加减地黄饮子预处理对局灶性脑缺血大鼠脑组织神经生长因子表达的影响.pdf

现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9O c t ，1 8 ( 2 9 ) ·3 5 3 7 · 甏每每每蕊甏j 警警鼍冬。 加减地黄饮子预处理对局灶性脑缺血大鼠脑组织 神经生长因子表达的影响 段新芬1 ，李文英2 ，谢宁2 ，周景华3 ( 1 南方医科大学中医药学院，广东广州5 1 0 5 1 5 ；2 黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 4 0 ；3 黑龙江中医药大学第一附属医院，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 4 0 ) 摘要】 目的观察加减地黄饮子预处理对局灶性脑缺血大鼠脑组织神经生长因子( N G F ) 表达的影响及其可能 的神经元保护机制。方法采用栓线法制作大鼠局灶性脑缺血损伤模型( M C A O ) 。将1 2 0 只W i s t a r 大鼠随机分成6 组：空白组、假手术组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药对照组，每组2 0 只。连续灌胃7d 后，进行手术操 作。H E 染色法观察大鼠脑组织病理学改变；免疫组织化学法观察大鼠脑组织N G F 的表达。蛄果低剂量、高剂量 加减地黄饮子均能保护梗死区神经细胞，细胞结构较完整；增强梗死区脑组织N G F 的表达。结论加减地黄饮子预 处理可对局灶性脑缺血大鼠脑组织神经元起保护作用，其脑保护作用机制可能与调节大鼠脑组织N G F 表达及保护梗 死区神经细胞结构有关。 关键词】加减地黄饮子；大鼠；局灶性脑缺血；神经生长因子；预处理 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码】A 文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 9 ) 2 9 3 5 3 7 0 4 I n f l u e n c eo fD i h u a n g y i n z id e c o c t i o np r e t r e a t m e n to ne x p r e s s i o no fn e r v eg r o w t hf a c t o ri nb r a i nt i s s u eo f r a t sw i t hf o c a lc e r e b r a li s c h e m i a D u a nX i n f e n l ，L iW e n y i n g r 2 ，X i eN i n g z ，Z h o uJ i n g h u a 3 ( 1 T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c a lC o l l e g eo fS o u t hM e d i c a lU n i v e r s i t y ，G u a n g z h o u5 1 0 5 1 5 ，G u a n g d o n g ，C h i n a ；2 H e i l o n g j i a n gT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c a lU n i v e r s i t y ，H a r b i n1 5 0 0 4 0 ，H e i l o n g j i a n g ，C h i n a ；3 T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo f H e i l o n 西i a n gT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c a lU n i v e r s i t y ，H a r b i n1 5 0 0 4 0 ，H e i l o n g j i a n g ，C h i n a ) A b s t r a c t ：0 b j e c t i v eI t i st Oo b s e r v et h ei n f l u e n c eo fD i h u a n g y i n z id e c o c t i o np r e t r e a t m e n to nt h ee x p r e s s i o no fn e r v e g r o w t hf a c t o r ( N G F ) i nb r a i nt i s s u eo fr a t sw i t hf o c a lc e r e b r a li s e h e m i aa n dt h ep o s s i b l en e u r o np r o t e c t i o nm e c h a n i s m M e t h o d sF o c a lc e r e b r a li s c h e m i ar a tm o d e l sw e r em a d ew i t hl i n ef a s t e nm e t h o d 1 2 0W i s t a rr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o b l a n kg r o u p ，s h a mo p e r a t i o ng r o u p ，m o d e lg r o u p ，t r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n eh i g hd o s eg r o u p ，t r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n e l o wd o s eg r o u pa n dw e s t e r nm e d i c i n ec o n t r o lg r o u p T h e r ew e r e2 0r a t si ne v e r yg r o u p A f t e rc o n t i n u o u s l yi n t r a g a s t f i ca d m i n i s t r a t i o nf o rs e v e nd a y s ，t h eo p e r a t i o n sw e r ed o n e T h ep a t h o l o g yc h a n g e si nb r a i nt i s s u eo fr a t sw e r eo b s e r v e dw i t hH E s t a i n i n gm e t h o d T h ee x p r e s s i o n so fN G Fi nb r a i nt i s s u eo fr a t sw e r eo b s e r v e dw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d R e s u l t s L o wd o s ea n dh i g hd o s eD i h u a n g y i n z id e c o c t i o nb o t hc o u l dp r o t e c tt h en e r v ec e l li ni n f a r c tr e g i o n T h ec e l l u l a rs t r u c t u r e s w e r ec o m p a r a t i v e l yc o m p l e t e T h ee x p r e s s i o n so fN G Fi nb r a i nt i s s u eo fi n f a r c tr e g i o nw e r es t r e n g t h e n e d C o n c l u s i o nD i h u a n g y i n z id e c o c t i o np r e t r e a t m e n tc a np r o t e c tt h en e u r o ni nb r a i nt i s s u eo fr a t sw i t hf o c a lc e r e b r a li s c h e m i a T h eb r a i np r o t e e t i o nm e c h a n i s mm a yb ec o n c e r n e dw i t hr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o n so fN G Fi nb r a i nt i s s u eo fr a t sa n dp r o t e c t i n gt h es t r u c t u r eo fn e r v ee e l li ni n f a r c tr e g i o n K e yw o r d s ：D i h u a n g y i n z id e c o c t i o n ；r a t ；f o c a lc e r e b r a li s c h e m i a ；n e r v eg r o w t hf a c t o r ；p r e t r e a t m e n t 缺血性脑血管疾病具有“三高一低”的特点，即发病率高、 致残率高、复发率高和治愈率低，严重危害人类的健康。据世 界卫生组织的M O N I C A 方案报告显示：中国脑卒中年龄标准 化发病率男为2 4 7 ( 1 0 万·a ) ，女为5 8 ( 1 0 万·a ) ，而缺血性 作者简介】段新芬( 1 9 7 4 一) ，女，博士，讲师，研究方向为中医 药防治心脑血管疾病。 【基金项目】黑龙江省自然科学基金项目( D 0 0 2 8 ) 脑血管疾病占4 5 7 0 。中医药是祖国的传统瑰宝，采 用中药复方【2 “】对缺血性脑血管病进行预防日益得到重视， 因而于传统医药中寻求预防、治疗脑中风的有效药物具有一 定的现实意义。 1 实验资料 1 1 实验动物清洁级健康W i s t a r 大鼠1 2 0 只，雄性，体质 量2 5 0 3 0 0g 。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，室 温( 2 5 ±2 ) 饲养，空气新鲜，自由饮水、摄食。 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9O c t ，1 8 ( 2 9 ) 1 2 实验药品和试剂加减地黄饮子散剂：黑龙江哈尔滨松 茂药行提供( 由熟地、黄芪、山茱萸、巴戟天、肉苁蓉、麦冬、石 斛、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、血竭等组成) 。阿司匹林：沈 阳万隆药业有限公司( 产品批号：2 0 0 2 0 5 0 2 ) 。羧甲基纤维素 钠：天津化学试剂工厂生产。苏木素染液，伊红染液( 黑龙江 中医药大学附属第一医院病理科提供) 。神经生长因子 ( N G F ) 试剂盒( 博士德生物工程公司) 。 1 3 实验分组及给药1 2 0 只W i s t a r 大鼠随机分成6 组：空 白组、假手术组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药 对照组，每组2 0 只。各给药组按不同药量每日灌胃给药1 次，连续7d 。空白组、假手术组、模型组每日灌胃同等剂量的 助悬剂。 1 4 实验动物模型制备方法 1 4 1 栓线制备取直径O 2 0 0 2 5m m 钓鱼用尼龙线， 长约5 0m m ，一端加热成光滑的球形，距球面1 8m m 处作标 记，乙醇擦洗后置1 ：25 0 0I U 肝素生理盐水中备用。 1 4 2 动物模型制作及评分采用栓线法制作大鼠局灶性 脑缺血损伤模型( M C A O ) 。腹腔注射1 戊巴比妥钠( 4 5r a g k g ) 麻醉大鼠后，切开颈正中皮肤3c m ，逐层分离组织以暴露 右侧颈总动脉( C c A ) 、颈外动脉( E C A ) 和颈内动脉( I C A ) 。按 L o n g a 等r 7J 法用无损伤动脉夹暂时夹闭右侧C C A 和I C A ，用 显微外科剪刀在E C A 残端剪O 2 0m m 小口，将栓线插入 E C A ，经右侧C C A 分叉处通过I C A 入颅，进线( 1 8 ±0 5 ) m m ， 略感阻力。假手术组除不插入栓线外，其余操作同上。实验 麻醉清醒后大鼠M C A O 模型采用Z e al o n g a 评分法进行神经 功能评分。O 分：无神经系统功能缺失症状，活动正常者；1 分：不能完全伸展对侧前爪者；2 分：出现左侧H o r n e r 征，爬行 时出现向右转圈者；3 分：行走时身体向右侧偏瘫侧倾倒者；4 分：不能自行活动者，意识丧失者。评分为0 分和4 分者均被 剔除。 1 5 标本制备缺血2 4h 后，实施心脏灌注固定：即用5m L 乌拉坦麻醉动物后，仰卧固定，“v ”形迅速剪开胸腹腔，充分 暴露心脏，用一前端较锐的塑料管快速从左心尖处插入主动 脉弓，然后于右心耳处剪开一小口，血液溢出后，迅速推注 2 0 0 m L 生理盐水后，再缓慢推注4 多聚甲醛1 0 0 1 5 0m L ， 至动物全身呈僵硬状态。立即开颅取脑，避免器械损伤。将 病变组织放入4 多聚甲醛溶液中固定1 2h 后，室温下梯度 乙醇( 7 0 一8 0 一9 5 一1 0 0 ) 脱水，二甲苯透明，石蜡包 埋。常规切片，将组织附于用防脱剂处理过的载玻片上，6 0 恒温烤箱烤片1 2h ，备用。脑组织病理学改变采用H E 染 色方法，光学显微镜下观察脑组织结构变化；N G F 表达采用 免疫组织化学方法，具体步骤参照博士德生物工程公司说明 书。所有切片染色采用相同条件，每批染色均设阴性对照。 阴性对照用P B S 替代一抗孵育切片。结果判定：阳性细胞的 胞浆、胞膜、轴突呈棕黄色着色。图像分析：用北京航空航天 大学病理图像分析软件系统对图像进行分析。每只动物取海 马和梗死区保存较好部位，在4 0 0 倍镜下每个部位分析5 个 视野，取阳性表达面密度进行统计学分析。 1 6 统计学处理数据以均数±标准差( j ±s ) 表示，用 S P S S1 3 0 统计软件分析，组间比较采用t 检验和单因素方 差分析，P 0 0 5 为有显著性差异。 2 结果 2 1 对局灶性脑缺血大鼠脑组织病理学影响空白组：脑组 织结构完整，神经细胞丰富，排列紧密，层次清晰，细胞大小均 匀一致。假手术组：脑组织结构完整，神经细胞层次清晰，毛 细血管轻度扩张，见神经胶质细胞。模型组：梗死区神经细胞 大部分萎缩，空泡样变，脑组织水肿，见较多格子细胞。中药 低剂量组：梗死区周围大部分神经细胞恢复，细胞形态完整， 核浆比例正常，胞浆丰富，见少量胶质细胞。中药高剂量组： 梗死区周围见部分神经细胞萎缩，但大部分细胞结构尚完整， 见毛细血管轻度扩张。西药对照组：梗死区周围大部分神经 细胞完好，结构完整，见少量胶质细胞。见图1 6 。 图3 假手术组( ×4 0 0 ) 2 2 对局灶性脑缺血大鼠脑组织N G F 表达影响加减地黄 饮子预处理大鼠缺血脑组织N G F 表达明显增强，中药低剂量 组呈强阳性表达，阳性表达面密度与模型组相比有显著性差 异。见图7 1 2 ，见表1 。N G F 免疫组化阴性对照组见图1 3 。 万方数据 代十目E 镕音# M o d e r nJ o t m “d l n 即aE dT r a d i d o l lc h lr l 黜a n d w §m M d n c2 G 0 9 0 c t 1 8 1 2 9 万方数据 ·3 5 4 0 ·现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9O c t ，1 8 ( 2 9 ) 表1大鼠脑组织N G F 阳性表达及面密度 测定的结果( 行= 8 ，王±s ) 注：与空白组和假手术组比较，P O 0 1 ；与模型组比较，P 0 0 1 。 3 讨论 缺血性中风是脑卒中的主要类型，占脑卒中总发病率的 4 5 7 0 。现代医学早期治疗主要通过2 种途径：血管再 通和神经保护治疗。而溶栓治疗又受限于缺血性中风过窄的 时间窗和对出血等并发症的担心，尚未得到广泛应用。神经 保护是挽救缺血半暗带尚具活力脑组织的主要方法，通过中 药复方预处理的方法，提高缺血脑组织对缺血等一系列病理 生理改变适应性，从而起到保护神经细胞结构的作用。N G F 是L e v i M o n t a l c i n i 于1 9 5 2 年首先发现的第1 种神经营养因 子，N G F 是由神经元所支配的靶组织产生的由1 1 8 个氨基组 成的特异性蛋白质分子。不仅具有中枢神经系统营养因子的 作用，而且在神经损伤后N G F 应激性表达水平上调，促进受 损神经元的再生，改善神经元的病理状态1 8J ，对缺氧、缺血后 神经损伤亦具有重要的保护和修复作用【9J 。近年国外研究表 明在脑缺m 损伤过程中，N G F 含量的改变与脑缺血神经细胞 变性坏死及凋亡关系极为密切 1o | 。N G F 对脑缺血再灌注损 伤引起的神经细胞凋亡有明显抑制作用o ；加减地黄饮子预 处理大鼠可以明显提高梗死缺血区神经元N G F 的表达，起到 神经保护的作用；同时在光镜下观察加减地黄饮子预处理组 神经细胞结构大部分完整，空泡变性细胞减少，其可能机制与 N G F 抑制神经细胞凋亡的功能有关。因此通过预处理的方 式可以很好地减轻脑缺血的神经损伤，保护神经细胞的结构 和功能，为后期的治疗奠定良好的基础。 地黄饮子出自刘河问的黄帝素问宣明论方，主肾阴阳 两虚所致的喑痱证。笔者根据临床经验，将地黄饮子加减变 化，切合临床病机，取得了较好的疗效。实验研究数据证明加 减地黄饮子可以改善A D 的各种症状，但对V D 的机制探讨 较少 1 卜1 3 。加减地黄饮子对缺血神经元的可能保护机制是 通过提高N G F 的表达和合成增加而实现，但缺血脑组织损伤 机制复杂且互相影响，有待于进一步深入研究。 【 参考文献 】 1 T h o r a l d s e nP ，K u u l a s m a aK ，R a j a k a n g a sA M ，e ta 1 S t r o k et r e n d s i nW H OM O N I C AP r o j e c t J S t r o k e ，1 9 9 7 ，2 8 ( 1 ) ：5 0 0 2 代建峰，高建青，方三华补肾益智方对老年性痴呆大鼠脑组海 马C A l 区锥体细胞的影响 J 浙江中医杂志。2 0 0 8 ，4 3 ( 1 1 ) ： 6 7 l 一6 7 2 3 卢跃卿活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞 的保护作用 J ，广州中医药大学学报。2 0 0 8 。2 5 ( 5 ) ：4 2 8 4 2 9 4 王锦萍司国民，马宏博，益智通脉颗粒对血管性痴呆大鼠脑组 织n N O S 表达的影响 J 山东中医药大学学报，2 0 0 8 ，3 2 ( 6 ) ： 5 l O 一5 1 4 5 田沈，张朝东，康志伟通心络对糖尿病大鼠脑缺血后神经生长 因子及脑源性神经营养因子表达的影响 J 中国康复理论与 实践，2 0 0 8 ，1 4 ( 5 ) ：4 3 3 4 3 4 6 】尹天雷，蔡光先等补阳还五汤对脑缺血模型大鼠脑组织N G F 及P 1 3 K A K T 信号转导途径的影响 J 中国中医药科技， 2 0 0 8 ，1 5 ( 1 ) ：2 4 2 5 7 L o n g aE 1 ，W e i n s t e i nP R ，C a r l s o nS ，e ta 1 R e v e r s i b l em i d d l ec e r e b r a la r t e r y o c c l u s i o n w i t h o u tc r a n i e c t o m y i nr a t s J S t r o k e 1 9 8 9 ， 2 0 ( 1 ) ：8 4 8 T a n gX Q ，C a iJ ，N e l s o nK D ，e ta 1 F u n c t i o n a lr e p a i r a f i e rd o r s a l r o o tr h i z o t o m yu s i n gn e r v ec o n d u i t sa n d n e u r o t r o p h i cm o l e c u l e s J E u rJN e u r o s c i ，2 0 0 4 ，2 0 ( 5 ) ：1 2 1 1 1 2 1 8 9 T u s z y n s k iM H ，UH S ，A l k s n eJ 。e ta 1 G r o w t hf a c t o rg e n et h e r a p y f o rA l z h e i m e rd i s e a s e J N e u r o s u r gF o c u s ，2 0 0 2 ，1 3 ( 5 ) ：5 8 1 0 C h e nJ ，J i nJ ，C h e nM ，e ta 1 E a r l yd e t e c t i o no fD N As t r a n db r e a k s i nt h eb r a i na f t e rt r a n s i e n tf o c a li s c h e m i a ：i m p l i c a t i o n sf o rt h er o l e o fI ) N Ad a m a g ei na p o p t o s i sa n dn e u r o n a lc e l ld e a t h J JN e u r o e h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ( 1 ) ：2 3 2 2 4 5 1 1 谭永星，王迪芬，李雪梅，等神经生长因子预处理对沙土鼠全 脑缺血再灌注损伤脑神经细胞凋亡及B c l 一2 和B a x 蛋白表达 的影响 J 中国危重病急救医学，2 0 0 7 ，1 9 ( 6 ) ：3 5 8 3 6 0 1 2 牛英才，莆妙先，兴桂华，等加减地黄饮子对A D 大鼠海马N F 一出 和C R P 表达的干预作用 J 江苏中医药，2 0 0 8 ，4 0 ( 5 ) ：8 0 8 2 1 3 李文英，段新芬，谢宁加减地黄饮子对局灶性脑缺血大鼠脑组 织b F G F 和F G F R l 表达的影响 J 辽宁中医药大学学报， 2 0 0 7 ，9 ( 2 ) ：1 4 8 1 4 9 收稿日期】2 0 0 9 0 4 0 1 万方数据