亡很重要。确定动物死亡的方法一般有：( 1 ) 观察 法：如果没有其他的方法判断动物是否死亡，则动物 需要在安乐死箱内停留5m i n ，然后拿出在空气中再 观察5m i n ；( 2 ) 脱颈：完全失去意识的动物可使用脱 颈法使其死亡，这种方法只限于小鼠或2 0 0g 以下 的大鼠；( 3 ) 断头；( 4 ) 对深度麻醉的动物进行胸部切 开术：可以刺穿胸腔、打开胸腔、打开腹腔切开横膈 膜；( 5 ) 安乐死后用于实验，如进行采血，取脏器 等9 | 。 C O ：安乐死法在使用时应注意的事项：( 1 ) 要使 用1 0 0 的C O ：，且只能从C O ：瓶中通入到容器内， 不能用干冰、灭火器或化学方法得到的C O ：通入容 器，因为只有这样我们才能准确的控制流量。( 2 ) 不 同种类的动物要分开，且容器内不能一次放进很多 动物，造成拥挤。( 3 ) 最理想的流量是每分钟通入容 器容积的2 0 大小的C O ：。将动物放进安乐死箱之 前不要事先向安乐死箱内通人C O ：，因为动物突然 暴露在高浓度C O ：( 7 0 ) 的环境下会产生痛苦n 剖。 ( 4 ) 新生动物由于对缺氧有抵抗能力，所以在使用 C O ：法安乐死时，要同时使用些其他的物理安乐 死方法。( 5 ) C O ：安乐死的整个过程都要有人员照 看。 C O ：法应用广泛，其优点是：( 1 ) 能很快的起到 镇静、止痛和麻醉作用。( 2 ) 很容易买到C O ：瓶。 ( 3 ) 价格便宜，不易燃易爆，在通风良好的场所正确 使用较其他试剂更安全，不会对人产生毒害作用。 ( 4 ) 不会改变乙酰胆碱或。肾上腺皮质酮浓度u 川。缺 点是：( 1 ) 由于C O ：比空气重，当容器没被充满C O ：， 动物有可能将头抬起避开高浓度的C O ：。( 2 ) 一些 动物如穴居动物对C O ：有耐受性。( 3 ) C O ：安乐死 法比一些其他的安乐死方法用时长。( 4 ) 当引起意 识丧失时的C O ，浓度较低时( 8 0 ) ，可对肺和上 呼吸道组织造成损伤一，1 2 0 。( 5 ) 高浓度的C O ：可能 使一些动物产生痛苦。 4C O ：安乐死法尚需深入探讨的一些问题及最新 进展 任何一种安乐死方法由于在获得快速的死亡和 避免生理不适和疼痛之间存在潜在的平衡而变得复 杂。c 0 2 安乐死方法虽然在实验动物中广泛应用， 但也同样存在这样的问题。首先将C O ：气体用作 安乐死时，还没找到一种“理想”的方法使动物死亡， 不论是事先向安乐死箱中充入C O ：，还是放人动物 后再增加C 0 2 浓度都会产生福利问题。将动物放 在c 0 ：环境下会引起痛苦，脊椎动物的c 0 2 感受器 和p H 受体已经进化，C O ：可对脊椎动物产生有效的 刺激，能迅速引起呼吸困难。C O ：通过眼、鼻和口腔 黏膜转变成碳酸，可引起动物不适和疼痛。如果动 物有选择的自由，当C O ：浓度到达一定水平时，它 们会逃离浓度高的地方。因此使用C 0 2 法不可避 免的会给动物带来痛苦。 目前国内在进行C O ：安乐死时，普遍认为安乐 死箱内C O ：浓度越快达到1 0 0 越好，因此采用从 安乐死箱的底部进气，从上方出气，然而最新研究表 明这种做法会使得局部C O ：浓度高，使动物产生痛 苦，引起严重的动物福利问题。当C 0 2 浓度接近 7 时，人的呼吸频率和呼吸深度都会增加，当C O ： 浓度达到1 5 时，这些现象会更严重怕1 。如果将动 物放在一个含有高浓度( 5 0 ) C O ：的容器中，它们 在失去意识之前至少会感到1 0 1 5s 的疼痛。如果 将动物放在C O ：浓度逐渐增加的环境中，它们会因 为缺氧和呼吸困难而感到不愉快。虽然呼吸困难和 疼痛是一种主观感受，很难被诊断出来，但啮齿类动 物有可能和人一样，在上述C O ：浓度下产生同样的 感受Mo 。所以这个问题对实验动物来说也是一个福 万方数据 8 4中国比较医学杂志2 0 0 9 年8 月第1 9 卷第8 期C h i nJC o m pM e d ，A u g u s t2 0 0 9 V 0 1 1 9 N o 8 撤稿声明 应作者要求，中国比较医学杂志第1 9 卷第3 期稿件“S p i k e 蛋白B 细胞线性表位多肽在S A R S - C o V 感 染过程中作用的体内研究”( 第1 5 页) 和第1 9 卷第6 期稿件“S A I L S C o VS p i k e 蛋白来源多肽及其单克隆抗 体在S A R S C o V 感染过程中作用的体外和体内研究”( 第2 1 2 5 页) 从本刊撤稿，特此说明。 中国比较医学杂志编辑部 万方数据