地塞米松对骨骼肌细胞蛋白降解的调节及其机制研究.pdf

·论著· 地塞米松对骨骼肌细胞蛋白降解的调节及其机制研究 申传安柴家科姚咏明盛志勇 【摘要】 目的研究地塞米松对体外培养的骨骼肌肌管内长寿命蛋白降解的影响及其可能的作用机制。 方法无菌分离( 2日龄) Wi s t a r大鼠双下肢肌肉,组织块法培养、增殖、传代纯化成肌细胞,融合形成肌管,使 用L 3 , 5 3 H酪氨酸标记肌管长寿命蛋白后,随机分成两组 。A组: 分别用不含地塞米松(对照组)或含地 塞米松1 0n mo l / L ( A1组) 、 1 0 0n mo l / L ( A2组) 、 10 0 0n mo l / L ( A3组)的培养液培养肌管, 1 2 、 2 4 、 3 6和4 8h后 使用液体闪烁计数仪测定培养液和细胞内L 3 , 5 3 H酪氨酸的含量,计算肌管长寿命蛋白的降解率。 B组:分别用含蛋白酶体抑制剂MG1 3 2 ( 5 0µ mo l / L , B 1组) 或含MG1 3 2 ( 5 0µ mo l / L )和地塞米松1 0 0n mo l / L ( B 2组)的培养液培养肌管2 4h ,相同方法测定肌管长寿命蛋白降解率。结果A1 、 A2和A3组长寿命蛋白降 解率均较对照组显著增加,差异有显著性( P均0 . 0 5 ) 。 B 1组长寿 命蛋白降解率较对照组( 2 4h )降低明显, B 2组长寿命蛋白降解率较A2组( 2 4h )显著降低,差异均有显著性 ( P均3 r 39 r o l i 4 3 r a t 3 1i nt i s s 0 3 : l o 5 a s r a 1 i o l a : 3 l l 3 1 i t h L 3 , 5 3 Ht 2 r o s i n 3 ,a n 1t h 3 nt h 3m2 o t 0 : 3 s 3 r 31 i 8 i 1 3 1i n t ot o7 r o 0 9 s .? n7 r o 0 9A, t h 3m2 o t 0 : 3 s 3 r 3 5 0 l t 0 r 3 1i n 0 : : 3 5 5 o = smo 1 i 4 i 3 1A a 7 l 3 = sm3 1 i 0 m ( MA M)5 o n t a i n i n 71 0 B 4 3 t a l : o 8 i n 3s 3 r 0 m ( C B D )a n 1 2mmo l / L t 2 r o s i n 3i t h o 0 t1 3 6 a m3 t h a s o n 3( 5 o n t r o l 7 r o 0 9 ) ,i t h1 3 6 a m3 t h a s o n 31 0n mo l / L( 7 r o 0 9A1 ) , 1 3 6 a m3 t h a s o n 31 0 0n mo l / L( 7 r o 0 9A2 ) ,a n 11 3 6 a m3 t h a s o n 310 0 0n mo l / L( 7 r o 0 9A3 ) , r 3 s 9 3 5 t i 8 3 l 2 ./ h 3 a mo 0 n t so 4 L 3 , 5 3 Ht 2 r o s i n 3i n5 0 l t 0 r 3m3 1 i 0 m a n 15 3 l l s3 r 31 3 t 3 r mi n 3 1a n 1t h 31 3 7 r a 1 a t i o nr a t 3 so 4 l o n 7l i 8 3 19 r o t 3 i n3 r 35 a l 5 0 l a t 3 1a t1 2 ,2 4 ,3 6 ,4 8h o 0 r so 45 0 l t 0 r 3 .? n7 r o 0 9B ,t h 3m2 o t 0 : 3 s3 r 3 5 0 l t 0 r 3 1i n MA M 5 o n t a i n i n 71 0 B C B Da n 12mmo l / Lt 2 r o s i n 3i t h5 0µ mo l / L9 r o t 3 a s o m3i n h i : i t o r MG1 3 2 ( 7 r o 0 9B 1 ) ,o r5 0µ mo l / LMG1 3 2a n 11 0 0n mo l / L1 3 6 a m3 t h a s o n 3( 7 r o 0 9B 2 ) .E r o t 3 o l 2 t i 5r a t 3 so 4 9 r o t 3 i n 3 r 35 a l 5 0 l a t 3 1i t ht h 3s a m3a 2a s7 r o 0 9A a t2 4h o 0 r s .F e s u l t s / h 39 r o t 3 o l 2 t i 5r a t 3o 4l o n 7 l i 8 3 1 9 r o t 3 i ni n7 r o 0 9A1 ,7 r o 0 9A2a n 17 r o 0 9A3a sa l l i n 5 r 3 a s 3 1s i 7 n i 4 i 5 a n t l 25 o m9 a r 3 1i t ht h a ti n5 o n t r o l 7 r o 0 9( a l l Pi t ht h a ti n7 r o 0 9A1( : o t h Pa sn os t a t i s t i 5 a l l 2s i 7 n i 4 i 5 a n t1 i 4 4 3 r 3 n 5 3: 3 t 3 3 n7 r o 0 9A2a n 17 r o 0 9A3 ( P0 . 0 5 ) .E r o t 3 o l 2 t i 5r a t 3o 4 l o n 7 l i 8 3 19 r o t 3 i ni n7 r o 0 9B 1a ss i 7 n i 4 i 5 a n t l 2l o 3 rt h a nt h a ti n5 o n t r o l 7 r o 0 9( Pa sma r 3 rt h a nt h a t i n 7 r o 0 9A2( Pa 2 so 41 3 7 r a 1 a t i o no 4l o n 7 l i 8 3 19 r o t 3 i ni n5 0 l t 0 r 3 1m2 o t 0 : 3 s ,a n 11 3 6 a m3 t h a s o n 35 o 0 l 1 3 n h a n 5 3t h 31 3 7 r a 1 a t i o no 4l o n 7l i 8 3 19 r o t 3 i ni n5 0 l t 0 r 3 1m2 o t 0 : 3 s: 2a 5 t i 8 a t i n 70 : i H 0 i t i n9 r o t 3 a s o m3 9 a t h a 2i n1 o s 3 1 3 9 3 n 1 3 n t ma n n 3 r . 【 Ie yJ o r d s 】1 3 7 r a 1 a t i o no 49 r o t 3 i n ;m2 o t 0 : 3 ;s 0 . 0 5 ) 。 表1地塞米松对伤后不同时间肌管长寿命 蛋白降解率的影响( x ±s , n =1 2 ) T a b l e1 E f f e c t so fd e x a me t h a s o n eo nd e g r a d a t i o n i nc u l t u r e dmy o t u b e sl o n g l i v e dp r o t e i na t d i f f e r e n t t i mea f t e ri n j u r y ( x ±s , n =1 2 ) 组别 长寿命蛋白降解率 伤后1 2h伤后2 4h伤后3 6h伤后4 8h 对照组 0 . 1 7 ±0 . 0 20 . 3 8 ±0 . 0 10 . 5 6 ±0 . 0 30 . 7 5 ±0 . 0 2 A1组 0 . 2 0 ±0 . 0 1 * 0 . 4 1 ±0 . 0 2 * 0 . 6 2 ±0 . 0 2 * 0 . 8 2 ±0 . 0 3 * A2组 0 . 2 4 ±0 . 0 4 *“ 0 . 4 8 ±0 . 0 3 *“ 0 . 7 2 ±0 . 0 4 *“ 0 . # 6 ±0 . 0 2 *“ A3组 0 . 2 3 ±0 . 0 3 *“ 0 . 4 # ±0 . 0 5 *“ 0 . 7 3 ±0 . 0 3 *“ 0 . # 7 ±0 . 0 6 *“ 注:与对照组比较: *P 0 . 0 1 ;与A1组比较:“P 0 . 0 1 2 . 2 蛋白酶体抑制剂MG1 3 2对地塞米松增强肌管 内长寿命蛋白降解率的抑制作用(表2 ) : B 1组长寿 命蛋白降解率较对照组显著降低( P0 . 0 1 ) ; B 2组 长 寿 命 蛋 白 降 解 率 较 A2组( 2 4h )亦 显 著 降 低 ( P0 . 0 1 ) 。 表2 $%1 3 2对地塞米松增强肌管内长寿命蛋白 降解率的抑制作用( x ±s , n =1 2 ) T a b l e2 与A2组比较:(P 0 . 0 1 3 讨论 烧伤、创伤患者,特别是在合并感染后,革兰阴 性菌产生的内毒素等致热源刺激机体,使机体长期 处于应激状态,体内糖皮质激素分泌明显增加。糖皮 质激素是体内主要应激激素和促分解代谢激素之 一,具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢作 用,还具有抗炎作用,称其为)糖皮质激素*是因为其 调节糖类代谢的活性最早为人们所认识 4 。新近研 究发现,糖皮质激素可能与重症烧伤、创伤、脓毒症 等炎症性疾病时负氮平衡主要原因之一的骨骼肌蛋 白高降解密切相关。 3 . 1 糖皮质激素与骨骼肌蛋白代谢:既往动物实验 研究中发现,重症烧伤、创伤、脓毒症等炎症性疾病 +031+ 中国危重病急救医学2 0 0 6年3月第1 8卷第3期 , h i n, r i t , a r eMe d , Ma r c h2 0 0 6 , -o l . 1 8 , .o . 3 时外周血内糖皮质激素含量与骨骼肌蛋白降解率呈 正相关,静脉注射糖皮质激素能增强大鼠骨骼肌蛋 白降解,由此认为,糖皮质激素可能是上述炎症性疾 病时负氮平衡、骨骼肌蛋白高代谢的介导因素之一。 为进一步探讨糖皮质激素与骨骼肌蛋白降解的 关系,本实验中选用了成分单一的离体培养骨骼肌 肌管作为研究对象。骨骼肌肌管内蛋白按照降解快 慢可分为短寿命蛋白和长寿命蛋白,其中绝大部分 为长寿命蛋白,如肌凝蛋白、肌动蛋白等。各种长寿 命蛋白的半寿期也有差异,肌型肌酸激酶同工酶为 7 5h , 肌凝蛋白轻链为2 9h ,肌凝蛋白重链为2 0 2 0 0h ,肌动蛋白为1 4 2h ,平均半寿期在4 0h左右。 由于骨骼肌细胞既不合成、也不分解酪氨酸 5 ,因此 采用L 3 , 5 3 H酪氨酸标记肌管蛋白能较准确 地反映蛋白分解代谢率。既往研究认为,高浓度的酪 氨酸能够使细胞内酪氨酸含量迅速升高,加快细胞 内外酪氨酸浓度的动态平衡,从而尽量减少蛋白分 解释放的L 3 , 5 3 H酪氨酸被细胞重新利用,提 高蛋白降解率测定的准确性。本实验中所用浓度 2mmo l / L是酪氨酸在D ME M 中的最大溶解度,此 浓度下细胞内氨基酸池在2 0mi n内即能达到稳定 的动态平衡,且能显著减少细胞对L 3 , 5 3 H酪 氨酸的重新利用。 本实验结果发现,使用地塞米松培养骨骼肌肌 管,能显著增强其长寿命蛋白降解,而且此效应在一 定范围内呈量 效依赖关系,但在超过一定浓度后 ( 1 0 0n mo l / L与10 0 0n mo l / L作用差异无显著性) , 蛋白降解率不再随浓度增加而增加,这可能与地塞 米松与肌管糖皮质激素受体已达饱和有关。 3 . 2 糖皮质激素调节骨骼肌蛋白代谢的机制:糖皮 质激素是如何调节肌管内蛋白降解的呢?肌细胞内 有多种蛋白降解途径,分为溶酶体途径和非溶酶体 途径两大类,后者又分为能量依赖性途径和非能量 依赖性途径。泛素 蛋白酶体途径属于能量依赖性途 径,是新近发现的一种细胞内选择性蛋白降解途径, 目前研究认为该途径与骨骼肌蛋白降解关系密切。 该系统主要由泛素、泛素相关酶和蛋白酶体3个部 分组成,其中蛋白酶体是靶蛋白降解的场所 1 , 2 , 6 。 本实验结果显示,使用含有蛋白酶体抑制剂MG1 3 2 的培养液培养肌管,抑制蛋白酶体活性后,肌管内长 寿命蛋白的降解率明显下降,这说明在生理状态下, 泛素 蛋白酶体途径在骨骼肌细胞内蛋白的降解中 起重要作用。同时也提示,使用MG1 3 2抑制蛋白酶 体活性能显著抑制地塞米松对肌管长寿命蛋白降解 的增强作用,说明糖皮质激素可能是通过增强泛 素 蛋白酶体途径的活性来增强骨骼肌肌管内长寿 命蛋白降解的。 糖皮质激素属甾类激素,呈脂溶性,可经简单扩 散进入细胞内,其效应是通过与胞浆受体结合形成 激素 胞浆受体复合物后进入核内,与核内受体结合 形成受体二聚体,然后该二聚体与激素调节元件结 合,调节特异性靶基因的转录。本实验室既往的研究 结果发现,糖皮质激素调节元件位于含有泛素耦联 酶E 2 1 4k u和泛素基因的启动子内,提示糖皮质激 素可能与泛素 蛋白酶体途径基因表达的调节有关; 脓毒症大鼠在骨骼肌蛋白降解增高的同时,外周血 糖皮质激素含量显著上升,且伴有骨骼肌组织内泛 素 蛋白酶体途径多种成分的基因表达显著增强。而 使用糖皮质激素受体拮抗剂R U3 8 4 8 6能显著抑制 烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解率和泛素 蛋白酶 体途径基因表达的增强 7 。结合本实验所得出“使用 蛋白酶体抑制剂能够显著抑制地塞米松对肌管长寿 命蛋白降解的增强作用“的结果,提示糖皮质激素可 能是在基因水平增强泛素 蛋白酶体途径的活性而 导致骨骼肌蛋白降解增强。 参考文献: 1姚咏明,盛志勇,林洪远,等.脓毒症定义及诊断的新认识 J . 中国危重病急救医学, 2 0 0 4 , 1 6 : 3 2 1 3 2 4 . 2Wo l fD H, Hi l tW, S o mme rT . D e a t hg i v e sb i r t ht ol i f e : t h e e s s e n t i a l r o l e o f t h e u b i q u i t i n p r o t e a s o me s y s t e mi nb i o l o g y J . B i o c h i m B i o p h y sAc t a , 2 0 0 4 , 1 6 9 5 : 1 2 . 3R o o sMa t t j u sP ,S i s t o n e n L .T h eu b i q u i t i np r o t e a s o me p a t h wa y J . An nMe d , 2 0 0 4 , 3 6 : 2 8 5 2 9 5 . 4 申传安,柴家科,姚咏明,等.糖皮质激素对大鼠骨骼肌蛋白分解 代谢的影响及其机制探讨 J .中国危重病急救医学, 2 0 0 2 , 1 4 : 4 2 8 4 3 1 . 5G u l v eE A,D i c eJF .R e g u l a t i o n o fp r o t e i n s y n t h e s i sa n d d e g r a d a t i o ni nL 8my o t u b e s J . B i o c h e m J , 1 9 8 9 , 2 6 0 : 3 7 7 3 8 7 . 6P i c k a r tC M,E d d i n sM J .Ub i q u i t i n :s t r u c t u r e s ,f u n c t i o n s , me c h a n i s ms J . B i o c h i m B i o p h y sAc t a , 2 0 0 4 , 1 6 9 5 : 5 5 7 2 . 7姚咏明,柴家 科,林洪 远,主 编.现代 脓毒 症理 论与 实践 M . 北京:科学出版社, 2 0 0 5 : 4 6 6 4 7 4 . (收稿日期: 2 0 0 5 1 2 1 0 修回日期: 2 0 0 6 0 1 2 5 ) (本文编辑:李银平) ·广告目次· 珠海丽珠:丽珠血液灌流器(封二) 深圳迈瑞:监护仪(插页) 天津红日:血必净(封三) 索诺声有限公司:便携式彩超(封底) ·131· 中国危重病急救医学2 0 0 6年3月第1 8卷第3期 C h i nC r i t C a r eMe d , Ma r c h2 0 0 6 , Vo l . 1 8 , No . 3