利用碱性磷酸酶融合表达技术研究神经导向因子NETRIN4的功能.pdf

收稿日期 2006 -01 -09 基金项目 国家重点基础研究发展计划 （973 计划） （2003CB715900） 、 国家海外青年学者合作研究基 金 （30128010） 、 国家自然科学基金重大研究计划 （90208017） 、国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 （30500147） 、 北 京 市 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 （06G0627 ） 、北 京 市 科 技 新 星 计 划 A 类 （2005A44） 、 军事医学科学院科技创新启动基金 （0402013） 资助 作者简介 秦树桐 （1981 - ） ， 男， 内蒙古自治区乌兰浩特市 人， 在读硕士， Tel： 010 -66930210。 *通讯作者 Tel： 010 - 66931590；Fax：010 - 68169574；E - mail： zhangcg bmi. ac. cn 利用碱性磷酸酶融合表达技术研究神经导向因子 netrin-4 的功能 秦树桐1，高 艳1，王利红1，周仁平2，张成岗 1* （1. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所， 北京 100850； 2. Department of Chemical Biology，Col- lege of Pharmacy，Rutgers University，Piscataway，NJ 08854，USA） 摘要 目的： 采用碱性磷酸酶 （AP4） 标记技术研究 netrin-4 的神经导向功能和受体结合特征， 并评估碱性磷酸酶 作为标签分子在真核基因功能研究中的意义。方法： 将 netrin-4 全长及3 个结构域编码区 cDNA 克隆到碱性磷酸酶 表达载体 APtag4， 成功构建真核表达载体 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT， 进而在 COS7 细胞中表达 出含有 AP 标签的融合蛋白， 并通过神经组织块培养技术和神经元原代培养技术对其活性进行鉴定。结果： 确认了 netrin-4 的神经突起导向功能。进一步通过对 AP 标签进行检测， 发现 netrin-4 全长、 LNT 和 NCT 可与原代培养的神 经元表面相结合， 而 EGFL 不结合， 说明神经元表面含有 netrin-4 受体或结合位点， 且可能通过 LNT 和 NCT 结构域 起作用。结论： netrin-4 具有明确的神经突起导向功能， 在神经元表面含有结合位点， 同时发现碱性磷酸酶标签融 合表达技术在真核基因功能研究方面具有一定优势。 关键词 神经导向因子； netrin-4； 碱性磷酸酶； 融合表达； 基因； 神经元 中图分类号 Q78文献标识码 A 文章编号 1000-5501 （2006） 03-0209-05 Application of alkaline phosphatase tag in functional study of axon guidance factor netrin-4 QIN Shu-Tong1，GAO Yan1， WANG Li-Hong1，ZHOU Ren-Ping2，ZHANG Cheng-Gang 1* （1. Department of Neurobiology， Beijing Institute of Radiation Medicine， Beijing 100850， China； 2. Department of Chemi- cal Biology，College of Pharmacy，Rutgers University，Piscataway，NJ 08854，USA） Abstract Objective： To evaluate the performance of alkaline phosphatase （AP） -tagging technique in functional study of eukaryotic genes and study of the axon guidance activity and receptors of netrin-4. Methods： The cDNA sequence coding netrin-4 and the three domains were subcloned into the alkaline phosphatase vector APtag4 to allow successfull expression of the alkaline phosphatase tagged proteins in COS7 cells. The activity of netrin-4 was identified using cultured neuronal ex- plants and neurons. Results： The netrin4 had axon guidance function. The AP4-netrin4 fusion protein was also found to be able to bind to the primary cultured neuron by examining the activity of AP tag. The AP4-LNT and AP4-NCT were able to bind to the primary cultured neuron，but AP4-EGFL and AP4 alone not. Conclusion： There are receptors for netrin-4 in the surface of primary cultured neuron，and the key binding domains are LNT and NCT. The strategy using AP4-tag is a powerful technique for functional study of eukaryotic genes. Key words axon guidance factor；netrin-4；alkaline phosphatase；fusion expression； genes； neurons 基因功能研究是后基因组时代的研究重点之一。采用 新的技术策略对于加快这一过程具有重要意义。在蛋白质 功能研究方面， 获得具有生物活性的蛋白并采用灵敏快捷的 检测手段是研究方法中的关键问题。以往通常采用同位素 标记蛋白质， 通过检测同位素的放射性信号研究蛋白质的功 能。近年来各种非同位素标记蛋白的策略逐渐受到人们的 重视， 如采用 -半乳糖苷酶 （-galatosidase， -gal） 、 -葡萄糖 苷酸 酶 （ -glucuronidase， -GUS） 、 荧 光 素 酶（ luciferase， luc） 、 绿色荧光蛋白 （green fluorescent proteins，GFP） 、 碱性磷 酸酶 （alkaline phosphatase，AP） 等 1。而酶标策略在疾病诊 断和实验研究中具有广泛应用， 其中通过将碱性磷酸酶基因 902 军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 30 卷 第 3 期 Bull Acad Mil Med Sci，Jun 2006； Vol 30 No 3 与配体基因拼接并经过表达而获得融合蛋白， 在受体与配体 相互作用的研究中显示出明显优势与价值， 已陆续用于相关 基因的功能研究之中 2， 3。 netrin 家族是一类重要的神经突起导向因子， 在神经发 育过程中通过作用于轴突生长锥上的相应受体家族 DCC 或 UNC5H 来诱导或排斥轴突生长， 从而决定轴突生长路线以 及轴突与特定靶细胞的功能联系 4 8。目前在脊椎动物中 已经鉴定出 netrin 家族的 4 个成员： netrin 1 4 9 13。本实 验室曾对 netrin-4 的表达特征进行了系统鉴定， 提示 netrin-4 可能参与神经突起生长导向和神经可塑性调节过程 14 16， 但目前尚无关于 netrin-4 在神经系统中的受体及其信号转导 通路研究的报道。本研究拟利用碱性磷酸酶融合标签表达 技术对 netrin-4 及其 3 个功能结构域进行功能研究， 并评估 碱性磷酸酶标签技术在基因功能研究中的作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 大肠杆菌 MC1061 为本室保存； 用于 PCR 扩增的模板为 本室前期构建并经测序核实的 pGBKT7-netrin4 质粒； 质粒 Aptag4 由 Dr. John Flanagan（Harvard University） 惠赠； 可溶 性碱性磷酸酶底物 pNPP 和不溶性碱性磷酸酶底物 BCIP/ NBT 均购自北京中山公司； 所需的限制性内切酶、 LA Taq、 DNA 聚合酶、 T4DNA 连接酶均购自 TaKaRa 公司； 凝胶回收 试剂盒、 质粒提取试剂盒均购自 Promega 公司； 脂质体 Lipo- fectamineTM2000 购自 InvitroGen； 细胞培养所需培养基与血 清购自 Gibco。新生 Wistar 乳鼠由本院动物中心提供。 1. 2引物设计 根据人 netrin-4 cDNA 序列设计 4 对引物进行 PCR 扩 增， 具体为： pAP4-netrin4-Fwd + pAP4-netrin4-Rvs 扩增 netrin- 4 全长、 pAP4-LamNT-Fwd + pAP4-LamNT-Rvs 扩增 netrin-4 N 端结构域 （层连蛋白 N 端结构域 laminin N- terminal domain， LNT） 、 pAP4-EGFL-Fwd + pAP4-EGFL-Rvs 扩增 netrin-4 表皮 生长因子 （EGF） 样重复结构域 （epidermal growth factor-like， EGFL） 、 pAP4-NetrinCT-Fwd + pAP4-NetrinCT-Rvs 扩增 netrin- 4 C 端结构域 （netrin C- terminal domain， NCT） （由上海博亚 生物技术有限公司合成） ， 分别对应 netrin-4 成熟肽序列及 LNT、 EGFL、 NCT 3 个功能结构域的编码序列。上游引物引 入 Bgl的酶切位点， 下游引物引入 Xho的酶切位点， 工作 浓度均为 10 µmol/ L。 pAP4-netrin4-Fwd： 5'-GGAAGATCTTCCCGCTGTGAAAA- A-3'； pAP4-netrin4-Rvs： 5'-CCGCTCGAGCTACTTGCACTCTCT-3'； pAP4-LamNT-Fwd： 5'-GGAAGATCTTCCCGCTGTGAAAAA-3'； pAP4-LamNT-Rvs： 5'-CCGCTCGAGCTAGCCCTTGACAAT-3'； pAP4-EGFL-Fwd： 5'-GGAAGATCTTGCTTCTGCAATGGC-3'； pAP4-EGFL-Rvs： 5'-CCGCTCGAGCTAACATTCGCATTT-3'； pAP4-NCT-Fwd： 5'-GGAAGATCTGCCAAGGCATTCTGT-3'； pAP4-NCT-Rvs： 5'-CCGCTCGAGCTACTTGCACTCTCT-3'。 上述引物对与目的基因片段的对应关系见图 1。 图 1 扩增 netrin-4 及其 3 个主要结构域 cDNA 序列的引物对 1. 3重组质粒的构建与鉴定 以本室前期构建并经测序核实的 pGBKT7-netrin4 质粒 为模板， 以上述引物分别扩增 netrin-4、 LNT、 EGFL 和 NCT。 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并回收。将上述 PCR 产物 进行 Bgl与 Xho双酶切后再次回收纯化酶切片段， 与同 样经 Bgl/ Xho双酶切并回收的 APtag4 载体定向连接， 用 CaCl2法 转 化 大 肠 杆 菌 MC1061， 利 用 三 重 抗 生 素 标 记 （Amp + 、 Tet + 、 Kana + ） 筛选阳性克隆。在具有相同三重抗生 素的 LB 液体培养基中培养阳性克隆 12 h 后， 提取质粒 DNA 作为模板， 利用前述引物对通过 PCR 检测目的基因， 并同时 进行 Bgl/ Xho双酶切鉴定， 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 4重组蛋白的表达与碱性磷酸酶活性检测 以脂质体 LipofectamineTM2000 转染重组质粒 AP4-ne- trin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 及 APtag4 至 COS7 细 胞。每种质粒转染使用不同的脂质体/ 质粒的比例， 具体操 作步骤如产品说明所述。为避免干扰后续分光光度计检测， 使用不含酚红的 DMEM 培养液培养 COS7 细胞。在转染后 每隔 24 h 取培养上清， 并全量更换培养液。收获上清后 4 离心 （8 000 r/ min） 吸上清， 加入终浓度为 0. 1%的 NaN3保存 于 4备用。将培养上清于 65加热 10 min 以灭活， 然后加 入终浓度为 12 µmol/ L 的碱性磷酸酶可溶性底物 pNPP， 于 避光处 37 反应 1 h， 然后在 405 nm 处读取光密度值 （D405） ， 定量检测融合蛋白的表达。 1. 5融合蛋白神经突起导向功能的检测 为检测 netrin-4 的神经突起导向功能， 利用胶原培养的 方法观察 netrin-4 浓度梯度对 Wistar 大鼠大脑皮质组织块突 起生长方向的影响。首先将浓度为 5 mg/ ml 的胶原在培养 皿中包被一层， 氨化 30 min 后以 0. 1% 乙酸反复漂洗 10 次， 然后滴加 100 µl 含有 AP4-netrin4 或 AP4 的培养上清于培养 皿正中央， 风干后在其上再包被一层胶原， 置 37细胞培养 箱中凝固。取出生 12 h Wistar 乳鼠大脑皮质分割为直径 0. 5 1 mm 的组织块， 环绕中心接种于培养皿中， 加入含有 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液在细胞培养箱中培养 48 h。 在倒置光学显微镜下观察神经组织块突起的生长情 况。 012军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 30 卷 第 3 期 1. 6融合蛋白与原代培养神经元结合的检测 分离出生12 h 内的 Wistar 乳大鼠大脑皮质神经元， 并接 种至包被有 L-多聚赖氨酸的盖玻片上， 以含有 10% 胎牛血 清、 10%马血清的高糖 DMEM 培养8 h 后换为含5%马血清、 N2、 B27 的高糖 DMEM 培养 7 d。以 4% 的多聚甲醛固定已 培养成熟的原代神经元， 然后以 PBS 漂洗细胞 3 次， 每次 5 min， 再滴加 100 µl 含有 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 和 AP4 的培养上清， 37 孵育 30 min 后再以 PBS 漂洗 3 次。漂洗后， 以碱性磷酸酶不可溶底物 BCIP/ NBT 显 色， 再次以 PBS 漂洗后封片观察。 2 结果 2. 1 重组质粒的构建与鉴定 以构建的重组质粒 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT 为模板， 通过 PCR 扩增 netrin-4、 LNT、 EGFL 和 NCT。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析， 显示扩增片段 大小正确， 其中 netrin-4 基因片段大小约为 1. 8 kb， LNT 约为 0. 7 kb， EGFL 约为0. 65 kb， NCT 约为0. 35 kb， 与预期结果相 符 （图 2） 。同时以 Bgl与 Xho双酶切重组质粒， 可以看到 有相应大小的片段释放 （图 3） ， 说明重组质粒 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT 已经构建成功。 2. 2 表达的融合蛋白具有碱性磷酸酶活性 以碱性磷酸酶可溶性底物 pNPP 检测融合蛋白的表达。 由于碱性磷酸酶与 pNPP 的反应产物呈黄色， 为避免酚红颜 色对检测造成影响， 采用无酚红培养基进行检测。通过对不 同质粒转染条件进行优化发现， 重组质粒 AP4-netrin4、 AP4- LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 及 APtag4 的最优化转染需要不同 的质粒/ 脂质体比例， 并在不同的转染时期达到表达峰值。 2.3碱性磷酸酶标记的 netrin-4 具有神经导向因子的轴突 诱向功能 为鉴定碱性磷酸酶标记的 netrin-4 的生物活性， 利用组 织培养方法研究 netrin-4 对神经突起生长的影响。将出生 12 h内的 Wistar 乳大鼠大脑皮质分割成小块， 种植于中间含 有高浓度外源蛋白而周围蛋白浓度低的胶原中。培养 48 h 后发现胶原中加入外源碱性磷酸酶 （AP4） 培养的组织块神 经突起生长方向是随机的， 无定向生长趋势； 而加入 AP4-ne- trin4 培养的组织块神经突起则沿着从低到高的浓度梯度方 向生长 （图 4） ， 说明碱性磷酸酶标记的 netrin-4 具有神经突 起生长诱向功能。 图 2 重组质粒的 PCR 鉴定 1. DL2000； 2. netrin-4； 3. LNT； 4. EGFL； 5. NCT 图 3 重组质粒的 Bgl与 Xho“双酶切鉴定 1. DL2000； 2. netrin-4； 3. LNT； 4. EGFL； 5. NCT 图 4 netrin-4 的神经突起生长导向作用 A. 阴性对照， 显示仅有碱性磷酸酶不能诱导皮质组织块神经突起定向生长； B. AP4-netrin4 融合蛋白诱导的皮质 组织块神经突起生长情况， 显示组织块神经突起只沿着 AP4-netrin4 融合蛋白浓度梯度由低向高的方向生长， 箭 头指示 AP4-netrin4 浓度高的方向； C. B 图中白框放大图； D. 建立浓度梯度和皮质组织块神经突起生长的示意图； 标尺 =100 µm 112 第 3 期 秦树桐， 等 . 利用碱性磷酸酶融合表达技术研究神经导向因子 netrin-4 的功 能 2.4碱性磷酸酶标记的 netrin-4 及其结构域可与原代培养 神经元结合 将碱性磷酸酶标记的配体与原代培养的皮层神经元共 孵育后， 以碱性磷酸酶底物 BCIP/ NBT 检测融合蛋白与神经 元的结合。结果发现 AP4-netrin4、 AP4-LNT 和 AP4-NCT 能 够与神经元的胞体和突起结合， 而 AP4 与 AP4-EGFL 则不能 （图 5） 。说明碱性磷酸酶标记的 netrin-4 全长以及 LNT 和 NCT 结构域具有与神经元表面受体结合的活性。 图 5 碱性磷酸酶标记的配体与原代培养神经元的结合 A. AP4-netrin4 与原代神经元的结合， 可见在胞体和突起有阳性信号； B. 阴性对照， 显示 AP4 不能与原代神经元结合； C. AP4-LNT 与 原代神经元的结合， 在胞体和突起有阳性信号； D. AP4-EGFL 不能与神经元结合； E. AP4-NCT 在原代神经元胞体和突起有结合； 箭头 指示碱性磷酸酶标记配体与细胞结合部位； A 图标尺为 13 µm； 从 B 图到 E 图标尺为 16. 6 µm 3讨论 本研究构建 APtag4 与 netrin-4 3 个主要结构域的重组 质粒并在 COS7 细胞中表达， 通过检测融合蛋白中碱性磷酸 酶和 netrin-4 的活性， 表明利用碱性磷酸酶标签融合表达技 术研究神经导向因子 netrin-4 的功能是可行的， 为从蛋白质 水平上研究 netrin-4 的受体、 功能和下游信号通路提供了物 质基础。 长期以来蛋白质和核酸研究中多使用同位素作为标记， 由于同位素标记灵敏度高且已经建立了一套完整的经典操 作方法， 但是使用同位素标记的操作经常需要特定的防护设 备， 而且同位素半衰期短， 这些都使同位素的使用受到一定 程度的限制。与此相比， 使用非放射性标记可避免放射性物 质对研究人员和环境造成损伤， 且可长期放置使每次实验材 料一致从而保证实验质量 17， 18。近年来发展的人胎盘碱性 磷酸酶在基因功能研究， 尤其是在受体配体研究领域逐渐显 示其优势。本研究选用可表达人胎盘碱性磷酸酶的 APtag4 载体构建重组质粒， 在真核细胞表达后所获得目的蛋白中含 有碱性磷酸酶且具有分泌性， 因而可以直接在细胞培养上清 中获得融合蛋白； 并且因其具有耐热性， 可区分于细胞内源 性碱性磷酸酶。通过催化可溶性碱性磷酸酶底物 pNPP 在活 细胞系统显色， 可直接反映外源目的蛋白的表达和动态变 化； 通过 BCIP/ NBT 显色， 可应用于组织化学原位显色反映 外源蛋白结合情况， 省去了传统免疫组织化学实验中需要酶 标二抗的步骤， 相应排除了实验中可能由二抗带来的假阳性 干扰 2， 3。本研究将构建成功的重组质粒转染 COS7 细胞后 直接收获细胞培养上清， 65灭活内源碱性磷酸酶活性后以 pNPP 显色， 发现转染产物具有碱性磷酸酶活性。而且通过 在转染后连续检测培养上清中碱性磷酸酶的活性， 我们发现 融合蛋白从转染的第一天即有表达， 随后表达量逐渐升高达 到峰值， 且不同的重组质粒有不同的表达峰值时间。结果表 明虽然使用同一种碱性磷酸酶表达载体， 但是插入不同基因 片段后的表达效率即发生变化， 这一点应为研究者所注意。 利用重组质粒 AP4-netrin4 转染产物和胶原建立浓度梯度培 养神经组织块， 发现神经突起可沿着从低到高 AP4-netrin4 浓度梯度方向生长。同时利用融合蛋白与原代培养神经元 共孵育， 发现 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-NCT 能与神经元表 面结合。这些结果说明转染产物具有碱性磷酸酶的活性， 可 用来检测融合蛋白； 同时具有 netrin-4 生物活性， 可用于 ne- trin-4 性质与功能的研究。因此， 采用碱性磷酸酶标签的融 合表达技术对于细胞因子的受体、 功能和信号通路研究具有 积极意义。 参考文献 1 Lewis JC，Feltus A，Ensor CM，et al. 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Cell， 1994， 78 （3） ： 425 -435. （下转第 252 页） 212军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 30 卷 第 3 期 1 500 多种。根据对 HLA 纯合细胞的研究和对有限家系的 分析， 发现 HLA 类等位基因中 HLA-DR 和 HLA-DQ 之间 连锁关系非常紧密， 比类基因的连锁不平衡更有规律性， 甚至在某些情况下根据连锁规律性便可由一种基因型别推 导出另一种基因型别。研究人员根据研究结果制作了 HLA- DR 和 HLA-DQ 的连锁图， 以供配型人员在分析结果时进行 参照。 由于 HLA 基因多态性的分布与民族或种族有密切关 系， 因此， 以西方人群为主研究出的连锁图并不一定同样适 用于中国人群。在对中国人群 HLA-DR/ DQ 连锁的研究中 发现， 830 例受检者中共发现 12 例新的连锁不平衡， 其中有 6 例为 HLA-DQ9 或 HLA-DQ8 连锁， 占总比例的 50%。这与 HLA-DQ3 在中国汉族人口中高达 40% 的基因频率有关 2。 这 6 例连锁中有 3 例为 DQ9 纯合子情况下的关联， 表明在 高频率基因的情况下， 尤其存在纯合位点时， 有可能出现许 多新的连锁不平衡组合。这种组合在另一新发现连锁不平 衡组合 HLA-DQ5 中得到了验证， 即 HLA-DQ5 中的新连锁不 平衡也是在纯合情况下发生的。本组研究中较高频率的连 锁不平衡还出现于 HLA-DQ4 和 DQ6， 由于 HLA-DQ4 在中国 汉族人口中的分布频率并不很高， 只有约 6%， 而 HLA-DQ6 的频率较高约 10%， 这种不一致可能与观察的病例数有关。 从 HLA-DR 基因角度分析， 大部分属于 DR52 基因组， 只有 两例属于 DR53 基因组的 DR7， 而没有发现属于 DR51 基因 组的新连锁。从具体基因型别的分布来看， HLA-DR11、 DR12 都出现了 3 次， HLA-DR7、 DR14、 DR4 都出现了 2 次， 相对来讲都比较集中， 这也与上述基因在中国人群中的较高 分布频率有关。由于总的病例数尚不多， 因此这些连锁不平 衡的连锁系数尚需进一步进行验证。另外， 在新的连锁不平 衡中， 女性患者占了 67. 7%， 远远大于男性患者的比例。由 于 HLA 基因的表达与性别没有关系， 那么上述差异的唯一 解释是这些连锁基因与尿毒症的发生有关， 而尿毒症的某些 发病因素可能在女性患者中存在高发倾向。在 12 例次共 11 种新的连锁不平衡中 10 种为负向连锁， 即其连锁的发生 频率低于随机组合的情况， 只有一种连锁不平衡为正向连 锁， 即其连锁的发生频率高于随机组合情况， 该结果说明， 新 发现的连锁不平衡组合大部分比较罕见， 在人群中的分布频 率较低。上述发现对于指导 HLA 类基因配型中的结果分 析具有重要意义 3， 可以防止在出现上述连锁不平衡的条件 下对结果的准确性发生怀疑。该研究不但丰富了 HLA 类 基因的连锁不平衡组合， 而且对于指导 HLA 配型、 确定骨髓 库无关供者资料数量具有重要的实践意义， 不但可以减少出 现罕见结果时的无意义重复实验以及对人力和试剂的浪费， 还有助于总结中国人群 HLA 类基因的单倍型资料， 为促 进供受者之间的合理选择和提高移植成功率奠定基础 4， 5。 参考文献 1 Olerup O， Aldemer A， Fogdell A. 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