大肠杆菌P蛋白和T蛋白的调节结构域互换研究.pdf

I S S N CN 1 0 0 7 - 7 6 2 6中国生物化学与分子生物学报 1 1 - 3 8 7 0 / Q C h i n e s e J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y a n d Mo l e c u l a r B i o l o 2 0 0 6 年4月 2 2 ( 4 ) : 2 9 6 一3 0 0 S w i t c h o f R e g u l a t o r y D o m a i n s o f P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n f r o m E. c o l i X U E Q i a o , S U N H o n g - Y i n g , Y I N G Y u e - B i n ， C H E N S h u - Q i n g ' ( C o l l e g e of P h a r m a c e u t ic a l S c i e n c e s ， Z h e j i a n g U n iv e r s i t y , 3 1 0 0 3 1 ， C h i n a ) A b s t r a c t C h o r i s m i c a c i d i s a m i d - m e t a b o l i t e t h a t p l a y s a c e n t r a l r o l e i n t h e m e t a b l i s m p r o c e s s d i s t r i b u t i n g i n t h e b a c t e r i u m , e p i p h y t e a n d p l a n t s . I t i s a c o m m o n p r e c u r s o r s u b s t a n c e o f t h e a l l a r o m a t i c a m i n o a c i d s t h a t c a n t u rn i n t o p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e c a t a l y z e d b y b i - f u n c t i o n a l e n z y m e c h o r i s m a t e m u t a s e( C M) - p re p h e n a t e d e h y d r a t a s e ( P D T ) a n d c h o r i s m a t e m u t a s e - p r e p h e n a t e d e h y d r o g e n a s e( P D H ) r e s p e c t i v e l y . C M P - P D T w i t h i t s r e g u l a t e d o m a i n R P w e r e c a l l e d P - p r o t e i n a n d C M , - P D H w i t h i t s r e g u l a t e d o m a i n R , w e r e c a l l e d T - p r o t e i n . P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n f r o m E .c o l i .h a v e a s i m i l a r s t r u c t u r e ，b o t h o f w h i c h c o n t a i n e d t h r e e d o m a i n s : C M , ， P D T , R P i n P - p r o t e i n a n d C M , ， P D H ， R , i n T - p r o t e i n · P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n a r e r e g u l a t e d b y t h e i r e f f e c t o r s p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e r e s p e c t i v e l y t h r o u g h b i n d i n g t o t h e i r R P a n d R , d o m a i n s · R P a n d R , d o m a i n s w e r e s w i t c h e d b e t w e e n P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n b y c l o n i n g o f c h i m e r i c p r o t e i n s . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t r e g u l a t o ry e f f e c t s w e r e s w i t c h e d a l o n g t h e s w i t c h o f R d o m a i n s a n d t h e s w i t c h o f t h e r e g u l a t o ry d o m a i n s l e a d t o t h e s w i t c h o f e f f e c t o r s .I t m e a n s t h a t t h e c o m b i n a t i o n o f t h e r e g u l a t o ry d o m a i n a n d t h e e f f e c t o r i s s p e c i f i c a n d t h e r e g u l a t i n g o f t h e r e g u l a t o ry d o m a i n t o t h e e n z y m e a c t i v i t y i s n o n - s p e c i f i c . T h i s p r o p e r t y o f R d o m a i n s m a y m a k e t h e m p o s s i b l e m o l e c u l a r e l e m e n t s i n t h e s t u d y o f m o l e c u l a r m a c h i n e s . w o r d s E. c o l i ; P - p r o t e m ;T - p r o t e i n ; r e g u l a t o ry d o m a i n ; m o l e c u l a r e l e m e n t 大肠杆菌 P蛋白和 T蛋白的调节结构域互换研究 薛乔， 孙红颖， 应跃斌， 陈枢青 ( 浙江大学药学院生物制药研究室， 杭州3 1 0 0 3 1 ) 在细菌、 真菌及植物中， 分支酸是一种位于关键分叉点上的中间代谢物， 是所有芳香族氨基 酸合成的共同前体. 它可在双功能酶分支酸变位酶( C M) 和预苯酸脱水酶( P D T ) 的催化下合成苯丙 氨酸， 在另一个双功能酶分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶( P D H ) 的催化下合成酪氨酸. 前者被称为 P 蛋白， 后者被称为T 蛋白. 大肠杆菌P 蛋白 和T 蛋白 有着类似的结构， P 蛋白由C M P , P D T 和调节结 构域3 个独立结构域组成， 其变构调节因子是苯丙氨酸. T 蛋白只有C M , 和P D H两个独立结构域组 成， 起变构调节作用的调节结构域与P D H密不可分， 其变构调节因子是酪氨酸. 为了研究P蛋白和 T蛋白的调节结构域的变构调节作用， 应用融合蛋白技术将 P蛋白和 T蛋白的调节结构域进行了 互换. 结果发现， 互换了的调节结构域仍然具有变构调节作用， 而且调节结构域的互换导致了变构 调节因子的互换， 说明调节结构域对酶活性的调节作用是非专一的， 而其 R结构域与调节因子的 结合却是专一的. 关键词大肠杆菌; P蛋白; T蛋白; 调节结构域; 分子元件 中图分类号 Q 8 1 2 ; R 3 9 2 M o l e c u l a r m a c h i n e i s a h o t a r e a r e c e n t l y , a n d t h e k e y i s t h e c o n s t i t u t e p a rt s ， k n o W n a s m o l e c u l a r e l e m e n t s . R e c e i v e d : S e p t e m b e r 5 , 2 0 0 5 ; A c c e p t e d : D e c e m b e r 1 2 , 2 0 0 5 S u p p o rt e d b y N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f Z h e j i a n g P r o v i n c e ( N o 3 0 2 1 1 0 ) a n d N a t u r a l S c ie n c e F o u n d a t i o n f r o m M i n i s t ry o f E d u c a t i o n o f C h i n a ( N o J 2 0 0 4 0 1 4 1 ) * C o r r e s p o n d i n g a u t h o r T e l : 8 6 - 5 7 1 - 8 7 2 1 7 4 0 6 , E - m a i l : c h e n s h u g i n g z j u . e d u . c n 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 9 - 0 5 ， 接受日 期: 2 0 0 5 - 1 2 - 1 2 浙江省自 然科学基金( N o . 3 0 2 1 1 0 ) 和国家教育部回国人员启动基金( N o . J 2 0 0 4 0 1 4 1 ) 资助 联系人T e l : 0 5 7 1 - 8 7 2 1 7 4 0 6 , E - m a i l : c h e n s h u g i n g z j u . e d u . c n No. 4 X U E Q i a o e t a l : S w i t c h o f R e g u l a t o ry D o m a i n s o f P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n f r o m E. c o l i2 9 7 C h o r i s m i c a c i d i s a m i d - m e t a b o l i t e t h a t p l a y s a c e n t r a l ro l e i n t h e m e t a b l i s m p r o c e s s d i s t r i b u t i n g i n t h e b a c t e r i u m， e p i p h y t e a n d p l a n t s . I t i s a c o m m o n p r e c u r s o r s u b s t a n c e o f a l l t h e a r o m a t i c a mi n o a c i d s t h a t c a n t u rn i n t o p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e c a t a l y z e d b y b i - f u n c t i o n a l e n z y m e c h o r i s m a t e m u t a s e( C M ) - p r e p h e n a t e d e h y d r a t a s e ( P D T ) a n d c h o r i s m a t e m u t a s e - p r e p h e n a t e d e h y d ro g e n a s e ( P D H ) ， r e s p e c t i v e l y . C M P - P D T w i t h i t s r e g u l a t e d o m a i n R P w e r e c a lle d P - p r o te i n l' l a n d C M : 一 P D H w it h it s r e g u la t e d o m a i n R , w e r e c a ll e d T - p ro te in 2 1 . P - p r o te in a n d T - p r o t e i n a r e b o t h b i - f u n c t i o n a l e n z y m e s t h a t c a t a l y z e t w o - s t e p r e a c t i o n s .P - p r o t e i n t h a t p l a y s a c e n t r a l r o l e o f p h e n y l a l a n i n e b i o s y n t h e s i s c a t a l y t i c d o m a i n s c h o r i s m a t e ( S c h e m e 1 )c o n t a i n s t w o m u t a s e ( C M , ， E C 5 . 4 . 9 9 . 5 ) a n d p r e p h e n a t e d e h y d r a t a s e ( P D T , E C 4 . 2 . 1 . 5 1 ) a s w e l l a s o n e r e g u l a t o ry ( R P ，p h e n y l a la n i n e a s e f f e c t o r ) . T - p r o t e in d o ma i n t h a t i s r e s p o n s e h l e b i o s y n t h e s i s( S c h e m e 2 )al s o d o m a i n s c h o r i s m a t e m u t as e( C M , ， c o n t a i n s f o r t y r o s i n e t w o c a t al y t i c 、，尹5 5a EC 5. 4. p r e p h e n a t e d e h y d r o g e n a s e( P D H , E C 1 . 3 . 1 . 9 9. 1 2 ) a n d we l l a s o n e r e g u l a t o ry d o m a i n( R , ，t y r o s i n e a s e f f e c t o r ) . A l t h o u g h P - p r o t e i n a n d T - p r o t e i n h a v e a s i m i l a r s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n ，t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e s a r e d i f f e r e n t ， e v e n C M P a n d C M , w h i c h c a t al y z e a s a m e r e a c t i o n . “ 0 2C_ 戈 一， J尹 P D T Ph e c h o r i s r r a t e p r e p h e r 旧 tep h e n y lp y r u v a t e ( S c h e m e 1 ) T y r c h o r i s ma t e p r e p h e n a t ep - h y d r o x y p h e 叫初T U V a t e ( S c h e m e 2 ) I n 1 9 9 0 , G a n e m s g r o u p “ f o u n d t h a t t h e N - t e r m i n al 1 0 9 r e s i d u e s o f t h e 3 8 6 a m i n o a c i d P - p r o t e i n r e t a i n e d f u l l C M P a c t i v i t y . T h e y f u rt h e r m a p p e d P D T a n d R P d o m a in in 1 9 9 8 ' 1 a n d f o u n d t h a t t h e s e p a r a t e ly e x p r e s s e d P D T d o m a i n e x h i b i t e d i t s a c t i v i t y w i t h o u t f e e d b a c k i n h i b i t i o n o f p h e n y l a l a n i n e ， w h i l e t h e s e p a r a t e l y e x p r e s s e d R P d o m a i n r e t a i n e d i t s p h e n y l al a n meb i a c t i v i t y . I n 2 0 0 3 ， a f f e c t C M , a c t i v i t y th e y r e p o r te t h e r e w a s n o e f f e c t o b s e r v e d f o r t y r o s i n e o n P - p r o t e i n a n d C M 。 一 R P e i t h e r , w h i c h c o n t a i n e d n o R , d o m a i n . T h e s e r e s u l t s w e r e i n g o o d a g r e e m e n t w i t h o u r s u p p o s i t i o n t h a t R P a n d R t d o m a i n s e x p r e s s e d s e p a r a t e l y ; f u s e d w i t h o t h e r p r o t e i n s re t a i n e d t h e i r p r o p b i n d i n g t o s p e c i f i c a l l o s t e r i c e ff e c t o r s a n d a l l o s t e r i c e f f e c t s t o t h e i r a d j o i n i n g d o m a i n s场 t h e i r c o n f o r ma t i o n s . e rt i e s o f s h o w i n g c h a n g i n g F i g . 2 S D S - P A G E a n a l y s i s o f p u r i fi e d f u s i o n p r o t e i n s 1 : P r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ; 2 : P u re P - p r o t e i n 4 4 k D ; 3 : P u r e T - p ro t e i n 4 3 k D ; 4 : P u r e C M P - R , 4 5 k D ; 5 : P u r e C M , - R P 2 4 k D T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e p ro t e i n s i n t h e P A G E，a ll c e rt i f i e d场M S F u rt h e r mo r e w e d e t e r mi n e d t h e i n fl u e n c e s o f 0 . 3 m m o l / L p h e n y l a l a n i n e a n d 0 . 3 m m o l / L t y r o s i n e o n K m o f c h o r i s m a t e m u t a s e b y u s i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t e s . T h e a c t i v a t i o n o f c h o r i s ma t e m u t a s e w a s i n d e e d a c c o m p a n i e d b y t h e d e c r e a s e o f t h e v a l u e o f K m ， a n d t h e i n h i b i t i o n o f c h o r i s m a t e m u t a s e w a s g o n e w i t h t h e r a i s e o f t h e v a l u e o f K m ( T a b l e 3 ) . 3 D i s c u s s i o n T h e c o n f o r m a t i o n o f t h e r e g u l a t o ry d o m a i n s w i l l c h a n g e w h e n t h e y b i n d t o t h e r e g u l a t o ry e f f e c t o r s ，t h u s c a n c o n s e q u e n t l y a f f e c t t h e f u n c t i o n a l d o m a i n s a d j o i n i n g t o t h e m. T h i s b a s i c p ro p e rt y o f r e g u l a t o ry d o m a i n s , e s p e c i a l l y s e p a r a t e d o m a i n s ，w o u l d b e m o r e u s e f u l i n m o l e c u l a r m a c h i n e s t u d y f o r t h e y c o u l d b e m o l e c u l a r e l e m e n t s . P - p ro t e i n a n d T - p r o t e i n f ro m E s c h e ri c h i a c o l i . w o u l d b e e x c e l l e n t m o d e l s b e c a u s e t h e i r s e p a r a t e d o m a i n s c o u l d d i s p l a y t h e i r o w n a c t i v i t i e s . Wh i l e t h e m e c h a n i s m o f i n t e r a c t i o n o f p h e n y l a l a n i n e o n C M , a n d P D T d o m a i n s f r o m P - p r o t e i n r e m a i n s u n c l e a r 3 0 0 C h i n e s e J o u rna l o f B i o c h e m i s t ry a n d M o l e c u l a r B io l o g y Vo l . 2 2 nn 6工f 钾且钾且 ( A)( B ) 1 6 0 n11nnn一U 34几jZeso 求乡之书.军苟1。召 卜1一一一日 4030201000 攀扮之书.军益1。“ 9 0 ， 8 0 L 00 0了8 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 00 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 c ( P h e ) / g m o l -L 1c ( T ) rr ) / p m o h L 1 F i g . 3 E ff e c t s o f p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e o n C M a c t i v i t i e s o f t h e p u r i fi e d P - p r o t e i n , T - p r o t e i n , C M, - R , a n d C M, 一 凡 ( A ) E ff e c t o f T y ro s i n e o n C M a c t i v i t i e s o f t h e p u r if i e d P - p r o t e i n , T - p ro t e i n , C M P - R , a n d C M , - R p ( B ) E ff e c t o f p h e n y la la n i n e o n C M a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d P - p r o t e i n , T - p r o t e i n , C M P - R , a n d C M , - R p 一.-P - p ro t e i n ; 一一T - p ro t e in ; 一令一C M p - R t -.一C M t - R p T a b l e 3 T h e e ff e c t o f 0 . 3 n t m o l / L p h e n y l a l a n i n e a n d 0 . 3 n u n o l / L tyr o s i n e o n t h e K m o f t h e c h o r i s ma t e mu t a s e P r o t e i n s N o r e g u l a t o r P - p r o t e i n 2 3 6 土3 2 p m o 1 / L 3 0 0 1 cm o l / L P h e 3 0 6 土 5 8 p m o l / L T - p r o t e i n 3 4 4 士 7 9 K m o 1 / L N A C M , - R , 8 0 5 士 8 2 p m o l / L N A C M , - R P 1 1 2 1 士1 4 5 拌 m o l / L 8 3 2 士 8 4 l cm o l / L 3 0 0 l cm o l / L T y r NA 2 4 7 士 6 0 p m o 1 / L 7 0 3 士 5 5 p m o l / L NA NA: N o t a v a i l a b l e t h u s f o r ; a n o b v i o u s i n h i b i t i o n o f p h e n y l a l a n i n e o n t h e P D T w a s o b s e r v e d b e c a u s e o f t h e d i r e c t a s s o c i a t i o n o f P D T a n d R P d o m a i n ， h o w e v e r t h e R P d o m a i n a n d C M P d o m a i n w e r e o b s t r u c t e d b y P D T d o m a i n s o t h a t a w e a k i n h i b i t i o n o f p h e n y l a l a n i n e o n c h o r i s m a t e m u t a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d .T h o u g h t y r o s i n e d i s p l a y e d a n i n t e n s e i n h i b i t i o n o n P D H a c t i v i t y f r o m T - p r o t e i n ， i t w a s r e a s o n l e s s t h a t a w e a k a c t i v a t i o n o f t y r o s i n e o n C M , w a s o b s e r v e d . We h a d d e t e r m i n e d m a n y t i m e s a b o u t i t b u t t h e r e s u l t w a s t h e s a m e .I t i s m o r e r e a s o n l e s s t h a t C M , i n C M , - R P a n d C M P i n C M , 一 R , w e r e b o t h a c t i v a t e d b y t h e a d d i n g o f p h e n y l a l a n i n e a s w e l l a s t y r o s i n e ， b u t t h i s r e s u l t w a s i n a g o o d a g r e e m e n t w i th G a n e m g r o u p , s 3 1 C M , 一 R P s t u d y . T h e r e g u l a t o ry d o m a i n b a s i c a l l y h a d t w o f u n c t i o n s ， o n e i s t o b i n d s p e c i f i c a l l y t o t h e r e g u l a t o ry e f f e c t o r a n d t h e s e c o n d i s t o c h a n g e i t s c o n f o r m a t i o n t o a f f e c t t h e f u n c t i o n o f a d j a c e n t d o m a i n a f t e r t h e b i n d i n g o f e f f e c t o r . T h e n a t u r a l m o l e c u l e s w e r e t h e r e s u l t o f t h e l o n g - t e r m e v o l u t i o n t h a t c a n b e a c t i v a t e d o r i n h i b i t e d a c c o r d i n g t o t h e r e g u l a t o ry n e e d s ，w h e r e a s t h e e n g i n e e r e d p r o t e i n s w e r e u n c e r t a i n . I t w a s r e l a t e d t o t h e p r o p e rt i e s o f t h e t w o f u s e d d o m a i n s a n d r e l a t e d t o t h e l e n g t h s a n d t h e c o m p o n e n t s o f t h e p e p t i d e c o n n e c t i n g t h e m. S o i t i s p r e t t y n o r m a l t h a t a c t i v a t i o n e f f e c t s w e r e o b s e r v e d i n t h i s s t u d y . T y r o s i n e c a n o n l y b i n d t o R , d o m a i n ，s o i t i s r e a s o n a b l y o b s e r v e d t h a t o n l y C M a c t i v i t y o f C M , 一 R , a n d T - p r o t e i n c a n b e a ff e c t e d .Wh i l e p h e n y l a l a n i n e c o u l d a c t i v a t e t h e C M a c t i v i t y o f C M , - R P a n d i n h i b i t t h e C M a c t i v i t y o f P - p r o t e i n f o r t h e y h a v e R P d o m a i n s . C M P 一 R P f r o m G a n e m s s t u d y s h o w e d t h a t a c t i v a t i o n e f f e c t o f p h e n y l a l a n i n e w a s a l s o o b s e r v e d . T h i s m e a n s t h a t t y r o s i n e c o u l d r e g u l a t e t h e a c t i v i t y o f C M , a n d p h e n y l a l a n i n e c o u l d a f f e c t t h e a c t i v i t y o f C M , i n c h i m e r i c m o l e c u l e s w h i c h w e r e n o t t h e o r i g i n a l p r o p e rt i e s o f t h e e f f e c t o r s . I t i m p l i e s t h a t r e