小鼠派氏集合淋巴结T细胞活化和调节性T细胞的分析.pdf

5 3 7 文章编号 1 0 0 ( 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 5 3 7 一 0 6 小鼠派氏集合淋巴结 T细胞活化和 调节性 T细胞的分析关 黄秀艳， 曾 耀英 ，肇静娴， ( 暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室， 王通 广东 广州 5 1 0 6 3 2 ) 摘要 目的: 通过对小鼠派氏集合淋巴 结( P P S ) 、 肠系膜淋巴结( M L N s ) 和腹股沟淋巴结( I L N s ) 的比较性研 究， 以分析P P s T 细胞活化和调节性T 细胞的功能特点。 方法: 无菌分离小鼠P P s , M L N s 和I L N s ， 分别制备单个淋巴 细胞悬液， 运用流式细胞术结合荧光抗体染色技术来检测C D 3 十 T 细胞、 C D 3 + C D 4 + 辅助性T 细胞和C D 4 十 C D 2 5 十 调节 性T 细胞的比例; 用多克隆刺激剂刀豆蛋白A ( C o n A ) 、 佛波醇P H ( P D B ) 和离子霉素( I o n ) 刺激活化淋巴细胞， 随后运 用流式细胞术结合双色荧光抗体染色技术来检测T 细胞早期活化标志C D 6 9 的表达水平。 结果二 P P S 内C D 3 十 T 细胞 所占比例明显低于M L N s 和II N S ， 然而C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T 细胞的比例明显高于M L N S 和 I L N s ; 在没有加入刺激剂 的培养条件下， P I 、 来源的T 细胞C D 6 9 的表达水平明显高于M L N s 和I L N s 来源的T 细胞， M L N s 来源的T 细胞C D 6 9 的表达水平明显高于I L N s 来源的T 细胞; 而在加人C o n A 或者单纯P D B 的培养条件下， P P S 来源的T 细胞却表现出 低反应性; 在加人P D B 十 I o n 的培养条件下， 3 者来源的T 细胞 C D 6 9 的表达水平没有明显差别。 结论: P P S 内C D 3 ' T 细胞所占比例较低， C D 4 ' C D 2 5 + 调节性T 细胞的比例较高， 这可能是P P S 整体T 细胞低反应性的原因之一; P P S 来源 T 细胞的高基础活化率可能与其不断接触小肠来源的食物和共生菌抗原有关; P P S 来源T 细胞选择性地对某些刺激 剂表现出低反应性， 提示这群细胞处于某种程度的无能状态。上述特征的生物学意义在于避免因为不断接受小肠 来源的食物和共生菌抗原的刺激而发生病理性炎症的同时还保留 对病原微生物抗原的应答。 关键词 淋巴 集结; T 淋巴细胞; 淋巴细胞转化; 小鼠 中图分类号 8 3 6 3 文献标识码 A y s i so f T c e l l a c t i v a t i o n a n d r e g u l a t o r y T c e ll d e r i v e d f r o m m u r i n e P e y - e r s p a t c h e s H U A N G X i u 一 y a n ， Z E N G Y a o一y t n g Z H A O J i n g 一x i a n，WA N G T o n g ( T h e K e y L a b o r a t o r y of M in i s t r y of E d u c a t io n f o r T is s u e T r a n sp la n t a t io n 国家自 然科学青年基金资助项目 ( N o . 3 0 5 0 0 4 6 6 ) 通讯作者T e l : 0 2 0 一 8 5 2 2 6 2 1 9 ; E 一 m a i l : t z e n g y y 00 加 . e d u . c n t i c s m e n t i o n e d a b o v e c o n t r i b u t e t o p re v e n t p a t h o l o g i c a l i n fl a m m a t i o n s a n d m a i n t a i n t o l e r a n c e t o e n t e r i c a n t i g e n s s u c h a s f o o d p ro t e i n s a n d c o m m e n s a l b a c t e r ia b u t s i m u l t a n e o u s ly r e ta in p ro p e r im m u n e r e s p o n s e s t o p a t h o g e n ic m i c ro b e s . K E YW O R D S P e y e r ' s p a t c h e s ; T 一 ly m p h o c y t e s ; 切 m p h o c y te t r a n s f o r m a t i o n ; M i c e 肠粘膜免疫系统由于其独特的生理解剖位置而 要接触更多的抗原 。因 此， 区分开人侵病原微生 物和无害的食物及共生菌抗原成为肠粘膜免疫系统 的 特殊而繁重的 任务。 肠相关淋巴 组织( g u t 一 a s s o c i - a te d ly m p h o id tis s u e , G A L T ) 是由 特化的 聚 集的 淋巴 组 织和广泛分散的淋巴细胞组成 2 ,3 1 。聚集的淋巴样 组织包括: 派氏 集合淋巴结 ( P e y e r ' s p a t c h e s , P P s ) , 肠系 膜淋巴 结( m e s e n t e r i c l y m p h n o d e s , M L N s ) 及一些 小的分散的淋巴样滤泡， 由于这些组织和细胞参与 免疫应答的启动或耐受的诱导， 所以被称为“ 诱导” 部位( “ i n d u c t i v e “ s i t e s ) ; 散在的免疫细胞包括: 位于 粘膜固有层的淋巴细胞以及镶嵌在肠粘膜上皮细胞 之间的 淋巴 细胞( i n t r a e p i t h e l i a l l y m p h o c y t e , I E L ) ， 因为 它们负责免疫应答效应者功能的实施， 因此被称为 “ 效应者” 部位( “ e ff e c t o r “ s i t e s ) 。肠道中正常的适应 性免疫应答在很大程度上依赖于 P P S 和 M L N s 中的 C D 4 十 T 细胞( h e l p T c e ll s , T h ) 。如图7 所示， P P S 是 沿着小肠纵向分布的位于粘膜下的微小淋巴样组 织。成熟的P P S 是由面积较大的B 细胞滤泡区、 镶 嵌于滤泡区 外的 胸腺依赖区( t h y m u s 一 d e p e n d e n t a r e a , T D A ) 以及直接位于肠上皮下的被称为上皮下弯隆结 构( s u b e p i t h e l i a l d o m e , S E D ) 组成。 P P S 与肠腔只有被 称为滤泡相关上皮( fo ll ic le 一 a s s o c ia te d e p ith e liu m , F A E ) 的单细胞层相隔。F A E的最大特征是镶嵌有M 细胞。M细胞从肠细胞分化而成， 具有抓取病原微 生物的能力。传统的理论认为肠免疫应答的独特性 反映在它对作为免疫应答的诱导部位的P P S 的绝对 依赖上。近年的发现正在挑战上述传统概念 4 ,5 1 0 正是基于此原因， 我们对小鼠P P s 来源的C D 4 十 T 细 胞的活化和调节性 T 细胞进行了研究。 材料和方法 1 材料 清洁级B A I .B / c J ( H一 2 砂， I 一 A d ， 以下简写为 B A L B / c ) 近交系小鼠， 雄性、 1 2 周龄， 体重( 2 3 士 2 ) 9 ， 购自 广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白A ( C o n A ) , P D B ( P h o r b o l 1 2 , 1 3 - d i b u t y r a t e ) , L 一 谷氨酞胺、 p 一 二琉基乙 醇均购自 美国S ig m a 公司 。 I o n o m y c in ( 简称I o n ) 购自 美国C a lb i o c h e m公司。R P M I 一 1 6 4 0 , 胎牛血清( f e t a l c a l f s e ru m , F C S) 购自美国 G i b c o - B R L 公司。 抗小鼠C D 3 一 P E ( p h y c o e r y t h r in ) , C D 6 9 - F I T C ( fl u o r e s c e in i s o t h i o c y a n a t e ) 、 C D 3 一 A P C ( a l l o p h y c o - c y a n in ) , C D 4 一 P E 一 C y 5 和C D 2 5 一 F T I 'C 单克隆抗体 ( m o n o c l o n a l a n t i b o d y , m A b ) 购自 美国B D - P h a r M i n g e n 公司。F A C S C a l i b u r 流式细胞仪， 为美国B e c t o n D i c k - in s o n 公司产品。 2 方法 2 . 1 淋巴细胞悬液的制备将 B A L B / c J 小鼠断髓 处死， 无菌分离 P P s , M L N s 和腹股沟引流淋巴结( i n - g u i n a l l y m p h n o d e s , I L N s ) ， 分别置于3 个盛有预冷 P B S 的无菌平皿中， 去掉被膜， 于4 0 0目 筛网过滤除 去细胞团块， 收集细胞， 制备单细胞悬液， 用冷P B S 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) 洗涤细胞2 次， 弃上清。 然后用 含1 0 % 胎牛血清、 5 x 1 0 一 “ m o l/ L 二琉基乙 醇, 6 0 m g / L 卡那霉素的R P M I 一 1 6 4 0 完全培养基重悬细胞并调 整细胞浓度为4 x 1 0 9 c e l l s / L o 2 . 2 3色免疫荧光标记结合流式细胞仪检测及分 析淋巴细胞组成 从上述新鲜制备的单细胞悬液中 各取出1 x 1 护个细胞进行 3 色荧光标记， 加人抗小 鼠C D 3 一 A P C , C D 4 一 P E 一 C y 5 和C D 2 5 一 F 1 T C 单克隆 抗体1 f g ， 混匀后4 避 光作用3 0 m i n 。以P B S 离心 洗涤细胞1 次， 重悬于3 0 0 匹的P B S 中， 立即 上机检 测。全部数据经 F A C S C a l i b u r 流式细胞仪和 C E L - L Q u e s t 软件获取。 F I T C 为荧光1 ( F L l ) ， P E 一 C y 5 为 荧光2 ( F L 2 ) , A P C 为荧光4 ( F I 4 ) ， 先在前散射( F S C ) 对侧散射( S S C ) 二维散点图中划出淋巴细胞区R 1 , 在F I A对S S C中划出C D 3 十 细胞区R 2 ， 然后在F L 3 对 S S C中划出C D 4 十 细胞区R 3 ， 再在F L l 对F 1 3的散点 图中划出 C D 4 - C D 2 5 一 、 C D 4 - C D 2 5 十 、 C D 4 + C D 2 5 + 和 C D 4 十 C D 2 5 - 4 个象限， 该散点图的细胞群来自R 1 x R 2 x R 3区的细胞， 即 C D 4 + T细胞群， 对 C D 4 + C D 2 5 + 区和 C D 4 十 C D 2 5 一 区细胞群进行荧光强度检测， 用 C D 4 + C D 2 5 + / C D 4 十 C D 2 5 + + C D 4 + C D 2 5 ， 即获得调 节性 T 细胞占C D 4 + T 细胞的比例。同样的方法来 检测并分析派氏集合淋巴结， 肠系膜淋巴结和腹股 沟引流淋巴结中C D 3 + 淋巴细胞占总细胞的比例， 以 及C D 4 + T 细胞占总T 细胞的比例。每管样品检测 2 0 0 0 ( 个细胞， 获得的数据用C E L I 习 u e s t 软件分析。 2 . 3 刺激淋巴细胞活化及 T细胞活化率的检测和 分析将上2 . 1 中调整好细胞浓度的淋巴细胞接种 于9 6 孔培养板， 分别设置单纯佛波醇醋类多克隆刺 激剂P D B ( 终浓度2 x 1 0 - ' m o U L ) 组、 佛波醇醋类多 全部淋 巴细胞的 6 1 . 5 9 % 土8 . 7 3 %和 6 4 . 5 9 % 士 6 . 9 8 %， 然而， 就 C D 4 + T 细胞占全部 C D 3 + T细胞的 比 例而言， P P s , M L N s 和I L N s 之间没有明显差别， 分 别为 7 6 . 4 2 %土 4 . 4 0 %、 7 3 . 4 0 %土6 . 2 3 %和 7 3 . 7 4 % 土 5 . 7 5 %. P P s 来源的C D 4 十 C D 2 5 + 调节性T 细胞的 比例明显高于M L N s 和 I L N s 。如图3 所示， P P S 来源 的C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T细胞占 C D 4 十 T细胞的 1 3 . 6 0 % 1 2 . 0 7 %， 而 M L N s和 I L N s 来源的 C D 4 十 C D 2 5 + 调节性T 细胞分别占C D 4 + T 细胞的6 . 9 2 %士 1 . 0 8 %和7 . 8 1 %士 0 . 9 1 %。 2 P P s , ML N s 和I L N s 来源的T细胞体外活化分析 结果 在没有加人刺激剂的培养条件下， P P S 来源的 C D 3 + T细胞 C D 6 9的表达水平明显高于 M L N s 和 I L N s 来源的C D 3 + T 细胞， M L N s 来源的C D 3 + T 细胞 C D 6 9 的表达水平明显高于 I L N s 来源的 C D 3 + T细 胞。如图5 所示， P P s , M L N s 和 I L N s 来源的T 细胞在 没有加人刺激剂的培养条件下， C D 3 + C D 6 9 + T 细胞/ C D 3 十 T细胞的百分比分别为 2 3 . 1 8 % 1 4 . 1 0 %, 1 4 . 6 6 %士 2 . 1 0 %和 1 1 . 2 1 %土 0 . 5 9 %。这表明P P s 来源的T 细胞体内 基础活化率高于M L N s 和I L N s 来 源的T 细胞， 而且M I N s 来源的T 细胞体内活化率又 高于I L N s 来源的T 细胞。 C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n T c e l l p o p u l a t i o n s f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s 1 P P s , ML N s 和I L N s 来源的T细胞亚群比较性分 析结果 免疫表型分析结果表明， 在P P S 内C D 3 十 T 细胞 所占比 例明显低于M L N s 和I L N s ， 如图I 所示， P P S 来 源的C D 3 + T细胞只占全部淋巴细胞的 1 9 . 9 9 %士 1 . 4 6 %， 而M L N s 和I L N s 来源的C D 3 十 T 细胞分别占 岁万-吕冶签司lu。d 克隆刺激剂P D B ( 终浓度2 x 1 0 - 7 m o l / L ) + 钙离子转 运 剂I o n ( 终 浓度0 . 5 m g / L ) 组、 植物血凝素 类多克隆 刺激剂C o n A ( 终浓度1 0 m g / L ) 组和P B S 对照组， 并 分别设置复孔， 定容2 0 0 P L / w e l l 。 在3 7 c C , 5 %C 仇 条件下培养1 2 h 。 取出培养细胞， 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) ， 收集培养上清于 E P管中用来检测细胞因子。 细胞经P B S 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) 洗涤2 次后， 重悬于 5 0 匹 的P B S 中， 进行双色免疫荧光标记， 加人抗 C D 3 一 P E 和抗C D 6 9 一 F 17 单克隆抗体 1 l g / 1 0 6 c e l l s , 混匀后4 避光作用3 0 m i n 。以P B S 离心洗涤 细 胞1 次， 重悬于3 0 0 .L 的P B S 中， 立即上机检测。 全部数据经F A C S C a l i b u : 流式细胞仪和C E L L Q u e s t 软 件获取。F P l 为荧光 1 ( F L l ) ， P E 为荧光2 ( F L 2 ) ， 先 在前散射( F S C ) 对侧散射( S S C ) 二维散点图中划出淋 巴细胞区R 1 ， 然后在F L 2 对S S C中划出C D 3 + 细胞区。 R 2 ， 再在 F L 1 对 F L 2的散点图中划出 C D 3 - C D 6 9 - , C D 3 - C D 6 9 十 、 C D 3 + C D 6 9 + 和 C D 3 + C D 6 9 - 4 个象限， 该散点图的细胞群来自R l x R 2 区的细胞， 即T 细胞 群， 对C D 3 + C D 6 9 十 区和C D 3 + C D 6 9 一 区细胞群进行荧 光强度检测， 用 C D 3 十 C D 6 9 + / C D 3 十 C D 6 9 +C D 3 + C D 6 9， 即获得 T细胞的活化率。每管样品检测 1 0 0 0 0 个细胞， 获得的 数据用C E L .L Q u e s t 软件分析。 3 统计学处理 获得的结果用均数 士 标准差( z 土、 ) 表示， n 为 样本量。 统计作图软件用 M i c ro s o f t E x c e l 。统计方法 用 ( ) n e 一 w a y t t e s t , 结果 P P ML N I L N F i g 1 C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n T c e ll p o p u l a t i o n s f r o m P P s , M L N s a n d I L N s . z 1 s . n=5 . * P0 . 0 1 v s M L N, I L IV ，r e - s p e c t i v e l y . 图1 不同来源的 T细胞亚群占总淋巴细胞比例的比较 B C nU H-门司山 工·拍rl吸 + ; a 'A 1 8 . 5 8 % 月渗一 . 自l ik - ，几 当 愉 4 9 21 % 侧渗 1 础 必 靛 孤 护 翔嗯曦 1 0 1 0 1 0 ' t o , 护 .价 6 7 .9 6 % 穷 翔 臼 愁 ik:毒几 了丁了口护 ，1，.且1.，.且 工，州曰山. 价热神目d·己U F L4 - HF L 4 - HF 1 , 4 - H CD3 - AP C F ig 2 F lo w c y to m e t r i c a n a l y s e s o f r a ti o o f C D 3 + T c e ll s t o t o t a l l y m p h o c y te s f r o m d iff e r e n t a n a to m ic a l s i t e s ( g ro u p A : P e y e r ' s p a t c h e s ; g r o u p B : m e s e n t e r i c l y m p h n o d e s ; g r o u p C : i n 加n a l ly m p h n o d e s ) ( t a k e o n e o f e x p e r i m e n ts f o r e x a m p l e ) . 图2 流式细胞术分析不同来源的C D 3 十 T细胞占总淋巴细胞的比例( 以其中1 次实验为例) · 5 4 0 · 如图5 所示， 在加人T 细胞多克隆刺激剂 C o n A 的培养条件下， P P S 来源的C D 3 + T 细胞C D 6 9 的表达 水平明显低于M L N s 和 I L N s 来源的C D 3 十 T细胞， C D 3 十 C D 6 9 + T细胞/ C D 3 + T细胞的百分比分别为 8 0 . 0 1 % 士2 . 9 9 %、 9 1 . 2 5 % 士1 . 1 5 %和 8 8 . 2 3 % 士 2 . 8 7 %。加人蛋白激酶 C活化剂 P D B培养后 C D 6 9 表达的清 况与C o n A相似， C D 3 十 C D 6 9 + T 细胞/ C D 3 + T 细胞的百分比分别为8 9 . 6 0 %士 2 . 0 9 %, 9 6 . 0 5 %士 2 . 0 8 %和9 7 . 8 4 % 1 1 . 5 8 %。这表明P P S 来源的T 细 胞内 活化信息传递存在缺陷或者培养系统中 存在抑 制性因素， 如调节性T 细胞、 抑制性细胞因子等。然 而， 同时加人P D B 和I o n 时， P P s , M L N s 和I L N s 来源 C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n r e g u l a t o r y T c e l l s f r o m n入广匀4，10只U420 .1.目.1. P P ML N I L N C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n r a t i o o f C D 4 + C D 2 5 + T r e g t o C D 4 十 T c e l l s f ro m P P s , M L N s a n d I L N s . x 1 s .n 二 5 . * P 0 . 0 1 v s M L N s a n d I L N s g r o u p s , r e s p e c t iv e l y . 不同来源的调节性 T细胞占C M 十 T细胞比例的比较 月一。1啼自习认闪口口1寸0口JO。韶国33 g| F比口 0000000 642 工-Q的叻 000000 U4今 工-口55 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 8 0 0 1 0 0 0 8 0 0 R1 石翻于 工·口55 8 0 01 0 0 0 1 0 01 口1 0 4 照到国口一习 1 0 1 1 0 1 1 0 ' 1 0 ' 1 0 4 F L 4 - H E 1 0 4 1 0 ' 1 0 - 1 0 , 1 0 0 F L3 - H F H，一曰踢 8 . 3 2 % 一食 一爹 9 . 5 3 % 谢 ， 祥 - 少丁少以00 工二闷妈 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 F S C- H D 1 4 . 5 6 % 二 墓. 一犷 少了少口00 f.Lll1，1，.卫 口。一闷吸 口卜一妈1妈闪0口 1 0 0 1 0 ' 1 0 2 1 0 ' 1 0 4 1 0 “ 1 0 ' F L 3 - H 1 0 “ 1 0 ' 1 0 4 F L3 - H 1 0 0 1 0 ' 1 任1 0 ' 1 0 4 F L 3 - H C D 4 - P E - C y 5 F lo w c y t o m e t r i c a n a l y s e s o f r a t i o o f C D 4 ' C D 2 5 十 T r e g t o C D 4 ' T c e l l s fr o m d i ff e re n t a n a t o m i c a l s i t e s ( g ro u p A a n d D : P e y e r ' s p a t c h - e s ; g ro u p B a n d E : m e s e n te ri c l y m p h n o d e s ; g ro u p C a n d F : in g u in a l ly m p h n o d e s ) ( ta k e o n e o f 流式细胞术分析不同来源的T 细胞中C 1 ” 十 C D 2 5 + T i n占C D 4 十 T 细胞的比 例( 以其中1 n t s f o r e x a m p l e ) 次实验为例) 44 Fis图 的C D 3 + C D 6 9 十 T 细胞/ C D 3 十 T 细胞的百分比分别为 9 4 . 3 7 % 土1 . 2 0 %、 9 8 . 6 4 % 士0 . 6 1 %和 9 9 . 1 3 % 士 0 . 5 3 %。 这表明P P S 来源的T 细胞的低反应性被纠 正 。 讨论 C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n a c t i v a t i o n o f T c e l l s f r o md i ffe r e n ta n a t o mi c a l s i t e s 必-。1卜自口而自口办gG口JO。苟国 与皮肤免疫系统相比， 肠道粘膜系统要接触更 多的更复杂的抗原， 而且它还必须十分清楚地区分 哪些是有害的抗原( 例如入侵微生物) ， 哪些是无害 的抗原( 例如食物抗原和肠道共生菌) ， 以便作出合 适的免疫应答以清除有害的抗原或者形成免疫耐受 来保护机体免受损伤和避免不必要的资源浪费。因 此， 肠道粘膜免疫系统有必要同时进化出两套免疫 防御机制， 一套针对有害抗原的免疫应答的机制， 另 d i ff e ren t a n a t o mi c a l s i t e s u n d e r d i ff e ren t c u l t u re c o n d i t i o n s . x 士， .n=5 .尸 # 尸0 . 0 1 v s I L N s ; 0 . 0 1 v s M I L N s a n d I L N s , re s p e c t i v e l y ; # # 尸 0 . 0 1 v s P D B十I o n i n P P - . 不同来源的T细胞在不同培养条件下其 C D 6 9 表达水 平的比较 55 g| F比口 ·5 4 1 F i g 6 F lo w c y t o m e t r ic a n a l y s e s o f l e v e l o f C D 6 9 e x p re s s e d b y C D 3 + T c e ll s f ro m d iff e r e n t a n a to m ic a l s it e s ( g ro u p A : P e y e r ' s p a t c h e s ; g r o u p B : m e s e n t e r i c l y m p h n o d e s ; gr o u p C : in g u i n a l ly m p h n o d e s ) u n d e r d iff e re n t c u l t u re c o n d i t io n s ( ta k e o n e o f e x p e r im e n t s f o r e x a m p l e ) . 图6 流式细胞术分析不同来源的T细胞在不同 培养条件下其CM 表达水平( 以其中1 次实验为例) F ig 7 S c h e m a t ic d ia g r a m f o r t h e h y p o t h e s is o f “ P P s b e in g s p e c ific im m u n o 一 s e n s o r . 图7 “ P P s 是特殊的免疫传感器假说” 示意图 一套为针对无害抗原的形成免疫耐受的机制。根据 G A L T 的解剖结构及其功能研究， 我们提出“ P P S 是特 殊的免疫传感器假说，(图7 ) 。这一假说认为: 在肠 道同时存在有害抗原和无害抗原的情况下， P P S 能通 过其特殊的结构和细胞组分清楚地区分有害抗原和 无害抗原， 由于 P P S 内T 细胞的低反应性的特征而 “ 钝化” 了对无害抗原的应答， 与此同时由于M细胞 能结合侵袭性病原体并把完整的抗原转交给树突状 细胞的特性而“ 锐化” 了对有害抗原的应答， 从而能 够正确引发正性免疫应答( a c t iv e i m m u n i ty ) 或者负性 免疫应答( t o l e r a n c e ) 。本实验结果支持了我们的假 说。P P S 内C D 3 十 T 细胞所占比例较低， 从而导致在 特定范围内活化T 细胞数目 相对少， 分泌细胞因子 减少， “ 旁观者效应” 较弱， 从而可能使得整体T 细胞 反应水平降低， 这是“ 钝化” 了对无害抗原的应答的 机制之一。P P S 内高比例 C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞 的存在可能是 P P S 的整体 T细胞的低反应性的机制 ·5 4 2 · 之二， 毋容置疑的是， 调节性 T 细胞能够通过对传统 性T 细 胞的 过度应答产生抑制 作用6 l ， 从而进一步 “ 钝化” 了 P P S 内 T 细胞对无害抗原的应答。P P S 来 源的T 细胞的高基础活化率可能与其不断接触小肠 来源的食物和共生菌抗原有关， 已知， 这种活化能够 通过活化诱导凋亡( a c t i v a t i o n一i n d u c e d c e l l d e a t h , A I C D ) 的机制把抗原特异性T 细胞删除， 从而形成对 食物和共生菌抗原的耐受; 本结果表明P P s 来源的T 细胞选择性地对某些刺激剂表现出低反应性， 提示 这群细胞处于某种程度的“ 无能” 状态， 此结果与其 他 学者 从另外的角度进行的 研究 7 ,8 所得出的结果 相吻合; 而T 细胞“ 无能” 连同“ 免疫抑制” 和“ 删除” 构成了免疫耐受形成的3 大机制。上述特征的生物 学意义在于避免因为不断接受小肠来源的食物和共 生菌抗原的刺激而发生病理性炎症反应的同时却保 留对病原微生物抗原的应答。 另外， 本研究中还检测了3 种培养条件下， P P S , M L N s 和I L N s 来源的淋巴细胞培养上清中5 种细胞 因子( I F N一 y , T N F 一 a , I L 一 2 , I L 一 4 和 I L 一1 0 ) 的分 泌量( 结果中没有显示) 。研究中发现派氏结来源的 淋巴细胞上述5 种细胞因子的分泌量都明显低于其 它两处来源的淋巴细胞。这是 P P S 中的淋巴细胞在 生理条件下处于“ 无能” 状态的又一重要依据。 传统的理论认为肠免疫应答的独特性反映在它 对作为免疫应答的诱导部位的P P S 的绝对依赖上。 近年的发现却有悖于上述传统概念， 这些发现认为: 口 服耐受的形成对 P I 、的依赖并非是绝对的。然而 这些观点都是通过遗传或发育阻断手段建立的P P S 缺陷的 动物模型所得出的推论 ” 一 2 1 ， 所以缺乏生理 性， 这些干预所产生的小鼠模型在很大的范围内影 响了整个免疫网络， 其推理的合理性值得怀疑。而 且近年仍然有大量的证据表明建立口服耐受对 P P S 的 依赖性 4 ,5 1 。总之， 现有的 证据并不能动摇传统的 理 论。 而 我 们 认为， P P S 因 其相当 复 杂的 结构和 其直 接位于肠粘膜上皮下的特殊的解剖位置， 形成了肠 粘膜免疫系统与肠腔复杂抗原环境的界面， 从进化 的角度来看， 这种特殊的结构应该是肠腔中复杂的 抗原环境压力推动下进化的结果， 其功能将随着研 究的深人而得以揭示。如果只根据P P S 的缺如仍能 成功诱导口 服耐受来否定 P P S 其它可能存在的尚且 还不为人知的精细的和特殊的功能是不合理的。 P P S 中的M细胞在控制肠腔内的微生物及生物大分 子进人其下的淋巴样组织引发适当的免疫应答中起 到了 非常重要的 作用 1 3 1 ， 但由 于M细胞缺乏标记物 且数量极少， 要对其进行更深人的研究还有很大的 困 难。然而对 P P s 中M细胞结构和功能的了解， 将 有助于我们进一步了解 P P S 的特殊功能， 有助于我 们对“ 锐化” 机制的阐明， 进而有助于验证我们提出 的“ P P S 是特殊的免疫传感器假说” 。 参考文 献 t 曾耀英， 肇静娴. H I V病发病学新概念: 肠淋巴组织主 要病灶论 J . 中国病理生理杂志， 2 0 0 5 , 2 1 ( 3 ) : 6 0 7 - 6 1 3. 2 M o w a t A M . A n a t o m ic a l b a s i s o f t o l e r a n c e a n d i m m u n it y i n - te s t i n a l a n t ig e n s J . N a t u r e R e v I m m u n o l , 2 0 0 3 ， 3 ( 4 ) : 3 3 1 一3 4 1 . 3 N e w b e r ry R D , L o re n z R G . O r g a n iz in g a m u c o s a l d e f e n s e J . I m m u n o l R e v , 2 0 0 5 ， 2 0 6 ( 8 ) : 6 一 2 1 . 4 S p a h n T W , F o n t a n a A , F a r ia A M C , e t a . I n d u c t i o n o f o r a l t o l e r a n c e t o c e l l u l a r i m m u n e re s p o n s e s i n t h e a b s e n c e o f P e y - e r ' s p a t c h e s J . E u r J I m m u n o l ， 2 0 0 1 ， 3 1 ( 4 ) : 1 2 7 8 - 1 2 8 7. 5 S p a h n T W , W e i n e r H L , R e n n e r t P , e t a l . M e s e n te r ic l y m p h n o d e s a re c r i t i c a l f o r t h e i n d u c t i o n o f h i g h 一 d o s e o r