抑制细胞周期依赖性蛋白激酶5表达对C型尼曼皮克病小鼠的神经保护作用.pdf

堕皇煎丝壅瘟苤查! ! ! ! 生筮! ! 鲞筮! 塑 抑制细胞周期依赖性蛋白激酶一5 表达对C 型 尼曼一皮克病小鼠的神经保护作用 郝又国张曼徐金枝李俐娟 魏佳军王雪贞 摘要目的：观察抑制细胞周期依赖性蛋白激酶5 ( c d k 5 ) 的表达对C 型尼曼一皮克病( N P C ) 小鼠( n p c “一) 的治 疗作用。方法：采用携带c d k 5 特异性小干扰R N A ( e d k 5 s i R N A ) 的重组腺相关病毒r A A V c d k 5 - s i R N A - G F P ，对出生三 天内的n p c 。一小鼠进行双侧侧脑室注射，以r A A V G F P 注射组及非手术的同龄n p c 小鼠为对照( n = 6 1 0 组) ；采用 免疫组织化学染色、H E 染色和小鼠衣架悬挂试验来评价小鼠脑内的神经病理改变和运动功能。结果：r A A V 2 ·c d k 5 一s i R - N A G F P 能显著减少轴突球状体的数量，延缓浦肯野细胞的死亡并改善n p c 。一小鼠的运动功能。结论：降低e d k 5 的活 性对n p c 。一小鼠的神经元有一定的保护作用。 关键词C 型尼曼一皮克病细胞周期依赖性蛋白激酶5细胞骨架蛋白过度磷酸化小分子干扰R N A 重组腺 相关病毒 中图分类号：R 7 4 1 0 2 文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 3 5 1 ×( 2 0 0 8 ) 0 6 0 6 5 5 一0 4 T h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so fc y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e 一5 ( c d k 5 ) i n h i b i t i o ni n N i e m a n n - P i c kD i s e a s eT y p eCm i c e H A O Y o u g u o ，Z H A N GM i n ，X UJ i n z h i ，e ta t D e p a r t m e n to fn e u r o l o g y ，T o n g j iH o s p i t a l ，T o n g j iM e d i c a lC o l l e g e ，H u a z h o n gU n i v e r s i t yo f S c i e n c ea n dT e c h o l o g y ，W u h a n4 3 0 0 3 0 ，C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e ：T oi n v e s t i g a t et h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so fc y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e - 5 ( c d k 5 ) i n h i b i t i o n i nN i e - m a n n P i c kD i s e a s eT y p eC ( N P C ) m i c e ( n p e 一7 一) M e t h o d s ：R e c o m b i n a n ta d e n o - a s s o c i a t e dv i r u sc a r r y i n gt h es m a l li n t e r f e r i n g R N A ( s i R N A ) s p e c i f i cf o rc d k 5g e n ew a si n j e c t e di n t op o s t n a t a ld a y3n p c - ，一m i c ei n t r a c e r e b r o V e n t r i c u l a r l y ，t h er A A V ·G F P i n j e e t e da g e m a t c h e dn p c 一7 一m i c ea n dn o n s u r g e r ya g em a t c h e dn p c 一7 一m i c ew e r ee m p l o y e da sc o n t r o l ( n = 6 一l O g r o u p ) I m 。 m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，H Es t a i n i n ga n dm o u s ec o a th a n g e rt e s tw e r ea d o p t e dt oe v a l u a t et h en e u r o p a t h o l o g ya n dm o t o rf u n c t i o ni n n p c 一7 一m i c e R e s u l t s ：r A A V c d k 5 - s i R N A G F Ps i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h en u m b e ro fa x o n a ls p h e r o i d ，d e l a y e dP u r k i n j e n e u r o n d e a t h a n da m e l i o r a t e dm o t o rd e f e c t si nn p c 一。m i c e C o n c l u s i o n ：I n h i b i t i o no fc d k 5a c t i v i t yh a sn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to nn e u r o d e g e n e r a t i o ni nN P C K e yw o r d s N i e m a n n - P i c kD i s e a s eT y p eC C y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e - 5 ( c d k 5 )C y t o s k e l e t o nh y p e r p h o sp h o r y l a t i o n S i R N AR e c o m b i n a n ta d e n o a s s o c i a t e dv i r u s ( r A A V ) C 型N i e m a n n - P i c k 病( N i e m a n n - P i c kd i s e a s et y p e C ，N P C ) 是一种常染色体隐性遗传的神经变性疾病。 人类和小鼠N P C 神经元变性及脱失的机制目前仍不 清楚，有研究显示：细胞周期依赖性蛋白激酶( C y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e s ，C d k s ) 家族中e d k 5 、c d c 2 和c d k 4 的 激活或异位与本病的神经元死亡有着密切联系¨。1 。 本研究中，作者采用小片段R N A s 干扰技术( s m a l li n t e r f e t i n gR N A ，s i R N A ) 特异性沉默c d k 5 基因的表达，观察 c d k 5 活性抑制对n p c 。一小鼠神经系统病变的影响。 基金项目：国家自然科学基金项目( 3 0 6 7 0 7 3 7 ，3 0 4 0 0 1 4 1 ) ，武汉市青年 科技晨光项目( 2 0 0 5 5 0 0 3 0 5 9 ) 作者单位：4 3 0 0 3 0武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院 神经内科 通讯作者：张曼 材料与方法 6 5 5 1 动物与分组 杂合型n p cm 1 “B a l b c 而“小鼠( n p e “一) 购自美国 J a c k s o nL a b o r a t o r y 。子鼠出生后第3 周用P C R 技术鉴 定基因型H 1 。留取纯合型子鼠( n p e 一) 供研究，并 随机分为三组：非手术组( 下称空白组) ，r A A V 2 一G F P 注射组( 下称对照病毒组) 和r A A V 2 ·c d k 5 ·s i R N A G F P 注射组( 下称实验病毒组) ，每组6 1 0 只，雌雄比例 为1 ：1 。 2 重组腺相关病毒 r A A V c d k 5 一s i R N A - G F P 和r A A V 2 - G F P 来源于我 们的前期研究成果“ 1 ，由北京本元正阳公司具体包 装。 万方数据 6 5 6 3 抗体 S M l 31 抗体购自S t e r n b e r g e rM o n o c l o n a l s ，I n c 公 司，稀释度1 ：5 0 0 ，生物素偶联的二抗( 1 ：5 0 0 ) 及辣 根过氧化物酶记的链亲和素抗生物素蛋白( 1 ：5 0 0 ) 购自U P s t a t e 公司。 4 成像系统 B X 4 0F 4 显微镜和D P I O 数码相机购自O l y m p u s 公司。 5 侧脑室注射 r A A V ( 滴度1 ×1 0 1 2p f u ) 对出生后3 天的小鼠进 行双侧侧脑室缓慢注射，每侧2 u l 。 6 免疫组织化学染色 注射8 周后处死小鼠，冰上迅速取脑后沿正中矢 状线切开，右侧放入8 0 。C 冰箱保存作生物化学分析 用；左侧O T C 胶充分包裹后置于- 8 0 。C 异戊烷3 分钟， 切成l O p 。m 厚的冰冻切片，A B C 法完成S M l 3 1 染色， D A B ( 3 ，3 7 D i a m i n o b e n z i d i n e ，二氨基联苯胺) 显色，苏 木素复染。 7 动物体重及行为学测定 本观察采用盲法，由对手术分组不知情的人员完 成。自4 周起每周称体重一次直至第8 周处死。在称 重的同时用衣架悬挂试验评定小鼠肢体的运动能力。 具体做法如下：将小鼠放在离实验台2 0 厘米的衣架 上，记录小鼠悬挂的时间( h a n g i n gt i m e ) 并评分，评分 标准如下1 ： 悬挂方式评分 1 爪1 2 爪2 3 爪3 4 爪 4 4 爪+ 尾或4 爪平衡正立 5 4 爪+ 尾，移动到横梁末端 6 4 爪+ 尾，爬到衣架斜边 7 4 爪+ 尾，爬到衣架顶端 8 观察两分钟，不到两分钟以具体时间记录，以评分 和时间的乘积进行统计分析。 8 轴突球状体和存活浦肯野细胞计数 S M l 3 1 免疫组化染色后收集n p e 。一小鼠脑内2 个 不同区域( 图3 a ) 的图像供分析，计数由2 名对分组不 知情的人员分别完成，取其平均数供统计学分析；浦肯 野细胞计数在H E 染色的切片上完成，选取每一切片 上同一个小脑脑叶供计数分析。 9 统计学处理 采用t 检验，每组6 1 0 只( 雌：雄= 1 ：1 ) ， 堕皇韭丝瘗痘盘查! ! ! ! 生笙! ! 鲞箜! 塑 P 0 0 5 ) 。 讨论 6 5 7 本研究表明：将携带c d k 5 特异性小干扰R N A ( c d k 5 - s i R N A ) 的重组腺相关病毒r A A V c d k 5 一s i R N A G F P ，注射人出生三天的n p c 。一小鼠双侧侧脑室，对 n p c 。一小鼠的神经元有较为明显的保护作用。在前期 研究中，作者对四周龄n p c “一小鼠进行双侧小脑重组 腺相关病毒r A A V c d k 5 - s i R N A G F P 注射，能明显减轻 小鼠小脑的病理损害，改善小鼠运动功能，说明c d k 5 的异常激活在n p c 。一小鼠神经元细胞骨架损伤和变 性中起着重要作用。 C d k 5 是一种广泛表达于哺乳动物组织的细胞周 期依赖性蛋白激酶，由于c d k 5 的主要调节蛋白P 3 5 只 在脑内表达，故c d k 5 的相关蛋白激酶活性主要集中在 脑内。P 3 5 的产物P 2 5 与c d k 5 形成复合物后发挥激 活作用。研究显示在神经变性疾病中，神经元变性与 c d k 5 活性异常增高密切相关。B u 等刊发现：n p c 。一 小鼠最早在四周时出现t a u 蛋白的过度磷酸化，并且 与c d k 5 活性升高密切相关；P 2 5 c d k 5 与过度磷酸化 的细胞骨架蛋白共存于轴突球状体中。Z h a n g 等¨o 使 用泛c d k s 抑制剂r o s c o v i t i n e 和o l o m o u c i n e ，通过微渗 透泵对n p c 。一小鼠实行侧脑室持续灌注后，发现抑制 c d k s 活性能明显减少神经元细胞骨架蛋白的磷酸化 和A S 形成，促进浦肯野细胞的存活，并改善小鼠的运 动功能。本研究中，作者采用s i R N A 技术，在n p c 。一 小鼠未出现任何病理变化之前( 生后三天) ，对c d k 5 进行特异性基因沉默，以此来考察c d k 5 在n p c “一小 鼠神经元变性中的作用。结果显示：抑制c d k 5 活性减 少了轴突球状体的数目，延缓了浦肯野细胞的死亡，改 善了n p c 。一小鼠的运动功能，结合前期研究中，在 n p c “一小鼠四周时进行c d k 5 特异性基因沉默所获得 的阳性结果结果：小鼠脑部病变数目减少，浦肯野细胞 存活数目增加，运动功能改善；我们推测：在n p c 。一小 鼠生后四周内进行c d k 5 的特异性抑制可获得保护效 果。 值得注意的是：近来有学者报道1 ，在n p c 。一， P 3 5 “一小鼠即敲除P 3 5 基因的n p c “一小鼠，c d k 5 的活 性减少7 8 ，但t a u 蛋白的过度磷酸化与轴突球状体 的形成没有随之减少，同时小鼠的体重减轻和运动能 力也未得到改善。他们由此得出结论：P 2 5 c d k 5 与 n p c 。一小鼠的神经元变性无关。目前，n p c 。一小鼠神 经元变性的机制尚未明了，但c d k 5 在神经元变性中的 作用已被大量的体内体外实验所证实，作者特异性沉 默c d k 5 的研究结果更是为此增加了新的有力证据。 万方数据 6 5 8 出现这种不相一致的研究结果，我们认为主要有如下 原因：敲除P 3 5 基因的n p c “一小鼠不能完全模拟 n p c 。一小鼠c d k 5 被抑制时的病理变化。正常情况下， P 2 5 c d k 5 具有广泛的生理作用H 。，如：通过对t a u 蛋白 的磷酸化调控来限定神经元的极性；参与神经元的迁 移，在神经系统的发育和再生中起作用等。敲除p 3 5 基因的n p e “+ 小鼠残留的c d k 5 重新向神经元突起的 远端分布¨，说明：n p c “一，P 3 5 。一小鼠的生理结构 已经发生变化，这种小鼠体内同时具有n p c “一和 P 3 5 。一所产生的两种病理表型，以此来研究c d k 5 在 N P C 神经系统病变中的作用完全可能出现与既往研 究不一致的结果。作者在研究中发现：抑制c d k 5 P 2 5 的活性并不能最终阻止浦肯野细胞的死亡，也未能完 全消除n p c “一小鼠的神经病理改变及使其寿命正常 化，表明还存在其他机制参与了n p c “一小鼠的神经细 胞损伤和神经元变性。 N P C 患者海马等脑区的N F T 或A S 内聚集了大量 高度磷酸化的细胞骨架蛋白，这些蛋白的磷酸化都发 生在c d k 5 、c d c 2 和c d k 4 的作用位点上，这些表达增高 的c d k s 和高度磷酸化的细胞骨架蛋白共存于病理结 构内，并且两者呈正相关“ o ，提示c d k 5 、c d c 2 和e d k 4 都参与了n p c “一小鼠病理损伤过程，结合本研究以及 前期研究成果，作者初步证明c d k 5 在n p c “一小鼠神 经元变性中起到了至关重要的作用。e d c 2 、e d k 4 在此 过程中分别扮演了何种角色以及c d k 5 、c d c 2 、c d k 4 三 者之间有什么联系，都是值得进一步探讨的问题，相信 n p c 。一小鼠神经元变性机制的阐明，必将给N P C 乃至 整个神经系统变性病的治疗带来令人鼓舞的前景。 参考文献 1 N o b l eW ，O l mV ，T a k a t aK ，e ta 1 C d k 5i saf a c t o ri nt a ua g g r e g a t i o n a n dt a n g l ef o r m a t i o ni nv i v o N e u r o n ，2 0 0 3 ，3 8 ：5 5 5 - 5 6 5 2A l v a r e zA ，M u n o zJ P ，M a c e i o n iR B AC d k 5 一p 3 5s t a b l ec o m p l e xi si n · v o l v e di nt h eb e t a ·a m y l o i d - i n d u c e dd e r e g u l a t i o no fC d k 5a c t i v i t yi nh i p · p o c a m p a ln e u r o n s E x pC e l lR e s2 0 0 1 ，2 6 4 ：2 6 6 - 2 7 4 3O t t hC ，C o n c h a1 I ，A r e n d t T ，e ta 1 A b e t a P Pi n d u c e sc d k 5 一d e p e n d e n t t a uh y p e r p h o s p h o r y l a t i o ni nt r a n s g e n i cm i c eT 9 2 5 7 6 JA l z h e i m e mD i s 2 0 0 2 ，4 ：4 1 7 - 4 3 0 4 L o f i u sS K ，M o r r i sJ A ，C a r s t e aE D ，e ta 1 M u r i n em o d e lo fN i e m a n n P i c kCd i s e a s e ：m u t a t i o ni nac h o l e s t e r o lh o m e o s t a s i sg e n e S c i e n c e ， 1 9 9 7 ，2 7 7 ：2 3 2 - 2 3 5 5 丁志刚，张曼，等利用H e l p e rF r e e 系统构建c d k 5s i R N A 腺相关病毒 载体并鉴定卒中与神经疾病，2 0 0 6 ，1 3 ：6 7 - 7 0 6H a l l o w sJ L ，l o s i fR E ，B i a s e l lR D ，V i n c e n tI p 3 5 p 2 5I sN o tE s s e n t i a l F o rT a u a n dC y t o s k e l e t a lP a t h o l o g yo rN e u r o n a lL o s si nN i e m a n n - P i c k T y p eCD i s e a s e JN e u r o s c i ，2 0 0 6 ，2 6 ：2 7 3 8 - 2 7 4 4 7B uB ，K l u n e m a n nH ，S u z u k iK 。e ta 1 N i e m a n nP i c kd i s e a s et y p eC y i e l d s p o s s i b l ec l u ef o rw h yc e r e b e l l a rneuronsd on o tf o r mn e u r o f i ·- b r i l - - l a r yt a n g l e s N e u r o b i o lD i s ，2 0 0 2 ，11 ：2 8 5 - 2 9 5 8 Z h a n gM ，L iJ ，C h a k r a b a r t yP ，e t a 1 C y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i - t o r sa t t e n u a t ep r o t e i n h y p e r p h o s p h o r y l a t i o n ，c y t o s k c l e t a ll e s i o n f o r m a - t i o n a n dm o t o rd e f e c t si nN i e m a n n P i c kt y p eCM i c e A m e r i c a nJP a - t h o l o g y ，2 0 0 4 ，1 6 5 ：8 4 3 - 8 5 3 9 H a l l o w s 儿，C h e nK ，D e P i n h oR A ，V i n c e n tI D e c r e a s e dc y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e5 ( c d k 5 ) a c t i v i t yi sa c c o m p a n i e db yr e d i s t r i b u t i o no f c d k 5 a n dc y t o s k e l e t a l p r o t e i n sa n di n c r e a s e dc y t o s k e l e t a lp r o t e i np h o s p h o r y l a t i o ni np 3 5 n u l lm i c e JN e u r o s c i ，2 0 0 3 ，2 3 ：1 0 6 3 3 - 1 0 6 4 4 ( 2 0 0 8 0 4 2 0收稿) 本刊电话：( 0 3 11 ) 6 6 0 0 2 4 5 1 本刊传真：( 0 3 11 ) 6 6 0 0 2 4 5 1 本刊E - m a i l ：n y s j j b z z V I P 16 3 c o m 万方数据