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地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量的变化 王 通， 曾耀英， 邢飞跃， 梁佩燕 （暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室， 广东 广州 510630） 收稿日期： 2006 -02 -05， 修回日期： 2006 -03 -26 基金项目： 国家自然基金资助项目 （No 30230350， 30471635） ， 广东省 自然科学基金资助项目 （No 5300413） ； 暨南大学引进优秀 人才科研启动基金资助项目 （No 51204066） 作者简介： 王 通 （1975 - ） ， 男， 博士， 助理研究员， 研究方向： 分子 细胞生物学， Tel：020-85225180，Fax：020-85221337，E- mail：tongwang jnu. edu. cn； 曾耀英 （1946 - ） ， 男， 研究员， 通讯作者， 研究方向： 分子 免疫学， Tel： 020-85226219， E-mail： zengyaoyingy gmail. com 中国 图 书 分 类 号：R-332；R 322. 53；R 329. 25；R 967； R 977. 11 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 05 -0563 -04 摘要： 目的 研究地塞米松 （DEX） 诱导的小鼠胸腺细胞凋亡 中线粒体质量变化。方法 分别设对照组 （Control） 和 DEX 组； 在 6 h， 分别以 NAO 和 Mitotracker Green（MG） 单染流式 细胞术检测线粒体质量变化， 以 DiOC6（3） 染色流式细胞术 检测线粒体膜电势变化， 以 Annexin V-PE/ MG 双染流式细胞 术检测细胞凋亡中线粒体质量改变特点。结果 NAO 染色 检测结果显示终浓度 1 µmol·L -1 DEX 可以诱导小鼠胸腺 细胞线粒体心磷脂含量降低， 与对照组比较 P 0. 01； MG 染 色流式细胞术结果表明 DEX （P 0. 01） 诱导了胸腺细胞线 粒体质量的降低； DEX （P 0. 01） 诱导线粒体膜电势依赖性 DiOC6（3）在胸腺细胞中可染性下降； Annexin V-PE/ MG 双 染流式细胞术显示， 凋亡细胞中存在一定比例的低线粒体质 量细胞， DEX 组该群细胞多于对照组 （P 0. 01） 。结论 DEX 诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量降低； 线粒体质 量评价在细胞凋亡相关药理学研究领域有应用前景。 关键词： 胸腺细胞； 凋亡； 线粒体质量； NAO； Mitotracker Green 线粒体质量 （Mitochondrial mass） 是指细胞内所 有线粒体以及其内容物的质量之和 1。由于线粒 体与细胞凋亡之间的密切关系， 线粒体质量成为评 价线粒体功能的重要指标 2。真核动物细胞的线 粒体与其他细胞器在自身性质上存在明显不同： 首 先它是除细胞核外唯一有遗传物质 （线粒体 DNA， mtDNA） 的细胞器， mtDNA 编码着与呼吸作用密切 相关的蛋白质及复合体； 其次， 线粒体内容物 （包括 细胞色素 C 等） 的释放意味着细胞凋亡 3， 4。因此， 线粒体质量降低可以提示细胞可能已经启动凋亡机 制。 细胞凋亡在免疫系统中频繁发生， 从中枢耐受 到外周耐受， 机体采用该机制清除与自身抗原反应 的免疫细胞， 例如， 95%的胸腺细胞在中枢耐受中被 诱导凋亡 5。正常机体免疫细胞凋亡与新免疫细 胞驯化成熟呈自稳状态。然而， 在病理或药物作用 下， 这种自稳状态可能会被打破而使机体进展成为 自身免疫疾病或免疫缺陷疾病 6。因此， 检测免疫 系统的细胞凋亡状态是免疫药理学一项重要任务。 据此， 本文利用较新的线粒体质量流式细胞技术对 胸腺细胞凋亡的线粒体质量变化进行研究， 为上述 方面提供理论和实验依据。 1 材料与方法 1. 1 试剂和材料 Balb/ c 小鼠， SPF 级， 3wk 龄， 购自第一军医大学实验动物中心。 地塞米松 （DEX） 、 L-谷氨酰胺、 -二巯基乙醇、 Hepes 为 Sigma 产品； RPMI-1640 培养基和胎牛血清 （FCS） 为 Gibco 公司产品；Annexin V-PE 单克隆抗 体购自 Becton Dickinson 公司 （BD 公司） ； nonyl acri- dine orange （NAO） 、 3， 3'-dihexyloxacarbocyanine io- dide DiOC6（3） 、 Mitotracker Green FM （MG） 、 二甲 基亚砜 （DMSO） 购自美国 Molecular Probes 公司； 线 粒体抽提试剂盒 （Mitochondria Isolation Kit） ， 购自 Pierce 公司； FACSCalibur 流式细胞仪为 BD 公司产 品。 1. 2 小鼠胸腺细胞的获取和培养 将 Balb/ c 小鼠 断髓处死，无菌分离胸腺， 于 200 目尼龙网过滤。 离心 （125 × g， 5 min） 收集细胞，用 4磷酸盐缓冲 液 （PBS， pH 7. 2） 重悬细胞， 离心洗涤 （125 × g，5 min） 细胞 2 次，细胞重悬于含 100 ml·L -1 FCS 的 RPMI-1640 完全培养基中， 计数并且调整细胞浓度 至 1 ×109cells·L -1， 置于 24 孔细胞培养板并使每 孔终体积为 1 ml， 在 37、 5% CO2恒温饱和湿度细 胞培养箱内培养。 1. 3 实验分组 实验动物随机分为 2 组， 每组 5 只。空白对照组 （Control 组） ， 胸腺细胞仅在完全培 养基内培养； DEX 诱导组 （DEX 组） ， DEX 终浓度 1 µmol·L -1。 1.4 NAO 染色流式细胞术检测线粒体质量 NAO 是线粒体心磷脂 （Cardiolipin， CL） 的特异性染料， 可 以指示线粒体质量。于 6h 各组取细胞约 5 × 105 ·365·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） ： 563 7 cells， 以终体积 380 µl PBS 重悬细胞、 终浓度 100 nmol·L -1 NAO， 37水浴轻柔振荡 15 min， FL1 通 道流式细胞术检测。 1. 5 DiOC6（3） 染色流式细胞术检测细胞线粒体膜 电势变化 用 DMSO 将 DiOC6（3）稀释成 40 µmol ·L -1的储存液，-20 保存。临用前用 PBS 稀释 成400 nmol·L -1的工作液。各组取约5 ×105 cells， 以终体积 380 µl PBS 重悬细胞、 终浓度 20 nmol· L -1 DiOC6（3） ， 37水浴轻微振荡 15 min， FL1 通道 流式细胞术检测。 1. 6 MG 染色流式细胞术检测线粒体质量变化 MG 是线粒体特异性染料， 其可染性不依赖于线粒 体膜电位， 可以反应线粒体质量。于 6 h 各组取细 胞约 5 × 105cells， 以终体积 380 µl PBS 重悬细胞、 终浓度 200 nmol·L -1 MG， 37 水浴轻微振荡 15 min， FL1 通道流式细胞术检测。 1. 7 Annexin V-PE/ MG 染色流式细胞术检测凋 亡中线粒体质量变化 Annexin-PE 可以特异性结 合凋亡和坏死细胞。各组于 6 h 时点收集细胞约 5 ×105cells， 用 1 ml 4 PBS 离心 （125 × g，5 min） 洗涤细胞 2 次， 以终体积 380 µl PBS 重悬细胞、 终 浓度200 nmol·L -1 MG， 37水浴轻微振荡15 min； 离心 （125 × g， 5 min） 收集细胞， 重悬于 75 µl 染料 结合缓冲液 （binding buffer：10 mmol·L -1 Hepes NaOH pH 7. 4 ， 140 mmol·L -1NaCl， 2. 5 mmol· L -1CaCl 2） 中， 然后每样品分别加入 4µl Annexin V- PE， 振荡器上轻微振荡混匀后常温下静置 15 min； 最后加入250µl binding buffer， 流式细胞术检测。参 考配置， FL2-FL1 14%。 1. 8 数据统计 流式细胞术获得的数据用 Cell Quest 和 WinMDI 2. 9 Version 软件分析。实验数据 以-x ± s 表示， 组间差异用 Student's 非配对 t 检验评 价。 2 结果 2. 1 DEX 影响小鼠胸腺细胞线粒体心磷脂含量变 化 CL 特异性存在于线粒体内膜， 是线粒体的重要 组成成分和功能成分， 而且是唯一具有抗原性的磷 脂分子 7。NAO 与 CL 结合后， 488 nm 激发下产生 535 nm 绿色荧光， 根据 FL1 的强度可以指示细胞线 粒体 CL 含量； 同时， NAO 染色与线粒体膜电势没有 相关性从而反应线粒体质量。本研究结果表明， 6 h 培养条件下， Control 组存在明显的 CL 含量不同的 两群细胞 （Fig 1a） ， 其中线粒体 CL 含量较低的细胞 所占比例为（17. 35 ±1. 48） %， 低于 DEX 组 （46. 77 ±3. 91） %，P 0. 01（Fig 1b） 。 Fig 1 Mitochondrial mass changes in mouse thymocyte apoptosis detected with NAO staining flowcytometry Mouse thymocytes were treated with 1 µmol·L -1 DEX for 6 h， typ- ical mitochondrial mass loss were detected a；percentage of low mitochon- drial mass thymocyte had difference between DEX and control group b. * P 0. 01 vs control group （n =5） 2. 2 DEX 影响小鼠胸腺细胞线粒体质量变化的 MG 染色检测结果 MG 可以自由扩散形式进入细 胞， 线粒体的氧化反应可使其形成阳离子形式。MG 含有硫醇反应性氯甲基， 该基团在 MG 呈阳离子状 态下可稳定标记蛋白 （MG-CH2S-peptide） 。因此， MG 染色不依赖于线粒体膜电势， 而且特异性着色 于线粒体。MG 染色流式细胞术的生物学意义在 于： 反应细胞内呼吸功能正常的线粒体的数量； 指示细胞内的线粒体质量。本研究结果表明， 6 h 培养条件下， Control 组存在明显的线粒体质量不同 的两群细胞 （Fig 2a） ， 其中线粒体质量较低的细胞 所占比例为（27. 65 ±3. 25） %， 低于 DEX 组 （49. 17 ±4. 82） %，P 0. 01（Fig 2b） 。 2.3 DEX 作用下小鼠胸腺细胞 DiOC6 （3） 可染性 变化 DiOC6（3） 是一种能够自由进入细胞的阳离 子染料， 它能够特异性的对具有膜电势差的膜系统 染色， 并在 488 nm 激发光下产生绿色荧光 （FL1） 。 DiOC6（3） 荧光强度与膜电势成正比关系， 由于线粒 体膜电势 （ -125 mV） 高于细胞膜膜电势 （ -40 mV） ， DiOC6（3） 在线粒体膜上产生的荧光强度可以 是细胞膜的几十倍， 因此可以说 DiOC6（3） 也是线粒 体的特异性染料， 而且可以在一定程度上反映细胞 线粒体膜电势的变化情况 8。本研究结果表明， 6 h ·465·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） Fig 2 Mitochondrial mass changes in mouse thymocyte apoptosis detected by Mitotracker Green staining flowcytometry Mouse thymocytes were treated by 1 µmol·L -1 DEX for 6h， typical mitochondrial mass loss were detected a；percentage of low mitochondrial mass thymocyte in DEX had significant difference from control group b. *P 0. 01 vs control group （n =5） 培养条件下， Control 组存在明显的 DiOC6（3） 可染 性不同的两群细胞 （Fig 3a） ， 其中线粒体质量较低 的细胞所占比例为（19. 78 ±2. 21） %， 低于 DEX 组 （48. 74 ±5. 21） %，P 0. 01（Fig 3b） 。 2. 4 胸腺细胞凋亡与线粒体质量的相关性 An- nexin V-PE/ MG 双染流式细胞术结果显示了 4 个细 胞群： 正常细胞， Annexin V-PE 阴性， MG 阳性； 线粒体质量降低但没有凋亡的细胞， Annexin V-PE 和 MG 双阴性； 凋亡但线粒体质量正常的细胞， Annexin V-PE 和 MG 双阳性； 线粒体质量下降的 凋亡细胞， Annexin V-PE 阳性， MG 阴性 （Fig 4a） 。 其中， Annexin V-PE 阳性的细胞视为凋亡细胞。在 DEX 诱导 6 h 条件下， DEX 组凋亡细胞比例为 （55. 31 ± 3. 63 ） %，高 于 Control 组（ 21. 25 ± 2. 37） %， P 0. 01 （Fig 4b） ； DEX 组线粒体质量下 降的凋亡细胞比例为 （16. 71 ± 1. 97） %， 高于 Con- trol 组 （3. 35 ±0. 77） %， P 0. 01 （Fig 4b） 。 3 讨论 本研究结果表明 DEX 可以降低小鼠胸腺细胞 CL 含量， 直接指示了线粒体质量和功能改变。哺乳 动物细胞中很多与氧化磷酸化相关的蛋白复合体 Fig 3 Loss of mitochondrial membrane potential detected by DiOC6（3）staining flowcytometry Mouse thymocytes were treated by 1 µmol·L -1 DEX for 6h， typical mitochondrial membrane potential loss were detected a；percentage of low mitochondrial membrane potential thymocyte in DEX had significant difference from control group b. *P 0. 01 vs control group （n =5） 、 、 和 （即分别是 NADH 脱氢酶、 琥珀酸脱 氢酶、 bc1 复合体和细胞色素 C 氧化酶） 的四级结构 和超级结构中需要 CL 作为支架分子， 由于蛋白的 活性与结构密切相关， 因此 CL 对维持这些蛋白复 合体的活性非常重要 9。CL 仅存在于线粒体内膜， 且目前已知 CL 和线粒体内膜细胞色素 C （CytC） 通 常以 CL-CytC 形式存在； CL 若被氧化， 直接结果包 括： CytC 解离， 并有机会进入胞质； CL 含量下 降引起蛋白复合体结构变化， 从而可能导致线粒体 物理变化。有报道指出 DEX 可以介导细胞内反应 性氧族 （Reactive oxygen species，ROS） 增多， ROS 是 细胞凋亡中 CL 最重要的氧化力， 这可以部分解释 本研究 CL 降低的可能性 10。 本研究利用 MG 染色检测线粒体质量变化得到 了与 NAO 染色相符的结果， 均检测到了 DEX 介导 的线粒体质量下降现象。MG 和 NAO 有共同染色 特点， 即可染性不依赖于线粒体膜电势， 这一点对与 区分线粒体质量降低是由于线粒体数量减少， 还是 线粒体膜电势变化引起的线粒体内容物释放有重要 意义。MG 是 Molecular Probes 公司新近开发出的荧 光染料， 可以对线粒体蛋白进行特异性的有效染色， 最早是由Oubrahim等 11用于线粒体质量研究； 目 ·565·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） Fig 4 Results of Annexin V-PE/ Mitotracker Green double staining flowcytometry a：Mouse thymocytes were treated with 1 µmol·L -1 DEX for 6h， representative flowcytometry results were shown；b：percentage of apop- totic and low mitochondrial mass thymocytes. *P 0. 01 vs control group （n =5） 前， 国内未见 MG 相关报道。MG 对蛋白染色、 NAO 对 CL 染色， 二者对于线粒体质量研究具有较好的 互补性。 我们以往利用 JC-1 研究胸腺细胞线粒体膜电势变 化表明， 细胞线粒体质量降低， 线粒体绝对数量减 少， 现存线粒体保持着正常的膜电势以保持凋亡进 程的能量需求 12。本研究 DEX 诱导小鼠胸腺细胞 DiOC6 （3） 可染性下降， 同时发现线粒体质量下降。 其中， DiOC6（3） 的作用相当于 JC-1 聚合体的作用， 反应了线粒体膜电势的变化； NAO 和 MG 相当于 JC-1 单体的作用， 反映了线粒体质量变化。本文利 用不同方法得到了与以往研究相一致的结论。 不仅如此， 本研究利用 Annexin V-PE/ MG 染色 法发现了凋亡细胞中存在低线粒体质量的细胞群， 证实了细胞凋亡进程中的线粒体质量下降 （Fig 4） 。 王通等 1首次利用 CFDA-SE 技术研究了 DEX 诱导 的小鼠胸腺细胞凋亡进程， 报道该过程中的细胞结 构蛋白下降的现象。前者指出线粒体水平蛋白变 化， 后者证明了细胞总体蛋白水平变化， 二结论有着 较好的一致性和互补性。 参考文献： 1 王 通， 曾耀英，肇静娴， 等. 地塞米松介导胸腺细胞凋亡过 程中线粒体和细胞结构蛋白的变化 J . 中国病理生理杂志， 2005， 21 （7） ： 1415 -8. 2 Lee C F，Liu C Y，Hsieh R H，et al. Oxidative stress-induced depolymerization of microtubules and alteration of mitochondrial mass in human cells J . Ann N Y Acad Sci， 2005， 1042：246 - 54. 3 Rizzuto R，Pinton P，Ferrari D，et al. Calcium and apoptosis： Facts and hypotheses J . Oncogene， 2003， 22 （53） ： 8619 -27. 4 Quaglino D， Ronchetti I P. Cell death in the rat thymus： A minire- view J . Apoptosis， 2001， 6 （5） ： 389 -401. 5 王 通，曾耀英. 胸腺保护与抗衰老机制研究 J . 中国临床 康复， 2005， 9 （23） ： 164 -6. 6 Sakaguchi S， Sakaguchi N. Regulatory T cells in immunologic self- tolerance and autoimmune disease J . Int Rev Immunol， 2005， 24 （3-4） ： 211 -26. 7 Mileykovskaya E，Zhang M，Dowhan W. Cardiolipin in energy transducing membranes J . Biochemistry（Mosc） ， 2005， 70 （2） ： 154 -8. 8 Kalbacova M，Vrbacky M，Drahota Z，et al. Comparison of the effect of mitochondrial inhibitors on mitochondrial membrane po- tential in two different cell lines using flow cytometry and spec- trofluorometry J . Cytometry A， 2003， 52 （2） ： 110 -6. 9 Iverson S L，Orrenius S. The cardiolipin-cytochrome c interaction and the mitochondrial regulation of apoptosis J . Arch Biochem Biophys， 2004， 423 （1） ： 37 -46. 10Moon E Y， Han Y H， Lee D S， et al. Reactive oxygen species in- duced by the deletion of peroxiredoxin ii（ prxii）increases the number of thymocytes resulting in the enlargement of prxii-null thy- mus J . Eur J Immunol， 2004， 34 （8） ： 2119 -28. 11 Oubrahim H，Stadtman E R， Chock P B. Mitochondria play no roles in mn （ii） -induced apoptosis in hela cells J . Proc Natl Acad Sci U S A， 2001， 98 （17） ： 9505 -10. 12梁佩燕， 曾耀英， 王 通， 等. 地塞米松影响小鼠胸腺细胞线粒 体膜电势变化研究 J . 中国病理生理杂志，2005，21 （5） ： 962 -5. Study on the mitochondrial mass change in dexamethasone induced mouse thymocyte apoptosis WANG Tong，ZENG Yao-ying，XING Fei-yue LIANG Pei-Yan （Key Laboratory of Education Ministry for Tissue Transplantation and Immunology，Jinan University，Guangzhou 510630， China） Abstract： Aim To study on the mitochondrial mass change in mouse thymocyte apoptosis. Method Con- trol and Dexamethasone（DEX）groups were set；at 6h，we studied mitochondrial mass changes by NAO and Mitotracker Green （ MG）staining flowcytometry and detected mitochondrial membrane potential change ·665·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） with DiOC6（3）staining flowcytometry. We also used Annexin V-PE/ MG double staining flocytometry to ex- amine the mitochondrial changes in apoptosis progress. Results NAO staining results showed that 1 µmol· L -1 DEX stimulation reduced the cardiolipin content of thymocyte mitochondria（P 0. 01） . MG staining con- firmed the mitochondrial mass decline with DEX treat- ment（P 0. 01） ， and also found DEX reduced the Di- OC6（3）staining efficiency in thymocytes（P 0. 01） . Annexin V-PE/ MG staining results showed that cell population with low mitochondrial mass existed in ap- optotic thymocytes，and they were more in DEX group than in control group（P 0. 01） . Conclusion Mito- chondrial mass declined in DEX induced mouse thymo- cyte apoptosis；mitochondrial mass evaluation is prom- ising for the application to the apoptosis related immu- nological pharmacy study. Keywords： thymocyte； apoptosis； mitochondrial mass；NAO；mitotraker green 人 IL-24 基因在 CHO 细胞中的表达及其抗肿瘤效应 缪竞诚， 陈雄艳， 盛伟华， 谢宇锋， 杨吉成 （苏州大学医学院细胞和分子生物学教研室， 江苏 苏州 215123） 中国图书分类号： R-329. 25； R 342. 3； R 392. 12； R 394. 2； R 734. 202. 2 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 05 -0567 -04 摘要： 目的 构建人 IL-24 基因真核表达载体， 在 CHO 细胞 中进行稳定表达， 并检测重组表达蛋白 rhIL-24 的抗肿瘤活 性。方法 将测序验证的人 IL-24 基因亚克隆至真核表达 载体 pcDNA3， 构建重组真核表达载体 pcDNA3-hIL-24， 转染 CHO 细胞进行稳定表达， 经 RT-PCR 鉴定后用 MTT 法、 Ho- echst 染色和流式细胞术检测 CHO 细胞表达的 rhIL-24 诱导 A549 人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应， 用 ELISA 检测其刺 激免疫细胞分泌 IL-6 和 IFN- 的功能。结果 经双酶切和 PCR 鉴定， 重组真核表达载体构建正确， 人 IL-24 在 CHO 细 胞中获得稳定表达， 且所表达的人 IL-24 具有较强的诱导 A549 人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达 IL-6 和 IFN- 的免疫刺激活性。结论 人 IL-24 基因的稳定表达和抗肿 瘤效应的实验研究， 为进一步研究人 IL-24 抗肿瘤的分子机 制及潜在的应用奠定了基础。 关键词： 人白细胞介素-24 ； 稳定转染；CHO 细胞；凋亡 人 IL-24 是 IL-10 细胞因子家族中的新成员， 由 于 IL-24 基因首先在黑色素瘤中被发现， 因此， 也被 称为黑色素瘤分化相关因子-7 （mda-7） 基因 1 4。 人 IL-24 对肿瘤细胞有特异性的抑制作用， 如诱导 凋亡、 抑制肿瘤生长和抑制血管形成， 而对正常细胞 收稿日期： 2006 -01 -15， 修回日期： 2006 -02 -28 作者单位： 苏州大学医学发展基金资助项目 （No EE134517） 作者简介： 缪竞诚 （1952 - ） ， 男， 硕士， 教授， Tel： 0512-65880107， E- mail： mjc suda. edu. cn； 杨吉成 （1942 - ） ， 男， 教授， 博士生导师， 研究方向： 细胞 和分子生物学， 通讯作者， Tel： 0512-65880107， E-mail： jcy- ang suda. edu. cn 没有影响 5， 6。为进一步研究人 IL-24 基因表达产 物的生物学功能及开发应用， 在 COS-7 瞬时表达的 基础上 7， 本实验利用哺乳类动物细胞 CHO 的表达 特性， 进行了 hIL-24 的稳定表达研究。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌种、 质粒及细胞株 测序验证 8的重组 质粒 pUC19-hIL-24、 真核表达载体 pcDNA3、 E. coli 菌株 DH5 和 A549 人肺腺癌细胞及 CHO 细胞为苏 州大学医学院细胞和分子生物学教研室保存。 1. 1. 2 酶类及主要试剂 Kpn和 Xba购自大连 宝生物工程公司； T4 DNA 连接酶购自上海申能博 彩生物科技有限公司； Taq DNA 聚合酶购自上海博 亚生物技术有限公司； 逆转录酶 MMLV 购自 Pro- mega 公司； 脂质体 Lipofectamine 购自 Gibco 公司； 细胞凋亡 Hoechst 染色试剂盒购自碧云天公司； 山 羊抗人 mda-7 （c-16） 抗体购自 Santa Cruz 公司； 生物 素标记的兔抗山羊 IgG 购自 Anas Spac 公司； 亲和素 标记的碱性磷酸酶和 NBT/ BCIP 染色试剂盒购自 Sino-Americian Biotechnology 公司； 人 IL-6 和 IFN- ELISA 检测试剂盒购自晶美公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 重组质粒 pcDNA3-hIL-24 的构建和鉴定 用 Kpn和 Xba双酶切本室构建的 pUC19-hIL-24 质粒 DNA， 回收 hIL-24 目的基因片段， 将其定向亚 克隆至经 Kpn和 Xba双酶切的 pcDNA3 真核表 达载体上， 以常规氯化钙法将构建的 pcDNA3-hIL- 24 质粒转化 DH5 感受态细胞， 经 PCR 和双酶切后 电泳鉴定重组子。 ·765·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） ： 567 70