晶体上皮细胞体外培养及转化的研究.pdf

·5 4 匹西匡蕴婴螋主! 旦蔓笪鲞笙! 塑i g 篮X i 丛趟i 尘! ! 四d J 垫2 Q 鲤，y ! ! ：丝，盟Q 1 3 1 1 ) m m H g ，末次随访( 1 5 8 5 ±4 1 7 ) m m H g 。其中1 只 眼术后眼压持续不降在随访末4 只眼需加用1 2 两种抗青光眼药物后控制眼压。 2 2 术后视力最佳矫正视力提高超过1 行以上的 5 眼视力无改变4 眼，降低超过1 行3 眼。2 眼为婴 幼儿视力检查无法进行。 2 3 并发症及处理术后前房形成迟缓6 眼其中 脉络膜脱离4 眼，予以局部加压包扎及静脉点滴糖 皮质激素、甘露醇后前房形成：2 眼为人工晶体眼在 予以后囊N d ：Y A G 激光切开后前房形成。引流管口 虹膜组织堵塞l 眼经N d ：Y A G 激光切除后改善。角 膜失代偿1 眼麻痹性内斜视伴有复视( 术后3 个 月) 1 眼。 3 讨论 难治性青光眼属服科领域最为棘手的问题包 括新生血管性青光眼、无晶体或人工晶体眼、炎症性 青光眼、虹膜角膜内皮综合征、上皮植人继发性青光 眼、角膜移植术后或视网膜玻璃体术后继发青光眼、 角膜缘周围结膜广泛瘢痕形成的青光眼、多次小梁 手术失败以及长期依赖佩戴接触镜的青光跟患者。 房水引流物植入术已经被成功地应用于难治性青光 眼的治疗。A h m e d 青光眼房水引流阀由一8 i l a s t i c 管 联结于椭圆形聚丙烯板所组成聚丙烯板的前表面 积为1 8 4 m m 2 ( 1 3 I T I m x l 6 m m ) 阀f - j 由两片对压力敏 感的对向放置的s i l a s t i c 膜组成当眼压为8 。 1 2 m m H g 时阀门开放并允许房水外流。前房形成迟 缓、低眼压为A h r e e d 引流阀植入术后早期主要并发 症占5 8 。1 0 8 m 。它通常南是于管周渗漏和房水 引流过畅所致多见于穿刺口径过大或连作两次穿 刺。由于低眼压进而致使脉络膜脱离、脉络膜上腔出 血和睫状体炎性水肿 4 1 。有报道称低眼压及相关并发 症在儿童青光眼中的发生率达1 1 2 3 m 。术后早 期另一主要并发症是引流管堵塞其原因通常有凝 血块、玻璃体、虹膜组织、纤维渗出物，根据具体情况 可采用前房冲洗、玻璃体切割、眼前节激光甚至管腔 内注入t - P A 和引流管冲洗探通术。角膜失代偿的原 因常为术前患眼接受过多次手术f 角膜内皮已存在 损害) 术后长期前房迟缓形成引流管与角膜内皮接 触持续的前葡萄膜炎症反应。本组发生l 例麻痹性 斜视复视考虑为术后筋膜囊与眼肌周围组织过度炎 症反应组织增生。导致局部瘢痕组织挛缩，影响眼外 肌的运动而引起斜视及复视。本组1 例新生血管性 青光眼术后眼压持续不降可能与管内段阻塞有关。 临床实践证明A h m e d 引流阀植入术可作为对难 治性青光眼治疗的一种有效手段。 参考文献 1 1 叶天才王宁利1 临床青光眼图谱人民卫生出版社2 0 0 7 4 6 2 1 2 l 叶兴桥刘恒明难治性青光眼治疗的研究进展中国实用眼科杂 志，2 0 0 7 ，2 5 ( 1 2 ) ：1 2 7 5 3 1 杨侠董晓光A h m e d 青光眼阀治疗难治性青光眼的作用和现状 国际眼科杂忐，2 0 0 5 。5 ( 5 ) ：9 9 4 【4 】孟娜，任百超青光眼房水引流装置的研究进展国际眼科杂志， 2 0 0 5 ，5 ( 4 ) ：7 1 5 ( 收稿日期2 0 0 8 1 0 一2 7 ) 晶体上皮细胞体外培养及转化的研究 刘玉姬俞方良 摘要】目的探讨晶体上皮细胞体外培养的方法及其转化的牛物特性。方法取家兔晶体前囊膜经胰酶 消化后，行过滤离心，获取分散的晶体上皮细胞，进行体外培养并传代，观察其生长转化。结果晶体上皮细 胞经体外培养能够生长、繁殖并传代，第三代后出现转化。结论晶体上皮细胞体外生长良好，并二代后以 作为晶体上皮细胞进行其生物特性的研究。 【关键词】晶体上皮细胞；培养 中图分类号1R 一3 3 2 晶体纤维是南前囊下上皮细胞不断生长、分化 而形成的它同白内障韵发生、发展密切相关。我们 通过对晶体上皮细胞体外培养，运用免疫组化技术， 研究其生长、繁殖、转化等生物特性。 1 材料和方法 1 1 材料晶体取自家兔，由南昌大学医学院动物 部提供；波形蛋白( v i m e n t i n ) 、角蛋白( k e r a t i n ) 单克 隆抗体为美国D a k o 公司产品。小牛血清由华美生 作者单位；3 3 4 6 0 0 广丰，江西省广丰县人民医院眼科( 刘玉姬) ；2 3 3 0 0 0 8 南昌，江西省南昌市第一医院眼科( 俞方良) 万方数据 逗酉医蕴2 Q 鲤生l 旦笠坐鲞塑! 塑i B 骘堑丛4 超堂! H 盟! ! 塑! Q 塑，y ! ! 丝，塑! ：! 5 5 - 物工程公司上海分公司提供。 1 。2 方法将家兔空气检塞致死无菌摘除眼球取 出晶体撕下晶体前囊膜，浸于0 2 5 胰蛋白酶中 4 0 c 条件下消化1 2 h 然后转于3 7 孵育3 0 m J n ，经吸 管吹打致使细胞分离、过滤以每分钟2 0 0 0 转离心 5 m i n 去除上清液后为晶体上皮细胞。往获取的晶体 上皮细胞中加入D M E M 培养基( 其中含有1 0 t b 牛 血清青霉素1 0 0 u m l ，庆大霉素1 0 0 u m l ，使成为细 胞密度为2 x 1 0 6 细胞m 1 ) 中，置3 7 0 C ，5 C 0 2 饱和湿 度的C 0 2 孵箱中培养。一周后每3 d 更换一次培养 基培养2 周后进行消化、传代。 1 3 免疫组织化学检查分别取不同时期培养的晶 体上皮细胞，细胞悬液涂在玻片上一2 0 0 C 保存。经蒸 馏水及P B S 漂洗后用0 1 3 过氧化氢一甲醇 3 0 m i n 以清除内源性过氧化物酶置微波炉加热 1 0 m i n 温度保持在9 2 9 8 。冷却后加小牛血清( 1 ： 5 0 ) 封闭室温孵育1 0 m i n ，加入I 抗( 鼠抗人) 4 。C 过 夜加生物素标记的抗( 免抗鼠) 水浴3 7 ，3 0 r a i n 。 ( 抗体为波形蛋白、角蛋白单克隆抗体) 。加L S A B ， 水浴3 7 ，3 0 m i n D A B 显色，苏木素复染，脱水、透 明、封片。阳性判定标准：以胞浆内出现黄色或棕黄 色颗粒为阳性反应。所有细胞均无染色反应为阴性 【1 J 。同时对不同时期的晶体上皮细胞进行瑞氏染色。 2 结果 2 1 倒置显微镜下形态学观察贴壁前的晶体上皮 细胞呈大小不一的圆形或椭圆形。2 4 h 后开始贴壁。 7 2 h 细胞完全贴壁贴壁后的晶体上皮细胞呈不规 则形或梭形为主形成数个小集落细胞生长繁殖从 各个小集落向四周呈星状延伸2 周后增殖细胞相 互汇合成片。细胞消化、传代，可见细胞恢复到圆形 或椭圆形。第3 周后可见见部分细胞胞体为肥大的 不规则形。瑞氏染色后可见双核或多核细胞。 2 2 免疫组代染色原代及第一、二代晶体上皮细 胞用角蛋白单克隆抗体进行免疫组化所有细胞胞 浆内可见粗大的黄色或淡黄色颗色而对波形蛋白 单抗免疫标记呈阴性：第三代培养的晶体上皮细胞 用波形蛋白进行免疫标记部分细胞其胞浆出现了 黄色或淡黄色颗粒，而大部分细胞仍对角蛋白抗体 标记呈阳性，随着传代的增加，与波形蛋白抗体结合 的细胞越多。 3 讨论 3 1 自V a n | 9 5 9 年培养成功动物晶体上皮细胞 H a m a c l1 9 7 8 年培养成功人晶体上皮细胞为探讨 白内障的发生白内障摘除术后后囊混浊的形成机 理和预防方法。目前研究主要在晶体上皮细胞的增 殖、移行、分化、分泌以及影响其存活的各因素等各 个方面f 2 。本研究在细胞培养技术方面。采用对剥离 的晶体囊膜进行消化经过滤、离心之后以获得分散 的晶体上皮细胞悬液克服晶体囊膜不易贴壁和实 验操作上的困难。 在培养中，观察到细胞自然形成数个集落，说明 细胞在体外繁殖不仅需要生存所必须的营养物质， 还依赖细胞之间的相互作用即晶体上皮细胞在体 外能存活需不断从邻近的其他同种类型细胞上获 取某种因子。M c A y o v 在无血清培养基中，如细胞的 密度较低时即使加入一种或多种生长因子，将出现 细胞的凋亡。当在培养基中加入S r u u r o s p o r i n e ( - - 种 蛋白酶抑制剂) 。它能抑制细胞间的这种信号通路， 即使细胞的密度很高，也将出现细胞的凋亡 3 1 。 3 2 细胞在体外的分化除在显微镜下观察其形成 的变化外我们采用免疫组织化学技术用角蛋白和 波形蛋白单克隆抗体分别对培养不同时期的晶体 上皮细胞进行免疫酶标记。细胞角蛋白是一组分子 量4 0 6 7 k d 的中间微丝细胞存在角蛋白后般表示 其上皮性质。角蛋白单克隆抗体对鉴别上皮与间叶 细胞有较高的特异性。波形蛋白是一种分子量为 5 7 k d 的多肽是一种主要问充质来源细胞表达的中 间丝蛋白存在于怕有的间叶细胞中【4 】。晶体上皮细 胞一般在2 代内能保持上皮细胞的特性，第三代后 有部分细胞出现了分化胞体明显变大对波形蛋白 抗体呈阳性表示晶体上皮细胞部分随着传代的增 加开始发生分化。1 9 8 9 年C a p e t u n a k i 用鸡波形蛋 白基因建立转基恩鼠由于波形蛋白基因的过度表 达小鼠的晶体出现皮质性混浊且这种白内障出现 的鼠龄与波形蛋白表达的水平有关1 5 1 同时在正常人 晶体与白内障晶体的波形蛋白基因进行扩增后对比 分析两者的大小相近但后者的数量明显增大。表 明晶体上皮细胞发生转化与白内障形成密切相关旧。 要进行晶体上皮细胞特性的各项研究一般取前二 代的细胞。 参考文献 1 1 刘卡福袁佳琴。王德文等碱性成纤维细胞生长因子在人晶体上 皮细胞的蛋白检测的研究中国宴用眼科杂志，1 9 9 9 t 9 ( 7 ) ：4 3 0 2 1 李秋明晶体上皮细胞与后囊混浊国外医学眼科学分册，1 9 9 5 ，1 9 ( 6 ) ：3 2 1 1 3 1u W cda 1 L e n se p i t h e l i a lc e l la p o p l o s i sa p p e a r st ob eaC O I I U T I O l l c e l l u l a rb a s i s f o rn o n - - c o n g e n i t a lc a l a r a c td e v e l o p m e n ti nh u m a n sa n d 万方数据 ·5 6 · 匹耍匿煎2 Q 鲤生! 旦蔓坐堂蔓! 塑i §篮堑丛d i 堂幽丛箜2 Q 螋，Y Q ! ：丝，盟! ：! 阿维A 联合西咪替丁、潘生丁治疗扁平疣临床 疗效观察 黄丽萍 摘要】目的观察阿维A 联合西咪替丁、潘生丁口服治疗扁平疣的l 临床疗效及不良反应。方法将1 5 2 例扁平疣患者随机分为荫组。试验组8 2 例。口服阿维A 胶囊、西咪替丁片和潘生丁片外用0 1 维甲酸软 膏。对照组7 0 例，口服阿昔洛韦片和两眯替丁片，外用阿昔洛韦乳膏。两组疗程均2 个月。结果试验组有 效率7 4 3 6 对照组有效率3 3 3 3 。两组疗效差异无显著性( P O 0 5 ) 。结论阿维A 联合西咪替丁、潘生丁 口服治疗扁平疣有较好疗效值得临床推广和使用 【关键词】扁平疣；阿维A 胶囊；治疗 【中图分类号JR 7 5 2 5 2 扁平疣是皮肤科常见病外用药物疗程长见效 慢且易遗留色素沉着患者常难以坚持而放弃治疗。 我院于2 0 0 3 年1 2 月2 0 0 6 年1 2 月期间应用阿维 A 胶囊( 商品名：方希。重庆华邦制药股份有限公司 生产) 联合西咪替丁、潘生丁E l 服治疗1 5 2 例扁平疣 患者取得了较满意的疗效现将结果报告如下。 1 病例与方法 1 1 病例 1 1 。1 人选标准所有患者均符合临床诊断标准川。 皮损数目从数个至上百个不等，面部、双手背密集分 布浅褐色或正常肤色的扁平丘疹。米粒至绿豆大小。 圆形或多角形表面光滑，无自觉症状或偶有痒感。 排除标准：( 1 ) 有肝脏疾病、肾脏疾病、神经精神疾 病、高血脂、糖尿病及造血功能障碍者。( 2 ) 并发其他 皮肤病。( 3 ) 妊娠及哺乳期或者2 年内计划怀孕的女 性患者。( 4 ) 近2 个月内系统使用过免疫抑制剂、糖 皮制激素和阿维A 者。所有患者开始治疗前1 周停 用一切药物并查血、尿常规及肝、。肾功能均正常。 1 1 2 临床资料1 5 2 例扁平疣患者均为我院皮肤 科门诊就诊者，其中女9 6 例，男5 6 例；平均年龄 2 4 A 岁( 1 6 3 5 岁) ；平均病程5 3 年( 1 8 年) 。将1 5 2 例患者随机分为两组其中试验组8 2 例( 男3 5 例。 女4 7 例) 对照组7 0 例( 男2 6 例，女4 4 例) ，两组患 作者单位：3 3 1 1 0 0 丰城，江西省丰城市皮肤病医院 者年龄、病程经统计学分析差异无统计学意义。具有 可比性 1 2 方法 1 2 1 治疗方法试验组给予口服阿维A 胶囊 l O m g 每日1 次；西咪替丁2 0 0 r a g ，每日3 次；潘生 丁5 0 r a g 每日3 次；同时每晚外用0 1 维甲酸软 膏。用药1 个月后，停I = I 服西咪替丁、潘生丁，阿维A 胶囊减至隔E t1 次，1 次1 0 m g ，服药1 个月。对照组 给予口服阿昔洛韦片2 0 0 m g 。每日3 次：西咪替丁 2 0 0 r a g ，每日3 次：同时外用阿昔洛韦乳膏，每日2 次。连续服药2 个月。治疗结束后判定疗效并观察 不良反应。 1 1 2 疗效判定标准根据治疗前后皮损消退情况 进行疗效判定。痊愈：皮损消退 9 0 ，无新的皮攒 出现；显效：皮损消退6 0 8 9 。无新的皮损出现 仅遗留少量色素沉着；好转：皮损消退3 0 5 9 偶 有新的皮损出现：留少量色素沉着：无效：皮损消退 3 0 。仍有新的皮损出现；有效率= ( 痊愈例数+ 显效 例数) ，总病例数x i 0 0 。 1 1 3 统计学方法本试验数据采用四格表资料的 x z 检验及确切概率法。 ： 2 结果 2 1 治疗结果试验组中有4 例患者中途退出治疗 对照组中有1 例患者中途退出治疗最终试验组完 成观察7 8 例，对照组完成观察6 9 例。两组治疗结果 a n i m a h JC e l lB i d ，1 9 9 5 ，1 3 0 ( 1 ) ：1 6 9 1 4 陈瑞铭动物组织培养技术及其应用第1 版中国科学技术出版 社1 9 9 1 9 8 1 5 】C a p 曲¨岫Ye ta 1 o v e r 口p i o no ft h eV i m e n t i ng e n ei nt m I p g e n i cm l e ei n h i b i t sm 刊l e n sc e l ld i f f e r e n t i a t i o n JC e l lB i d ，1 9 8 9 ， 1 0 9 ：1 6 6 5 3 【6 l 李燕惠延年波形纤维蛋白基因在转基因小鼠晶体的M R N A 表 达及人白内障晶体的D N A 扩增中华眼穆杂志，1 9 9 5 ，1 0 ( 2 ) ：1 0 5 ( 收稿日期2 0 0 8 1 0 - 1 6 ) 万方数据