哮喘模型大鼠支气管平滑肌肌球蛋白轻链激酶的表达.pdf

书书书 基础医学研究 哮喘模型大鼠支气管平滑肌肌球蛋白轻链激酶的表达 王勇生1， 桂淑玉1， 李永怀1， 周 青2， 胡向阳3， 吴 强3， 汪 渊2 摘要 目的 探讨哮喘模型大鼠支气管平滑肌肌球蛋白轻 链激酶 （MLCK） 表达的变化。方法 SD 大鼠 24 只， 随机分 为正常对照组 （A 组） 、 哮喘模型激发 1 周组 （B 组） 和哮喘 模型激发 2 周组 （C 组） 。以卵蛋白 （OVA） 致敏和激发建立 大鼠支气管哮喘模型， 用免疫组织化学和免疫印迹法分析三 组大鼠支气管平滑肌中 MLCK 表达。结果 哮喘模型激发 1 周组大鼠支气管平滑肌 MLCK 表达较正常对照组明显增 加， 2 周组增加更明显， 差异均有显著性 （P 0. 05） 。结论 支气管平滑肌 MLCK 表达增加可能与哮喘发病有关。 主题词 哮喘； 肌球蛋白轻链激酶； 基因表达； 大鼠 中图分类号 R 562. 25；R 345；R 392. 11 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 01 -0001 -03 2005 -07 -26 接收 基金项目： 安徽省教育厅自然科学基金 （编号： 99JL0090） 作者单位： 安徽医科大学1第一附属医院呼吸内科、 2 分子生物学实 验室和安徽省基因研究重点实验室、 3 病理学教研室， 合 肥 230032 作者简介： 王勇生， 男， 30 岁， 硕士研究生； 桂淑玉， 女， 48 岁， 主任医师， 硕士生导师 研究表明 1， 哮喘患者支气管平滑肌细胞肌球 蛋白轻链激酶 （myosin light chain kinase，MLCK） 的 量较正常细胞明显增加。为证实 MLCK 是否参与 哮喘的发病， 现应用免疫组化和免疫印迹法检测哮 喘大鼠模型支气管肺组织 MLCK 的表达， 旨在进一 步探讨 MLCK 在哮喘发病中的作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 健康 SD 大鼠 24 只， ， 体重 200 220 g， 清洁级， 购自南京医科大学动物实验中心； 卵蛋白 （OVA） 、 抗大鼠 MLCK 抗体及二抗购自美国 Sigma 公司； 免疫印迹底物显色试剂盒购自美国 Pierce 公 司； 氢氧化铝购自上海东山化工厂； 免疫组化试剂盒 及二氨基联苯胺 （DAB） 显色液购自北京中山公司； 其他试剂均为国产分析纯。超声雾化吸入器购自沈 阳医疗器械厂。 1. 2 方法 1.2. 1 动物分组及哮喘模型复制 24 只大鼠按随 机数字表分为正常对照组 （A 组） 、 哮喘模型激发 1 周组 （B 组） 和激发 2 周组 （C 组） 。按 Vanacker et al 2报道的方法，哮喘模型组大鼠均在第 0 天和第 7 天腹腔注射抗原混悬液 （OVA 1mg， 氢氧化铝 200 µg， 溶于生理盐水 1 ml） 致敏。第 14 天起， 将大鼠 置于自制密闭玻璃容器内， 超声雾化吸入 1% OVA， 每 2 d 1 次， 每次 30 min， B 组雾化 1 周， C 组雾化 2 周。A 组给予生理盐水腹腔内注射和超声雾化吸 入。 1.2. 2 支气管肺泡灌洗及组织标本制备 各组在 最后 1 次雾化后， 腹腔注射 10%戊巴比妥 30 mg/ kg 麻醉大鼠， 下腔静脉放血处死。参照 Deng et al 3报 道的方法行支气管肺泡灌洗， 回收支气管肺泡灌洗 液 （BALF） 约 4 ml （回收率 80%） 于消毒管中。取 0. 2 ml BALF， 在显微镜下作细胞计数后， 在 4 离 心机中1 500r/ min 离心 15 min。取沉淀物作细胞涂 片， Wright-Giemsa 法染色。在 400 倍显微镜下， 计 数至少 200 个细胞， 按形态学标准进行细胞分类， 换 算成细胞数。开胸取右肺上叶于 10% 多聚甲醛溶 液中固定， 常规方法石蜡包埋、 切片， 行 HE 染色及 免疫组织化学检测， 余肺液氮冻存用于免疫印迹分 析。 1. 2. 3 免疫组织化学方法检测 MLCK 表达 采用 常规 SP 免疫组织化学技术分析右肺组织 MLCK 表 达， 实验步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照用磷 酸盐缓冲液代替一抗。观察内径 100 300 µm 的 细支气管区。由于 MLCK 在平滑肌中皆有表达， 仅 有强弱之分， 故根据阳性细胞染色强度将其分为 4 个等级 4： 无阳性细胞为 - ， 阳性细胞染色呈浅黄 色为 + ， 黄色为#， 棕黄色为$。 1. 2. 4 免疫印迹法鉴定 MLCK 表达 取约0. 5 cm3 冻存肺组织加入 MLCK 抽提液， 放入冰上匀浆器中 匀浆， 放置 30 min 后， 以14 000r/ min， 4， 离心 15 min。取上清， 用 Lowry 法进行蛋白质定量； 将不同 标本中蛋白总量调整一致， 分别与 2 × 蛋白质上样 缓冲液等量混合， 沸水煮 3 min。取 20 µl 混合液 （含30 µg 蛋白质） 上样， 行 SDS-PAGE 电泳， 并将凝 胶中蛋白转移至硝酸纤维膜上。5% 牛奶封闭纤维 膜2 h， 加入抗大鼠 MLCK 抗体 （1 : 1 000） 4过夜， ·1·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） 图 1 哮喘模型大鼠肺组织 HE 染色 A. 正常对照组 （HE ×200） B. 哮喘激发 1 周组 （HE ×200） C. 哮喘激发 2 周组 （HE ×200） 图 2 哮喘模型大鼠肺组织免疫组化染色 A. 正常对照组 （SP ×400） B. 哮喘激发 1 周组 （SP ×400） C. 哮喘激发 2 周组 （SP ×400） 含 0. 5%吐温 PBS 洗膜， 加入连接辣根过氧化物酶 的二抗 （1 : 10 000） ， 用化学发光法检测。 1. 2. 5 统计学处理方法 数据以%x ± s 表示， 运用 SPSS 11. 0 统计软件进行统计学处理。采用单因素 方差分析及两两比较， 非参数 Wilcoxon 检验。 2 结果 2. 1 各组大鼠 BALF 中细胞计数 哮喘模型组 （包括 B 组和 C 组） 中 BALF 白细胞总数及嗜酸性 粒细胞数与正常对照组比较差异均有高度显著性 （P 0. 01） 。同时， 激发 2 周组 BALF 中白细胞总 数及嗜酸性粒细胞数与激发 1 周组比较差异有显著 性 （白细胞总数与激发 1 周组比较 P 0. 05， 嗜酸性 粒细胞数与激发 1 周组比较 P 0. 01） 。见表 1。 表 1 BALF 中白细胞总数及嗜酸粒细胞数 （n =8，%x ± s） 组别白细胞总数 （ ×106/ L）嗜酸粒细胞数 （ ×106/ L） A4.84 ±0.720.10 ±0.03 B9.98 ±0.93&0.72 ±0.09& C12.93 ±1.18&1.24 ±0.19& 与正常对照组比较： &P 0. 01； 与激发 1 周组比较：P 0. 05， P 0. 01 2. 2 肺组织切片 HE 染色 正常对照组支气管组 织未见明显异常。哮喘激发 1 周组支气管收缩， 支 气管及小血管周围有较多嗜酸性粒细胞、 中性粒细 胞等炎细胞浸润。激发 2 周组嗜酸性粒细胞、 中性 粒细胞等炎细胞浸润更为明显， 部分支气管上皮有 脱落， 皱折明显。见图 1。 2. 3 肺组织 MLCK 免疫组织化学方法指标变化 MLCK 在哮喘模型组中 B、 C 两组大鼠表达与正常 对照组相比均明显增强， 差异有显著性 （P 0. 05） ； 且激发 2 周组 MLCK 表达多于激发 1 周组， 差异有 显著性 （P 0. 05） ， 见表 2。表达主要定位于支气管 管壁平滑肌细胞胞浆， 见图 2。 表 2 3 组大鼠支气管平滑肌 MLCK 的表达 组 别-+# $ A0710 B0251 C0035& 与正常对照组比较： P 0. 05； 与激发 1 周组比较：&P 0. 05 2. 4 免疫印迹 （Western-blot） 结果 通过免疫印 迹检测发现， OVA 诱发的哮喘模型大鼠在激发后 MLCK 表达明显， 较正常对照组增强， 同时， 激发 2 周组又较激发 1 周表达增强。见图 3。 图 3 免疫印迹检测支气管哮喘模型大鼠 MLCK 表达的变化 1. A 组 2. B 组 3. C 组 3 讨论 MLCK 是一种不依赖于环核苷酸而依赖于 Ca2 +-钙调蛋白的激酶， 具有组织特异性， 在不同组 织中， 其分子量、 抗原性质与催化性质差异很大。平 滑肌 MLCK 是一种约 108 ku 大小的依赖于 Ca2 +-钙 调蛋白的激酶， 负责肌肉收缩的启动， 是平滑肌收缩 ·2·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1） 的关键环节， 决定其最大缩短速度和最大缩短能 力 5。其通过催化肌球蛋白轻链 LC 20磷酸化后， 肌 动蛋白激活横桥 ATP 酶， 横桥构型改变产生扭动， 肌动蛋白为主的细肌丝向以肌球蛋白为主的粗肌丝 滑行， 平滑肌产生收缩， 而支气管平滑肌收缩功能异 常又是支气管哮喘发生的重要机制 6。我们发现 MLCK 在正常对照组大鼠支气管平滑肌表达较弱， 在哮喘模型组支气管平滑肌中表达明显增强， 且激 发2 周后更为明显。同时免疫印迹结果也证实了上 述结果， 与 Ma et al 1用 RT-PCR 检测哮喘患者支气 管平滑肌 MLCKmRNA 较正常人增多结果相互验 证。种种结果表明 MLCK 参与了支气管哮喘的发 病， 并随着发病时间延长而表达增加。 哮喘动物支气管平滑肌 MLCK 表达增多的原 因， 目前尚未完全清楚， 可能与周围病理生理环境改 变有关， 如炎症介质刺激其表达增加等 1， 7。气道 高反应性是哮喘的病理特征之一， 它与气道炎症关 系密切 8。本实验建立的大鼠哮喘模型中有典型 的过敏性炎症表现， 肺灌洗液中白细胞数量增加， 其 中嗜酸性粒细胞增高最明显； 在肺组织切片中表现 气道管壁增厚、 嗜酸性粒细胞浸润为特征的炎症改 变。另外， MLCK 的表达受丝裂原活化激酶 （mitogen - activated protein kinase ， MAPK） 等多种信号转导 途径调控 9， MAPK 可使 MLCK 表达增强。炎症介 质等因素有可能通过 MAPK 等信号转导途径使哮 喘动物支气管平滑肌 MLCK 表达较正常增多， 从而 催化肌球蛋白轻链磷酸化能力增强， 影响收缩过程 中普通横桥和闩式横桥的生成和转换， 提高最大缩 短速度和最大缩短能力， 增强平滑肌收缩性能 10， 导致哮喘发作。因此 MLCK 表达增加也可能是哮 喘气道高反应性原因之一。 参考文献 1 Ma X，Cheng Z Q， Kong H， et al. Changes in biophysical and bi- ochemical properties of single bronchial smooth muscle cells from asthmatic subjects J .Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2002， 283 （6） ： 1181 -9. 2 Vanacker N J，Palmans E，Kips J C，et al. Fluticasone inhabitis but dose not reverse allergen-induced structural airway changes J . Am J Respir Crit Care Med， 2001， 163 （3） ： 674 -9. 3 Deng Y M，Xie Q M，Chen J Q，et al. Coincidential increase of leukotriene B4 between cerebral cortex and lung tissue of seneitized rats J . Acta Pharmacol Sin， 2003， 24 （10） ： 1039 -44. 4 Noriharu S， Toshinitsu U， Shigeyuki K， et al . Vascular endotheli- al growth factor and Osteopontin in stage I lung adenocarcinoma J . Am J Respir Crit Care Med， 1999， 160 （4） ： 1269 -73. 5 Horowitz A， Menice C B， Laporte R， et al. Mechanisms of smooth muscle contraction J . Physiol Rev， 1996， 76 （4） ： 967 -1003. 6 Solway J L，Frebery J J. 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Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into control group（group A） ，asthma model stimulated 1week group（group B）and 2 week group（group C） . Asthma rat model was estab- lished by sensitization and stimulation with ovalbumin（OVA） . The expressions of bronchial smooth muscle MLCK in the three groups were analysed by immunohistochemistry test and Western Blot. Results The expression of ML- CK in bronchial smooth muscle of rats in group B and C was more significantly increased than that in control group （P 0. 05） ，especially two weeks after the stimulation. Conclusion The expression increase of MLCK in bron- chial smooth muscle may be correlated with asthmatic pathogenesis. MeSH asthma； myosin-light-chain kinase； gene expression； rats ·3·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Feb； 41 （1）